西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV1的连锁分子标记及其应用.pdf

本发明涉及西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记及其应用，分子标记ZY-138和ZY-157与抗病基因的遗传距离分别为0.4cM和2.6cM；利用引物对分子标记ZY-138和ZY-157进行PCR扩增，通过扩增产物可快速准确地检测抗性性状转育后代植株是否具有ZYMV-1抗病基因。本发明的有益效果为：可以显著提高抗病育种效率，缩短育种周期，为ZYMV抗病品种的选育提供了保障；本发明获得的分子标记ZY-138和ZY-157具有可靠稳定、操作简单、重复性好等优点，在鉴别抗、感品种和抗性单株时具有非常高的利用价值。

权利要求书
1.  西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记，其特征在于： 所述分子标记为ZY-138和ZY-157；
所述的分子标记ZY-138：
左端引物序列为SEQ ID NO.1，
右端引物序列为SEQ ID NO.2，
扩增产物为150bp，此分子标记来自西葫芦自交系BS12染色体，为共显性 分子标记，利用Mapmaker/EXP3.0测得与抗病基因ZYMV-1的遗传距离为0.4 cM；
所述的分子标记ZY-157：
左端引物序列为SEQ ID NO.3，
右端引物序列为SEQ ID NO.4，
扩增产物为97bp，此分子标记来自西葫芦自交系BS12染色体，为共显性 分子标记，利用Mapmaker/EXP3.0测得与抗病基因ZYMV-1的遗传距离为2.6 cM。

2.  获得权利要求1所述的西葫芦抗ZYMV病毒病基因ZYMV-1的分子标 记的方法，其特征在于，包括：以西葫芦自交系BS3和BS12分别作为感病和 抗病亲本配制F2代分离群体，用584对SSR引物筛选与西葫芦ZYMV显性抗 病基因ZYMV-1连锁的分子标记，得到2个分布在抗病基因两侧的共显性分子 标记ZY-138和ZY-157。

3.  西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-1的分子标记方法，其特征在于：用以 下的任意一对分子标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产 物：
1)权利要求1所述的分子标记ZY-138：
左端引物序列为SEQ ID NO.1，
右端引物序列为SEQ ID NO.2，
2)权利要求1所述的分子标记ZY-157：
左端引物序列为SEQ ID NO.3，
右端引物序列为SEQ ID NO.4，
如果用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，ZY-138能够扩增出150bp的 扩增片段，或者用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，ZY-157能够扩增出97bp 的扩增片段，则标志着待检西葫芦存在抗ZYMV的基因ZYMV-1。

4.  权利要求1所述的西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标 记的应用，其特征在于：所述的分子标记可以应用在西葫芦种质资源中ZYMV 抗病基因的鉴定和转育中。

说明书西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及西葫芦ZYMV显性抗病基因 ZYMV-1的连锁分子标记及其应用。
背景技术
西葫芦是全球范围内普遍栽植的重要蔬菜之一，在我国的栽培面积逐年增 加，特别是近年来保护地设施栽培发展迅速，已成为保护地中继黄瓜之后的第 二大栽培作物。对农民增收、农业结构调整以及丰富人民的菜篮子有着重要意 义。
小西葫芦黄化花叶病毒病(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)是目前危 害西葫芦等葫芦科作物生产的主要病害之一。ZYMV在世界范围内传播蔓延迅 速，近年来在我国西葫芦生产中的危害日趋严重和广泛(刘卫荣等，2008)。植 株感染ZYMV后会产生花叶、植株矮化畸形，果实表面瘤状凸凹不平、果肉僵 硬且味苦涩等症状，使果实失去商品价值，导致产量损失达60％以上，严重者 甚至绝产(Zechmann et a1.，2003；刘卫荣等，2008)。
目前还没有防治该病毒病的有效试剂，培育和推广抗病品种是防治ZYMV 最经济、安全、有效的措施。但目前，抗病基因主要来源于野生南瓜材料，存 在抗性性状转育困难，不利性状连锁累赘，传统抗病接种鉴定方法受环境和人 为操作因素影响大，鉴定结果准确性和稳定性不高，导致抗病育种效率低、周 期长、抗病品种少，远远不能满足生产需要。紧密连锁的分子标记可以加速抗 病育种进程及提高选择的准确性，是分子标记辅助选择育种的必要条件。但目 前还没有与西葫芦ZYMV抗病基因紧密连锁分子标记的研究报道。因此，开发 与西葫芦ZYMV抗病基因紧密连锁的分子标记，对于提高西葫芦抗病育种效率， 拓展抗病基因应用范围，保障西葫芦的健康生产具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子 标记及其应用，可快速准确地检测抗性性状转育后代植株是否具有ZYMV-1抗 病基因，为ZYMV抗病品种的选育提供了保障，弥补了现有技术中的不足之处。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记，所述分子标记为 ZY-138和ZY-157；
所述的分子标记ZY-138：
左端引物序列为SEQ ID NO.1，
右端引物序列为SEQ ID NO.2，
扩增产物为150bp，此分子标记来自西葫芦自交系BS12染色体，为共显性 分子标记，利用Mapmaker/EXP3.0测得与抗病基因ZYMV-1的遗传距离为0.4 cM；
所述的分子标记ZY-157：
左端引物序列为SEQ ID NO.3，
右端引物序列为SEQ ID NO.4，
扩增产物为97bp，此分子标记来自西葫芦自交系BS12染色体，为共显性 分子标记，利用Mapmaker/EXP3.0测得与抗病基因ZYMV-1的遗传距离为2.6 cM。
获得西葫芦抗ZYMV病毒病基因ZYMV-1的分子标记的方法，包括：以西 葫芦自交系BS3和BS12分别作为感病和抗病亲本配制F2代分离群体，用584 对SSR引物筛选与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1连锁的分子标记，得到 2个分布在抗病基因两侧的共显性分子标记ZY-138和ZY-157。
西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-1的分子标记方法，用以下的任意一对分子 标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物：
1)权利要求1所述的分子标记ZY-138：
左端引物序列为SEQ ID NO.1，
右端引物序列为SEQ ID NO.2，
2)权利要求1所述的分子标记ZY-157：
左端引物序列为SEQ ID NO.3，
右端引物序列为SEQ ID NO.4，
如果用引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO.2，ZY-138能够扩增出150bp的 扩增片段，或者用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，ZY-157能够扩增出97bp 的扩增片段，则标志着待检西葫芦存在抗ZYMV的基因ZYMV-1。
所述的分子标记可以应用在西葫芦种质资源中ZYMV抗病基因的鉴定和转 育中。
本发明的有益效果为：
1、在西葫芦自交系BS12中鉴定了一个ZYMV抗病基因ZYMV-1。
2、获得与西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-1紧密连锁的共显性分子标记 ZY-138和ZY-157，分布在抗病基因两侧，与抗病基因的遗传距离分别为0.4cM 和2.6cM。利用获得的分子标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因成功导入其 它西葫芦感病优良自交系，使之获得抗病性状。
3、鉴定方便，分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点，用标 记ZY-138和ZY-157检测西葫芦抗病基因ZYMV-1，可以确定抗病基因是否存 在以及存在状态，并预测植株对ZYMV病毒病的抗性，加快该抗病基因的利用。
4、本发明提出了利用西葫芦ZYMV病毒病抗病种质资源BS12中抗病基因 的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良 感病自交系中，利用该方法成功将抗病基因ZYMV-1导入西葫芦优良自交系 BS3，使其获得了ZYMV抗病性。 
附图说明
图1为分子标记ZY-138和ZY-157与西葫芦抗病基因ZYMV-1的遗传连锁 图，左边为标记间的图距。
图2为分子标记ZY-138的扩增带型，其中P1为感病亲本BS3，P2为抗病 亲本BS12，F1为杂交一代；1-19为以BS3为轮回亲本的回交单株；M：Trans DNA  markerlI，箭头所指为150bp特异扩增条带；
图3为分子标记ZY-157的扩增带型，其中P1为感病亲本BS3，P2为抗病 亲本BS12，F1为杂交一代；1-18为以BS3为轮回亲本的回交单株；M：Trans DNA  markerlI，箭头所指为97bp特异扩增条带。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施 例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
(一)西葫芦自交系BS3与BS12F2代的创建与表型鉴定：
(1)西葫芦自交系BS3(母本)与BS12(父本)进行杂交得到杂种F1，F1 自交产生F2代群体；
(2)F2代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接 种病毒病，接种15天后进行抗病性状调查，鉴定结果见表1，
表1接种ZYMV病毒病后BS3×BS12F2代群体遗传分析

R、S分别代表抗病单株、感病单株。x20.05，1=3.84；
(3)F2代单株进行性状调查后将感病植株移栽于温室种植，自交所得种子 为F3家系，每个F3家系中选择10粒种子种植，进行子代抗病性测验，验证 F2代感病单株是否携带纯合感病基因；
(4)通过对F2代单株进行遗传分析，发现西葫芦自交系BS12携带有一个 显性抗病基因。
(二)多态性分子标记筛选
(1)将10株抗病F2单株的叶片等量混成抗池，10株感病F2单株的叶片等 量混成感池。用CTAB法(Sue Porebski L.，1997)提取抗病亲本BS12、感病亲 本BS3、抗池和感池的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA(Bulk segregant  analysis)结合的方法进行多态性分子标记的筛选；
(2)首先利用584对SSR引物(Amine Zraidi，Gertraud Stiff，Martin Pachner, Abdolali Shoj aeiyan，Li Gong，Tamas Lelley(2007)A consensus map for Cucurbita  pepo.Mol.Breeding20(4)：375-388；Gong L，Stiff G， Kofler R，Pachner M，Lelley T  (2008)Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map  0f Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L.Theor Appl  Genet117：37-48；Blanca J，J，Roig C，Ziarsolo P，Nuez F，Picó B.(2011) Transcriptome characterization and high throughput S SRs and SNPs discovery in  Cucurbita pepo(Cucurbitaceae).BMC Genomics12：104)对BS12、BS3、抗池和 感池进行多态性标记筛选。
PCR反应体积为15微升，其中10×buffer1.5微升，2.5mM dNTPs0.3微升， Tag酶(5单位/微升)0.2微升，10μM引物(F/R)各0.3微升，模版DNA30ng， 加ddH2O至15微升；
SSR反应体系为DNA95℃预变性3min后，94℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min；
其中9个SSR标记在抗、感亲本与抗、感池之间检测到了一致的多态。
(三)紧密连锁分子标记的获得
根据连锁交换规律，利用9对候选分子标记在纯合感病家系各单株间的基因 型资料与单株的抗性资料，构建分子标记与ZYMV-1基因的连锁图谱，所用软 件为Mapmaker/EXP3.0，获得了与抗病基因ZYMV-1紧密连锁的分子标记 ZY-138和ZY-157，两个标记分布在抗病基因两侧，遗传连锁距离分别为0.4cM 和2.6cM(图1)；
(四)抗病基因ZYMV-1向感病西葫芦自交系的转移
利用获得的与抗病基因ZYMV-1紧密连锁的分子标记ZY-138或ZY-157，通 过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良感病自交系中(图2和图3)。利 用上述策略，成功获得了改良西葫芦优良自交系BS3，使其携带ZYMV-1抗病 基因具备了ZYMV抗病性。
西葫芦种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于 西葫芦育种具有重要作用。本发明通过将抗病种质BS12与感病自交系BS3杂 交，经遗传分析确定抗病材料中携带有一个显性的抗病基因，通过构建抗病性 状分离群体，经多态性分子标记筛选，构建了抗病基因ZYMV-1与分子标记 ZY-138和ZY-157的遗传连锁图谱。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育， 成功将抗病基因ZYMV-1转育到西葫芦优良感病自交系BS3中，使其获得了 ZYMV抗病性状。在传统育种方法中，由于缺乏与抗病基因连锁的分子标记， 每代的抗病基因转移均需要抗性鉴定，费时费力。因此，分子标记ZY-138和 ZY-157的开发可以简便准确的筛选含有抗病基因ZYMV-1的单株，大大节省抗 病材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性。