说明书以2-Cys Prx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法
技术领域
本发明涉及植物寄生线虫杀虫剂领域，具体涉及以2-Cys型过氧化物还原酶(Peroxiredoxins,Prx)即2-Cys Prx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法。
背景技术
植物寄生线虫是引起植物病害的重要病原物之一。在全球范围内，植物病原线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的演化而日益严重，已成为农业生物灾害中继昆虫、植物病害之后的第三大灾害。据报道，严重危害我国农、林、经济作物等的线虫达100多种。植物寄生线虫每年对全世界农作物的产量损失大约为1250亿美元。目前防治线虫的方法主要是通过栽培技术、作物轮作、抗性品种的选择，结合使用一些现在仍批准使用的化学杀线虫剂。
杀线虫剂是伴随着线虫危害的日益严重而诞生的，虽然这些化学药剂对线虫防治起到了积极作用，但我国现有防治线虫病害的药剂品种少，可供选择性不强，有关杀线虫剂的研究和开发，无论是理论研究和技术开发上，都还是农药领域中非常薄弱的部分，杀线虫的活性成分和作用机制方面研究较少。因为环境压力，植物寄生线虫的化学防治方法的发展受到严峻的挑战。开发新型、低毒、高效杀线虫剂势在必行。植物线虫抗氧化系统机制的深入研究为药物靶点的开发和利用提供了理论依据和新的切入点。
生物在有氧代谢过程中普遍产生活性氧(reactiveoxygen species,ROS)，为了抵抗ROS的损伤，生物在长期的进化过程中，形成了谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxudase,GPx)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物还原酶(peroxiredoxins,Prxs)等各种抗氧化系统。为及时清除过多的内源性活性氧族及其周围环境包括寄主产生的外源性ROS的损害，植物线虫体内同样也存在各种抗氧化系统，使之维持在一个正常的水平。例如，在植物病原物侵染寄主过程中，植物通过产生过氧化物来抵御病原物的入侵，线虫等病原物则通过分泌抗氧化酶来清除其毒害。
作为抗氧化酶家族中的一员，过氧化物还原酶基因广泛存在于原核生物和真核生物中。目前已发现的Prx功能除了保持ROS平衡，使机体免受DNA损伤，蛋白变性及脂类过氧化等伤害外，还参与细胞凋亡、增殖、分化、细胞内信号传递以及基因表达调控等多种生物功能。随着对Prxs研究的不断深入，将Prxs作为潜在的药物、疫苗或诊断靶标正受到越来越多的关注和研究。
近年来对Prxs应用的研究主要集中在药物、疫苗或诊断目标三个方面，其中以Prx作为抗原进行疫苗研制及Prx与肿瘤的关系方面研究较多。在以Prx作为抗原的研究中，国外更是已有相关专利的报道，如，马来丝虫(Brugia malayi)Prx6作为疫苗抗原已经申请美国专利(U.S.Patent 6,352,836)；杜氏利什曼原虫(L.donovani)Prx1a作为一种疫苗抗原候选物已经申请了美国专利(U.S.Patent 7795406)，而以Prx为靶标进行防治植物线虫药物研制的报道目前还比较少。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种用于以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点进行抗植物线虫侵染化合物筛选的重组表达质粒，该重组表达质粒为pET41b-DdPrx。
本发明同时提供一种以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法，该方法包括如下步骤：
a、构建含马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx基因的重组表达质粒pET41b-DdPrx；
b、将重组表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，通过IPTG诱导培养以稳定表达重组Dd-PRX蛋白；所述重组Dd-PRX蛋白为马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx与pET-41b融合蛋白。所述IPTG诱导培养条件为：温度18-37℃，IPTG浓度为0.2-1.4mmol/L。
c、将候选化合物与重组DdPrx蛋白共孵育，根据硫氰酸铁法检测候选化合物是否对重组DdPrx蛋白具有较高离体抑制活性。
所述共孵育是指将重组DdPrx蛋白加入含10μmol/L-40μmol/L候选化合物的反应缓冲液中，在30℃水浴条件下孵育30min，其中，该反应缓冲液为含10mmol/L DTT的1×PBS缓冲液，pH为7.0。
依本发明提供的筛选方法获得的对重组DdPrx蛋白具有较高的抑制活性的化合物为1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉，经验证，该化合物具有抗植物线虫侵染的活性，能抵抗植物线虫的侵染，能用于制备抗植物线虫侵染药物。
本发明还提供上述筛选方法在研发抗植物线虫侵染药物中的应用。
本发明的离体筛选方法是基于硫氰酸铁法设计，其原理在于Prx蛋白能够催化H2O2转化为H2O和O2，剩余的H2O2则将Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+再与硫氰酸根离子形成的红色络合物在A475处有最大吸光值从而测定微量H2O2的变化量。而2-Cys Prx抑制剂能明显降低重组DdPrx蛋白催化H2O2活性。用于2-Cys Prx抑制剂的筛选，具有直接、简便、快速等优点，既可用于手工筛选，又可用于大规模高通量抑制剂的筛选。且本发明验证用的活体筛选方法是基于水稻根结线虫具有侵染水稻根这一特性设计，候选化合物若具有抗线虫侵染的活性，则水稻根结线虫侵染水稻根产生的根结与对照相比将明显减少。此方法不需染色即可用肉眼观察，便于实时跟踪候选化合物抗线虫侵染的活性变化。
附图说明
图1为DdPrx阅读框克隆及酶切鉴定电泳结果图。
图中，M1：5000 marker，1：PCR产物，2：pET-41b经XhoI单酶切，3：pET41b-DdPrx经XhoI单酶切，4：pET41b-DdPrx经NcoI单酶切，5：pET41b-DdPrx经XhoI和NcoI双酶切，M2：15000 marker。
图2为诱导IPTG浓度及温度对重组DdPrx蛋白表达量的影响。
图中：M:即用型蛋白质分子量标准(低)；
A为不同IPTG浓度的重组DdPrx蛋白表达量。其中，1：IPTG浓度为1.4mmol/L，2：IPTG浓度为1.0mmol/L，3：IPTG浓度为0.6mmol/L，4：IPTG浓度为0.2mmol/L，5：IPTG浓度为0mmol/L；
B为18℃时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，1：有IPTG诱导的超声破菌的上清，2：有IPTG诱导的超声破菌的全菌液，3：无IPTG诱导的全菌液；
C为25℃时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，1：有IPTG诱导的超声破菌的上清，2：有IPTG诱导的超声破菌的全菌液，3：无IPTG诱导的全菌液；
D为37℃时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，1：无IPTG诱导的全菌液，2：有IPTG诱导的全菌液，3：有IPTG诱导的超声破菌的上清。
图3为育有水稻幼苗的小烧杯放入装有适量湿润细沙的透明塑料箱中培养图。
图4为不同浓度的1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉与药剂对照、丙酮对照根结生长趋势图。
图中，药剂A为1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉，对照药剂B为2,3-双(溴甲基)喹啉。
具体实施方式
实施例1马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx基因的克隆
根据GeneBank中马铃薯腐烂茎线虫cDNA全长序列进行特异性引物设计，上游引物N-PRXF：5’-CCATGGTACCCAAGTTTGAGACCATC-3’(SEQ ID No.1)，下划线为NcoI酶切位点；下游引物X-PRXR：3’-ATAAAGCCGTTCGTCTTCGAGCTC-5’(SEQ ID No.2)，下划线为XhoI酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
以通过反转录方法制备的马铃薯腐烂茎线虫cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，反应体系为5×GXL PCR Buffer 10μl、dNTP Mixture 4μl、N-PRXF 1μl、X-PRXR 1μl、Prime STAR GXL 0.5μl、cDNA 1μl、及H2O 32.5μl。反应条件为：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。实施例2重组表达质粒的构建
将实施例1中得到的PCR产物连入pEASY-Blunt克隆载体并转入Trans1-T1，取200μl菌液在含50ug/ml卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。次日挑单菌落进行菌液培养，经菌液PCR验证的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果用DNAMAN(7.0.2.176)与已知马铃薯腐烂茎线虫Prx cDNA进行序列比对，结果一致。
将Prx-pEASY-Blunt重组克隆质粒和pET-41b表达质粒分别经NcoI和XhoI(NEB)双酶切，胶回收PRX基因及pET-41b表达质粒，按T4连接酶(北京全式金)步骤在4℃下过夜连接。把2μl连接反应产物加入到100μl解冻后的BL21(DE3)感受态细胞(全式金生物技术有限公司产品)中，冰浴30min；42℃水浴60-90s；立即冰浴2-3min；每管加入不含Ampicillin的LB液体培养基890ml，37℃下以150-200rmp/min震荡培养1h，使细菌恢复活性；取500μl菌液均匀涂布在LB平板。挑选阳性克隆，并进行酶切鉴定(图1)。结果显示，重组Prx-pET-41b(DdPrx)原核表达载体构建成功，可用于重组DdPrx的表达。
实施例3重组DdPrx蛋白表达
对实施例2构建的表达载体在不同温度(18-37℃)和不同IPTG浓度(1.4-0.2mmol/L)条件下进行表达条件的优化，看重组DdPrx蛋白是否表达。由图2可知，与低分子量蛋白Marker比较，可以看出重组DdPrx蛋白在55kDa处有一条明显的粗带，与预期一致。说明，在18-37℃，IPTG浓度为1.4-0.2mmol/L时，能诱导重组DdPrx蛋白稳定表达。
将导入重组DdPrx质粒的BL21(DE3)菌液进行诱导培养，具体步骤如下：取保存的含重组DdPrx质粒的BL21(DE3)菌液2μl加入5ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养。次日取过夜培养的菌液1ml加入100ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养至OD600约为0.6，再加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，25℃、200rpm培养18h。4℃，10000rmp收集菌体，加入20ml纯化用平衡缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM imidazole，10mM Tris base,pH8.0)洗菌3次后，再加入20ml纯化用平衡缓冲液超声波破菌(3s+3s 10min,功率10％，3个循环)，4℃、13000rpm收集上清。经SDS-PAGE电泳，切取目的条带送生工生物工程(上海)股份有限公司进行质谱检测，结果为2个肽段AFIGKPAPDFTADAVVDGDFK、QITINDLPVGR与马铃薯腐烂茎线虫Prx蛋白匹配。表明，重组DdPrx蛋白表达成功。在100mmol/L最佳洗涤咪唑浓度和500mmol/L最佳洗脱咪唑浓度下，用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin(北京全式金)纯化重组DdPrx蛋白，用Ultra-15离心过滤器(Merck KGaA)更换缓冲液为1×PBS。
实施例42-Cys Prx抑制剂离体筛选方法的建立
对离体筛选方法涉及的DTT浓度、pH值和温度优化后进行DdPrx重组蛋白活性测定。测定采用硫氰酸铁法。将5μl实施例3获得的重组DdPrx蛋白(约3.5μg)加入85μl反应缓冲液(10mmol/L DTT，1×PBS，pH＝7.0)中30℃孵育3min，然后分别加入10μl浓度为0.01、0.02、0.03、0.04和0.05mmol/L 5个浓度的H2O2使反应开始，每个浓度的H2O2反应液均在第4、6、8、10、12min时加入26％的三氯乙酸终止反应。向体系中加入40μl硫酸亚铁铵(Fe(NH4)2(SO4)2)和20μl硫氰酸钾(KSCN)，与剩余过氧化氢反应后形成红色络合物，测定A475(Tecan infinite M200 PRO酶标仪)。从而求得重组DdPrx蛋白对H2O2的催化效率。
实施例52-Cys Prx抑制剂离体筛选方法
用1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉对重组DdPrx进行离体抑制活性试验，以2,3-双(溴甲基)喹啉为对照，具体如下：
将5μl实施例3获得的重组DdPrx蛋白(约3.5μg)分别加入85μl含10μmol/L-40μmol/L的2,3-双(溴甲基)喹啉和1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉的反应缓冲液中，在30℃水浴条件下孵育30min，再加入10μl浓度为0.02mmol/L的H2O2开始反应，其它步骤同实施例4。结果发现，非Prx抑制剂的2,3-双(溴甲基)喹啉10μmol/L-40μmol/L对重组DdPrx蛋白的抑制率为9％-20％，而1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉10μmol/L-40μmol/L对重组DdPrx蛋白的抑制率达到20％-40％，较对照药剂2,3-双(溴甲基)喹啉抑制效果明显，表明1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉对重组DdPrx具有较高离体抑制活性。
实施例6抗植物线虫侵染化合物的活体筛选验证
将实施例4所用的2,3-双(溴甲基)喹啉和1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉两种化合物进行抗植物线虫侵染的活体筛选。试验选用水稻根结线虫作为抗植物线虫侵染的活体筛选试验材料。水稻根结线虫侵染水稻根后3天便可观察到有明显的根结，在透明的F-127基质中可以直接肉眼观察，便于实时跟踪候选化合物抗线虫侵染的活性变化。
25ml烧杯中倒入18ml含1×华南营养液的预冷的25％F-127(m/v，美国SIGMA公司)基质，再分别加入300头水稻根结线虫和终浓度为12.5、25、50、100、200μmol/L的1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉，补水至20ml，每烧杯中移栽长势一致的水稻苗(发芽后5天的水稻苗)3株。将种有水稻苗的烧杯置于透明塑料箱中，塑料箱下铺垫约5cm高、含水量为30％、灭菌的细河沙，加盖密封，将其放入温度25±1℃、光照16h/黑暗8h的光照培养箱中培养(图3)。用浓度分别为50μmol/L的克百威和2,3-双(溴甲基)喹啉作为药剂对照，50μmol/L丙酮溶液作为溶剂对照。每组药剂4个重复。每天通过透明的F-127基质观察计数每个烧杯中的根结，共观察12天。用DPS v7.05进行方差分析。观察结果见图4。
通过对药后6天和12天的观察结果分析发现，1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉对水稻根结线虫的抑制效果表现出随浓度提高抑制效果增加的趋势，结果参见下表1，其中药后6天，50μmol/L 1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉对水稻根结线虫的抑制效果达64.8％，药后12天则对水稻根结线虫的抑制率下降到29.0％，对照药剂2,3-双(溴甲基)喹啉对水稻根结线虫的抑制效果仅为33.0％，药后12天则下降为4.7％，明显低于同等剂量1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉的效果。表明以2-Cys Prx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法在防治植物寄生线虫药物的筛选上具有很好的重复性和可信性，运用此方法我们获得了一种抗植物线虫侵染的化合物1,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉。
表11,4-二氧代-2,3-二溴甲基喹啉对水稻根结线虫的抑制效果