大豆生育期基因J及其编码蛋白.pdf

大豆生育期基因J及其编码蛋白，它涉及大豆生育期基因J及其编码蛋白。本发明的目的是提供大豆生育期基因J及其编码蛋白。本发明大豆生育期基因J的基因序列如序列表Seq ID No：1所示。本发明大豆生育期基因J的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。本发明通过大豆遗传转化验证，表明J基因抑制大豆生育期的生理功能。本发明应用于大豆基因工程领域。

权利要求书
1.  大豆生育期基因J，其特征在于大豆生育期基因J的基因序列如序列表Seq ID No：1所示。

2.  如权利要求1所述的大豆生育期基因J的编码蛋白，其特征在于大豆生育期基因J的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

说明书大豆生育期基因J及其编码蛋白
技术领域
本发明涉及大豆生育期基因J及其编码蛋白。
背景技术
大豆为人类提供重要的植物蛋白质和油份。在世界范围内，北至高纬度的北欧瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等广泛区域内均有大豆栽培，但单个品种或种质资源一般适宜种植的纬度跨度较小。长青春期性状，即短日照条件下生育期延长，对于大豆品种适应范围向低纬度的延伸起重要的作用，而且对于为热带国家大豆的栽培管理方式提供了理论依据。
Kiihl在1979年的实验中发现，三个隐性基因决定了大豆在短日照条件下晚花的性状。在巴西，长青春期性状对于大豆生产向北延伸有积极地意义。所以巴西对于长青春期性状做了广泛的研究。巴西的研究认为五个基因控制了长青春期性状，且至少有两个基因必须是隐性基因。但是，目前关于大豆长青春期性状基因的研究仅此而已，所以本试验针对这个分子研究空缺，设计了一个F2代杂交群体，利用分子标记技术，找到与长青春期有关的QTL，并成功的找到相关联的基因。此发明对于大豆品种的广泛适应性有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供大豆生育期基因J及其编码蛋白。
本发明的大豆生育期基因J的基因序列如序列表Seq ID No：1所示。
本发明的大豆生育期基因J的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。
本发明的有益效果：
本发明是在遗传数量性状研究的基础上，利用分子手段首次成功地克隆出生育期基因J。
本发明利用大豆品种BR121和Harosory杂交后代所产生127个F2代群体，通过MQM遗传定位方法检测到在LJ-SSR标记附近存在一个大豆生育期的QTL。把LJ-SSR标记附近的基因与拟南芥生育期基因进行比对，成功的找到了唯一的与拟南芥生育期有关的基因，即J基因，并对此基因进行了克隆。本发明获得的J基因编码区全长序列(Seq ID No：1)与phytozome(http://www.phytozome.net)中公布的Glyma.04G050200.1(大豆基因组Glyma1.0版本的基因诠释)相对应，但是其序列并不完全一致，本发明获得的J基因翻译的蛋白质具有714氨基酸(Seq ID No：2)。通过转基因，验证了J基因具有强烈抑制大豆生育期的 生理功能。
同时，通过同源比对，发现J基因与拟南芥ELF3家族具有很高的同源性。
附图说明
图1为pTF10I-J质粒过表达载体结构示意图；
图2为Williams 82转入J基因和未转入J基因大豆的成熟期时间图；其中，W82为Williams82未转入J基因的大豆，35S：J为Williams 82转入J基因后的大豆。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的大豆生育期基因J基因序列如序列表Seq ID No：1所示。
本实施方式对Harosory和BR121杂交产生的F2代群体进行研究，并确定了J基因，其与大豆生育期关系密切。
本实施方式通过大豆遗传转化手段，将J基因在大豆中表达，验证了本发明的J基因与能够显著的延长大豆的成熟期。
具体实施方式二：本实施方式的大豆生育期基因J的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。
通过以下试验验证本发明的效果：
(1)大豆生育期J基因的获得
一、在2014年，将BR121和Harosory杂交后代产生的127个F2代个体在中国科学院东北地理与农业生态研究所人工气候室内种植，并检测生育期。
二、利用已经构建的4号染色体遗传图谱，结合检测的成熟期数据，进行遗传数量性状定位。初步遗传定位只发现一个主效QTL,即LJ_SSR，与大豆生育期密切相关。
三、通过与拟南芥生育期基因聚类分析比较，发现唯一一个与拟南芥生育期有关的基因，即J基因。
四、以大豆品种Harosory的叶片为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA。
五、采用DNaseⅠ处理步骤四提取的总RNA。
六、取1μg步骤五处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BD Biosciences Clontech公司的BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA。
七、以获得的cDNA为模板通过F1与R1引物扩增J基因，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min 30s，共35循环，再72℃延伸 5min，将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序；
其中，引物F1的序列为5'CTTCCGTAAC TCGTCACTCA 3'；引物R1的序列为5'ACTCTTTCGG GTAAAGCAAT 3'。
测序结果表明大豆生育期基因J具有序列表中Seq ID No：1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No：1由2145个核苷酸组成，并编码具有序列表中Seq ID No：2的氨基酸序列的蛋白质。
(2)大豆生育期基因J的功能验证
一、以大豆品种Harosory的叶片为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA；
二、采用DNaseⅠ处理步骤一提取的总RNA；
三、取1μg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BD Biosciences Clontech公司的BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA；
四、分别以J基因F2与R2为引物，对步骤三获得的cDNA通过PCR进行扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共35循环，再72℃延伸5min，获得含有XbaI-SacI双酶酶切位点的大豆生育期基因J；
五、将获得的含有酶切位点的大豆生育期基因J克隆到pTF101质粒中，获得pTF101-J质粒，以Willimas 82为材料，利用农杆菌介导法进行遗传转化，获得转J基因大豆，将转J基因大豆和Willimas 82在12小时光照和12小时黑暗条件下种植，观察它们的生育期；
其中，引物F2的序列为5'GCTCTAGAGA TGAAGAGAGG GAAGGATGA 3'；引物R2的序列为5'CGAGCTCGCT ACACTGAGTC ATTCTGTT 3'。
步骤五获得的pTF101-J质粒过表达载体结构示意图如图1所示；
Williams 82转入J基因和未转入J基因大豆的成熟期时间图如图2所示；其中，W82为Williams 82未转入J基因的大豆，35S：J为Williams 82转入J基因后的大豆；从图2可以看出，W82的生育期为92天，35S：J的生育期为105天，表明转入J基因后的大豆成熟期比Willimas 82的成熟期晚13天，从而说明J基因具有延长大豆成熟期的功能。