说明书一种基因疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种基因疫苗及其应用。
背景技术
肿大细胞病毒(Megalocyt ivirus)是虹彩病毒的一个属。该病毒为双链DNA病毒，具有二十面体的形状。肿大细胞病毒虽然发现较晚，但很快成为一种危害严重的鱼类病原，具有广泛的宿主范围，包括多种养殖鱼类，如真鲷、大菱鲆、鳜鱼、石斑鱼等。目前肿大细胞病毒已被公认为我国鱼类主要病毒病原之一，但是该病毒的免疫防御仍然处于研究阶段，尚无可产业化应用的疫苗。
基因疫苗(也称为DNA疫苗)是一种基因疫苗，其原理是将抗原基因克隆于一真核表达质粒，然后将质粒导入受免动物，抗原基因在动物体内表达，从而诱导机体产生特异的免疫应答。DNA疫苗的特点是既能诱发T细胞免疫也能诱发B细胞免疫，因而能有效防御病毒感染。
发明内容
本发明目的在于提供一种基因疫苗及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基因疫苗，基因疫苗为以肿大细胞病毒RBIV-C1为模板，F1/R1或F2/R2为引物分别扩增获得产物，分别连接于表达载体的质粒，即为基因疫苗质粒。
所述引物F 1为5'-GATATCATGGATGAGTACAATGCAGAGGGCT-3'；R1为5'-GATATCACACATGCCCATGTCAACAT-3'；F2为5'-GGGCCCGCCACCATGGAAGTGGACATTTGCT-3'；R2为5'-GCGGGCCCTTGCTGCATTTGCCTAGT-3'；
所述基因疫苗作为抑制/预防肿大细胞病毒的疫苗。
本发明具有如下优点：
1.高保护率。本发明的疫苗的免疫保护效率高达75％和65％。
2.安全。本发明的疫苗没有任何细胞毒性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的无内毒素质粒提取试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russel l:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
实施例1：肿大细胞病毒基因ORF107和ORF86的疫苗质粒的构建。
ORF107疫苗质粒pORF107的构建如下：
以已报导的肿大细胞病毒RBIV-C1(Zhang M,Xiao Z,Hu Y,Sun L.Characterizat ion of a megalocyt ivirus from cultured rock bream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege),in China.Aquac Res.2012；43:556–64。)为模板，采用F1和R1为引物进行PCR扩增病毒基因ORF107,PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,62℃ 60s,72℃ 60s,5个循环后改为94℃ 40s,69℃ 60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSORF107。将质粒pCN3(pCN3构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construct ion and evaluat ion of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine 2009；27:5195–202.)用SmaI酶切，回收5.4kb片段，同时将pBSORF107用EcoRV酶切回收0.7kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含有安卡青霉素(100μg/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时，挑取转化子，提取质粒，命名为pORF107，即为基因疫苗质粒。通过DNA测序分析证明了pORF107含有ORF107基因序列。
ORF86疫苗质粒pORF86的构建如下：
以上述肿大细胞病毒RBIV-C1为模板，采用F2和R2为引物进行PCR扩增病毒基因ORF86,PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,55℃ 60s,72℃ 60s,5个循环后改为94℃ 40s,66℃ 60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物的纯化和连接到pBS-T同上，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSORF86。将质粒pCN3(同上)用SmaI酶切，回收5.4kb片段，同时将pBSORF86用SmaI酶切回收1.5kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含有安卡青霉素(100μg/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时，挑取转化子，提取质粒，命名为pORF86，即为疫苗质粒。通过DNA测序分析证明了pORF86含有ORF86基因序列。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。
所述引物序列为
F1：5'-GATATCGCCACCATGTTATTCCACGCCGAGA-3'；
R1：5'-GCGCGATATCCACATGCACCTCTACGGTG-3'；
F2：5'-GGGCCCGCCACCATGGAAGTGGACATTTGCT-3'；
R2：5'-GCGGGCCCTTGCTGCATTTGCCTAGT-3'；
实施例2：疫苗的应用
步骤1)疫苗的免疫注射。将pORF107和pORF86稀释于PBS中至浓度为400mg/ml。将120条大菱鲆(每条重约12.9g)随机分为3组(40条/组)，分别命名为A，B和C。将A组的每条鱼肌肉注射50μl pORF107稀释液，将B组的每条鱼肌肉注射50μl pORF86稀释液，将C组(对照组)的每条鱼肌肉注射50μl PBS。
步骤2)疫苗的免疫保护效应检测。将上述实施例1的肿大细胞病毒RBIV-C1悬浮于PBS中至2x 106copies/ml，即为病毒悬液。在步骤1)免疫注射后的第30天，用病毒悬液腹腔注射三组鱼，每条鱼的注射量为50μl。在以后的30天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，10条；B组,14条；C组,40条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS＝100x(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)据此算出pORF107和pORF86疫苗对肿大细胞病毒的免疫保护效率分别为75％和65％。
故本发明的pORF107和pORF86疫苗能够高效保护大菱鲆抵御肿大细胞病毒感染。