香料活性肽 【发明领域】
本发明涉及可从可可豆获得、并且在与还原糖进行梅拉德反应(mailard reaction)后独特鲜明风味的特殊肽。具体地，本发明涉及所述特殊肽在制备巧克力香料，特别地是可可香料和焦糖香料，花香料(floralflavour)或者具体地，糖果香料，面包香料，烘焙香料以及肉香料中的用途。
背景技术
典型的可可香料在可可豆加工期间(包括发酵、干燥以及烘焙)释发出来。
在发酵期间，可可种子蛋白通过微生物和酶促加工降解，主要产生亲水肽和疏水氨基酸，它们为独特巧克力香料的香料前体。所涉及的可可蛋白水解系统是非常有效的。可可的内源型蛋白水解活性由内源蛋白酶，氨肽酶和羧肽酶代表，它们协同地具有将完整蛋白水解为单个氨基酸和不同长度的寡肽的能力。
在烘焙期间发生多种化学反应，特别是梅拉德型反应和热降解反应(脱羧、脱氨、氧化等)。涉及肽、氨基酸和还原糖的梅拉德反应产生被认为最终有助于最后的可可/巧克力香料的化合物。
不久前，有越来越多的证据被提出，那就是肽的大小及其氨基酸成分/序列在香料形成方面扮演着重要角色。研究了未烘焙和烘焙的发酵可可的氨基酸库，并发现某些疏水氨基酸牵涉到可可香料的产生(Seilki，Rev.Int.Choc.28(1973)38-42)。
然而，由于游离氨基酸和多酚等的存在，鉴定可可豆中天然存在的肽相当困难。结果，迄今为止，本领域对存在于可可肽库中的短链肽的性质知之甚少。
已经作出几种尝试来人工制备可可香料。这样的一种尝试包括使由未发酵地成熟可可豆所制备的丙酮干粉在pH 5.2条件下自溶(autolysis)，接着在还原糖的存在下烘焙(Voigt等，Food Chem.49(1994)，173-180)。Mohr等在Fette Seifen Anstriche 73(1971)515-521页中报道了有关表现出形成巧克力香料潜力的肽级分的分离。而且，Voigt等在Food Chem.51(1994)7-14、177-184以及197-205页的几篇文章中报道了有关利用纯化的贮藏蛋白和内源可可蛋白水解系统对香料前体的肽富集库的制备，所述前体在与还原糖热反应时产生巧克力样香料。
还已经知晓果糖/葡萄糖以及疏水氨基酸的混合物在低水活性介质，如甘油或丙二醇等中热反应，能引起巧克力样的香气。利用这类反应香料作为基础，并组合某些上等料，最优的是香草，则能够制备巧克力样香料浓缩物。不过，由于这些反应物复杂的性质，难以获得纯净和均衡的巧克力香料浓缩品，此外还为提供恒定品质造成了问题。
与巧克力的加工反应香料的发展相应，Schnermann等在“通过香气提取物稀释分析对牛奶巧克力和可可块中主要有味物质的评价”(“Evaluation of key odorants in milk chocolate and cocoa mass by aromaextract dilution analyses”)(J.Agric.Food Chem.45，(1997)，867-872)中报道了来自可可或巧克力产品的挥发性化合物的鉴定和特征。挥发性图谱研究的总目标是“合成”一种具有高度弹性的强烈人工巧克力香气，以便定制巧克力或巧克力产品的香味类型。不过，迄今为止重建巧克力香气的尝试尚未成功。虽然获得的合成混合物令人联想到巧克力，但它们缺乏典型巧克力香料的浓郁品质(body)和强度。
目前，现有的人工巧克力香料缺乏期望的巧克力香气强度和适当的浓郁品质。
因此，本发明的技术问题在于提供允许人工制备巧克力香料的手段，此香料优选应当具有典型巧克力香气的所有组成以及适当的浓郁品质。
发明简述
在通往本发明的深入研究过程中，现在已令人惊讶地认识到可可豆中含有许多种不同的、能引起未曾预期存在于可可豆中的味道的肽。因而在本发明的第一方面涉及所有可来自可可豆、并且可通过使选自Arg-Phe、Ala-Glu、Glu-Ala、Val-Ala、Phe-Glu、Thr-Leu、Tyr-Val、Val-Tyr、Pro-Val、Asp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Phe-Ala、Ala-Phe、Tyr-Ala、Ala-Tyr、Lys-Glu、Lys-Phe、Val-Lys、Val-Phe、Leu-Leu、Met-Tyr的肽与还原糖进行梅拉德反应获得的香料活性化合物。
根据优选的实施方式，本发明提供了可通过使选自Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe、Ala-Asp、Val-Phe、Val-Lys、Leu-Leu或Val-Tyr的肽与还原糖进行梅拉德反应获得的化合物，该化合物将产生由可可和/或焦糖香气组成的巧克力香料。
根据可选的实施方式，所述肽选自Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe或Ala-Asp，已发现它们尤其可以产生优质的香气和适宜的浓郁品质。根据优选的实施方式，所述肽为Val-Tyr、Tyr-Val或Leu-Leu，它们可以产生最好的可可香料。
根据可选的实施方式，所述肽选自Val-Phe或Val-Lys，它们可以产生焦糖香料。
而根据另一个实施方式，进行梅拉德反应的肽是Met-Thr，已发现它可以产生优质而强烈的肉香料。
至于待与上文所列的肽反应的还原糖，可以利用例如果糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖。糖和肽优选在非水性溶剂，例如甘油、丙二醇、低水活性含水系统、乙醇、脂肪中，在提高的温度，以及允许糖结合于所述肽的条件下进行反应。
根据另一个实施方式，提供了制备期望的香料，特别是巧克力香料、可可香料、焦糖或饼干或肉香料的工艺，其包括使选自Arg-Phe、Ala-Glu、Glu-Ala、Val-Ala、Phe-Glu、Thr-Leu、Tyr-Val、Val-Tyr、Pro-Val、Asp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Phe-Ala、Ala-Phe、Tyr-Ala、Ala-Tyr、Lys-Glu、Lys-Phe、Val-Lys、Val-Phe、Leu-Leu、Met-Tyr的一种或多种肽与还原糖进行梅拉德反应。
从梅拉德反应获得的化合物，或者一般地所列的肽，可用来制备期望该化合物所提供的香气的任何产品，例如食品、化妆品或药品。
食品的例子有乳制品，任何类型的奶制品，例如，举例来说，奶、酸奶、布丁、冰淇淋或糖食，例如巧克力。同样，一般的婴儿食品，或者甚至是宠物食品也可以用本发明的香料化合物加香。特别地，通过将本发明的化合物添加到宠物食品中增加其肉味，能够提高动物对任何宠物食品的接受度。
【附图说明】
图1显示了发酵5日的可可豆CNP提取物的RP-HPLC/ESI-MS的UV和总离子流图谱；
图2显示了MS/MS分析中FMOC衍生肽的断裂模式；
图3显示了不同发酵阶段二肽的定量分析。
发明详述
在通往本发明的研究中，本发明人设计了从可可豆天然肽库中分离和检测肽的新的方法，该方法迄今为止还未被充分地认识到其可行性。
通过电喷射离子化(electrospray ionization，ESI)质谱测量法联合利用色谱条件以及使用三氟乙酸/乙腈(TFA/ACN)溶剂系统的RP-HPLC，对可可豆肉粉(CNP)提取物进行分析，结果由于大多数离子相对低的丰度(1-6×104)，仅检测到极少的物质。这被认为是由“裸露”游离氨基酸和短链肽较差的离子化造成的。上柱前用FMOC进行衍生，接着对CNP提取物进行LC/MS分析，结果检测到数目众多的峰(图1)。发明人阐明了所有存在的一系列单一同位素离子，并根据已知的氨基酸保留时间和分子离子质量，绘制了潜在肽的质量列表(表1)。全部未知质量在减去由FMOC部分引起的质量单位222之后，表现出与多达5个残基的合成肽数据库的阳性匹配。
表1：LC/MSa对CNP提取物中可疑肽质量的鉴定
保留时间(min) 分子离子质量[M+H]+
13.50-19.2 551.1，625.3，840.4
19.33-19.5 510.3，707.2
19.5-22.0 516.2
22.18-22.38 631.1
22.4-22.57 326，544.4，755.8
22.9-23.24 441.1，512.0
24.13-24.34 706.5，526.0，403.8，801.0
24.4-26.5 411，455.1
26.61-26.81 503.0，517.1
27.24-27.62 437.1
28.14-30.5 425，498.1，459
31.6-31.96 427.0，487.1，876.4
32.43-33.29 353.9，387.9，453.0，572.3
33.5-34.99 467.1，501，735.1
35.1-36.88 535，850.1
37.98-38.49 749.1，791.1，678.1
39.41-39.85 720.2，883.1
40.22-40.71 692.1，697.2
41.33-42.01 759.1，800.2
45.59-46.06 690.2
48.59-49.08 738.2
a，来自图1。在ms/ms分析中，粗体质量表明了来自FMOC部分的典型分子离子m/z 179的存在。
表2：串联MS/MS对肽的鉴定和特征描述
保留时间(min) 分子离子[M+1]+ 肽质量 肽序列
14 840.4 617.4 RGTVVS
19 625.3 402.3 IRD
19.6 510.3 287.3 IR
20.49 516.2 293.2 KF
22.5 544.4 321.4 RF或FR
22.8 441.1 218.1 EA
25.3 411 188 AV
25.25 517.1 294.1 EF或FE
24.7 455.1，437.0b 232.1 IT或LT
25.3 503.1 280.1 YV或VY
26.1 437.1 214.1 VP
27.1 425 202 AD
28.49 498.1 275.1 WA或AW
29.7 459 236 AF
31.7 876.4 653.4 EEETF
32 487.1 264.1 VF或FV
33.5 467.1 244.1 LL，LY或YL
35 501 278 FL
36 535 312 MY
40 697.2 253.2 AY
40 720.2 497.2 EK
43 690.2 467.2 KV
46 738.2 515.2 FK
b，分子离子减去水分子。
为确定肽的氨基酸序列进行了衍生肽的碰撞诱导断裂。人工分析了每个肽的断裂模式。正如所指出的那样，氨基酸和肽的FMOC衍化引入了附加质量222。在MS/MS过程中，所观察到的衍生肽的主要断裂如下：与FMOC芳香部分的丢失相应的单一同位素离子m/z 179.2±0.1(参见图3)。m/z 179的丢失产生了肽质量加上与FMOC O-C＝O部分相应的44的离子(图3)。所观察到的其它断裂是C-末端氨基酸的丢失，产生与N-末端氨基酸加上44质量单位相应的分子离子，揭示了肽序列的身份。另外，同时发生的44质量单位的丢失产生了肽的分子离子。对于因为Lys或Tyr残基的存在而携带附加FMOC部分的肽而言，进行了类似的断裂模式的观察。
利用上述策略确定短链肽的N-末端和C-末端氨基酸，导致23个肽的鉴定：20个二肽，1个三肽，1个五肽，和1个六肽。然而在由同量异序氨基酸，例如由Gln和Lys或者Ile和Leu组成的二肽的情况下，不能够实现N-或C-末端氨基酸清楚的鉴定。
对发酵周期过程中每个鉴定肽的命运进行作图。数据显示于图3。正如预期的那样，没有任何一个肽存在于未发酵的豆中。不过，多数鉴定的肽能够在1天的发酵豆中检测得到。对发酵豆(1-7天)中肽的定量分析显示，对于一组肽(A组)，它们的浓度在发酵3-5天之间达到一个平台，接着其浓度出现小而明显的下降。而对于另一组肽(B组)，在发酵3-5天之间达到最高浓度之后再不表现出变化。C组肽在发酵1-2天内达到最高浓度，而在延长的发酵期间没有进一步的变化。这些数据证明鉴定的肽随着可可豆的发酵独特地出现。
在可可贮藏蛋白序列数据库(2S和21-kDa白蛋白，以及10-、14-、37-、41-kDa豌豆球蛋白(vicillin)多肽)中对所鉴定肽的氨基酸序列进行计算机查找，显示了与每一种肽100％的匹配。数据明白无误地证明所有鉴定的肽均是可可来源的，并来自于贮藏蛋白的降解。
为评估鉴定的可可二肽及以上鉴定的化合物的合成类似物的巧克力香料潜力，研究了总计36个二肽(表3)。为弄明白以肽为基础的梅拉德反应，每个肽的N-末端氨基酸与其C-末端氨基酸互换。所有肽在加工反应中进行了测试。
最初通过在多个不同时间嗅闻来评估所有的样品。数据显示于表3。选择一组11个肽样品进行大规模嗅觉评估。基于嗅觉评估，二肽Val-Tyr和Tyr-Val清晰地表现出均衡的巧克力香气。令人惊讶地，来自Tyr-Val的巧克力香气与Val-Tyr相比更强烈。
表3：基于肽的反应香料的香气特征的评估
肽 香气属性 肽 香气属性
IR 香辛味，杂味 AF 焦糖味，水果味
RI 香辛味，杂味 YA 焦糖味，杂味
KF 杂味 AY 巧克力味
面包味，坚果味，烘焙
FR 杂味 KE
味，巧克力味
RF 焦糖味，面包味 EK 杂味
AE 淡焦糖味 KF 强焦糖味
EA 淡焦糖味 VK 焦糖味
AV 杂味 KV 杂味
VA 焦糖味，杂味 FV 杂味
FE 焦糖味，杂味 VF 焦糖味
TL 杂味，肉味 LL 水果味，可可味，花味
YV 均衡巧克力味 LY 杂味
VY 巧克力味，轻微杂味 YL 杂味
PV 烘焙味，面包味 LF 杂味
VP 杂味 FL 杂味
DA 杂味，焦糖味 MY 强烈肉味
AD 饼干味，焦糖味 YM NCA
WA 焦糖味，香辛味，杂味 FK NCA
AD 饼干味，焦糖味 EF NCA
WA 焦糖味，香辛味，杂味 LT NCA
AW 杂味 IT NCA
FA 焦糖味，杂味 TI NCA
基于肽的加工反应释放的香气类型，最被看好的肽填充了灰颜色。
下列实施例举例说明本发明，而并非将其限制于此。
实施例1
80kg成堆的优质西非Amelonado可可豆以香蕉叶覆盖在象牙海岸的Abengoorou Idefor农场发酵。在7天的发酵周期过程中以1天的间隔取样，阳光下干燥，人工脱皮，并船运至NRC/洛桑。可可豆被保存于-20℃。
合成肽获自于Bachem。HPLC级乙腈、甲醇和水来自Merck。三氟乙酸、三乙胺和fluoroscamine来自Fluka。
可溶性肽提取物的制备
使干燥的可可豆通过豆轧碎机(Brook Crampon)，接着通过风选机(John Gordon)以除去豆壳。将豆肉于-20℃保存在棕色瓶中。将可可豆肉(20-30g)在普通磨机中(IKA，M-20)碾磨数秒。使豆肉粉通过0.8-mm的筛子，并于4℃保存(NRC参考文献14C181-0至14C18-7)。
将可可豆肉粉(1g)悬浮于10ml提取溶剂(30％(v/v)甲醇/0.1％(v/v)TFA)中。使悬液在最大速度经受1分钟匀浆处理(Polytron，Kinematica AG)，并在4℃以15,000rpm离心15分钟。小心取出清亮上清，通过0.22μm滤片并冻干。干粉溶于5％AcA，通过0.22μm滤片并以小份保存于-20℃。
FMOC衍化
将可溶性肽提取物(50-100μl)或者合成肽及氨基酸溶液(10-40nmol/100μl)与400μl硼酸盐缓冲液(0.1M，pH 10.4)混合。溶液与FMOC试剂(500μl，5.8mM溶于丙酮中)(Einarsson等，J.Chromatogr.66(1983)，3688-3695)剧烈混合。混合物用2ml戊烷-乙酸乙酯(80∶20)萃取2次。含有FMOC衍生物的水相通过RP-HPLC联合ESI质谱仪进行分析。
LC-MS分析
质量测量和肽断裂利用FinniganMat离子陷阱LCQ质谱仪联合光谱HPLC系统(FinniganMat)进行。该系统的组成为：quaternary pump(TSPP4000)、自动注射器(TSP AS3000)和UV/VIS检测器(型号UVIS 205，来自Linear Instruments)，配备有高压不锈钢流动池(flow cell)(体积1.6μl，路径长度2mm)。LC流被引导至LCQ质谱仪，而不用分流器。典型地利用如下条件：毛细管温度200℃，套气流70；辅助气流10；电源电压5kV。其它参数如制造商所建议的在校准/调整操作中自动调节。对于多数强离子的MS/MS分析，碰撞诱导的离解能被设置在35％。多数强离子的质量选择和取舍窗口为1质量单位。
未衍化样品利用RP C18柱(Nucleosil 100-3 C18 HD；3μm，2×150mm，Macherey-Nagel)与线性梯度增长的溶剂B(0.05％TFA/80％ACN(v/v)于水中)在溶剂A(0.045％TFA(v/v)于水中)中分析如下：在0％B中等度洗脱10分钟，0-25％B中25分钟，25-50％B中10分钟，50-100％B中5分钟，接着在100％B中等度洗脱5分钟。流速为0.2ml/分，并在215nm处检测。FMOC-衍生物在同一个柱子上利用线性梯度分离：0-35％B5分钟，35-100％B 65分钟，以及100％B中等度洗脱5分钟。流速为0.2ml/分，并在260nm处完成检测。
肽反应模式
将预先确定的二肽(305mg)和D-果糖(75mg)混合物添加到50ml有盖Schott瓶中的预热(120℃)丙二醇中。用0.01N NaOH(75μl)将反应液的pH调至pH 7.5到8.5。在磁力搅拌器上搅拌反应混合物。反应混合物被加热达60分钟，冷却至室温并于4℃贮存。
感官评定
为初步筛选，小组成员评估并描述加工反应物的香气特征。在任何给定的时间通过嗅闻最多评估6个反应样品。这个过程用随机混合的样品集合重复3次，以便获得更高的可信度和更可靠的感官数据。对于大多数看好的侯选物，受训感官评审小组进行额外的特征描绘。总计17个接受面包屑和/或巧克力评估训练的小组成员参与了香气嗅闻测试。测试分别单独进行(1次1人)，并且数天后重复评估。小组成员不知道相同的香气评估两次的事实。基于肽的反应香料嗅闻瓶在测试前1天制备：将纸条浸在反应香料中，以便大约1cm的纸被弄湿。然后温和晃动，切成大约5cm长，并置于20-ml带盖玻璃广口瓶中。广口瓶用3位数字代码编码，并以随机顺序放置在托盘上。在开始运作前，小组成员嗅闻商业焦糖、黑巧克力、可可和饼干香料作为参照。在液体和巧克力辨味的情况下，小组成员按1-9的等级评定不同属性。辨味会用改变的样品代码重复3次。在所有测试的二肽中，以下被认为具有优良的巧克力香气：Tyr-Val、Val-Tyr、Leu-Leu、Pro-Val、Val-Phe和Lys-Glu。