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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510012641.3(22)申请日 2015.01.09C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)(71)申请人 江苏国际旅行卫生保健中心无锡分中心地址 214101 江苏省无锡市锡山区华夏中路10 号无锡出入境检验检疫局(72)发明人 耿合员 汪圣强 谢晓谦 肖雨张汀 李宗 谭文杰 苏川(74)专利代理机构 无锡市汇诚永信专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 32260代理人 张欢勇(54) 发明名称一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列及检测方法(57) 摘要本。
2、发明通过对GenBank上登录的六种人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区(1b区)设计了一对简并引 物 hCoV-For 和 hCoV-Rev 用 于 对 人 冠 状 病毒的通用定性检测。上游引物序列hCoV-For：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下 游 引 物 序 列hCoV-Rev ：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，扩 增 目的 片 段 大 小 为 605bp。 分 别 提 取 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63 和 HCoV-HKU1 阳性样本的RNA，通过 One-step RT-PCR 对该通用引。
3、物对进行验证。结果表明，分别以上述四种人冠状病毒 RNA为模板，以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 为通用引物进行 One-step RT-PCR 反应后都能扩增出大小约600bp 的单一目的条带。对 PCR 产物进行测序验证，结果表明扩增序列正确且不存在交叉反应。本发明可用于对人冠状病毒感染的核酸快速定性检测。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页序列表1页 附图2页(10)申请公布号 CN 104498636 A(43)申请公布日 2015.04.08CN 104498636 A1/1 页21.一种用于检测人冠状病毒。
4、感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO ：1 所示，其下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO ：2 所示。2.一种用权利要求 1 所述通用引物序列检测人冠状病毒感染的检测方法，其特征在于，包括 ：(1) 人冠状病毒检测通用引物设计通过对 GenBank 上登录的六种人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区设计了一对简并引物 hCoV-For 和 hCoV-Rev 用于对人冠状病毒感染的初步确诊，引物对序列分别为上游引物 hCoV-For ：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物hCoV-Rev ：TGYTGKGARCARAA。
5、YTCRTGWGG，扩增目的片段大小为 605bp ；(2) 人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测验证利用 QIAamp Viral RNA Mini kit 分别从四种人冠状病毒 ：HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E 和 HCoV-HKU1 的阳性样本中提取病毒 RNA，然后以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 为引物对，通过 One-step RT-PCR Quick Master Mix 对四种人冠状病毒分别进行检测验证。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对四种人冠状病毒分别进行检测验证的反应体系为 25L 。
6、：2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5L，50mM Mn(OAC)21.25L，10M hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 1L，病毒 RNA 5L，去离子水7.25L ；反应程序为 ：90 30s，60 30min，94，1min ；94 30s,56 30s,72 1min,35个循环；727min；反应产物经1.2琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果，结果表明，分别以上述四种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为通用引物进行One-step RT-PCR反应后都能扩增出大小600bp的单一目的条带，PCR产物经测序验证后序列正确且不。
7、存在交叉反应。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR 检测验证包括人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测灵敏性验证和人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测特异性验证。5.根据权利要求 4 所述的检测方法，其特征在于，所述人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测灵敏性验证，利用 QIAamp Viral RNAMini kit 提取人冠状病毒 RNA，并用分光光度计进行定量，并通过公式计算出每微升的拷贝数，将病毒 RNA 进行稀释，然后分别取各个稀释倍数的 RNA 为模板进。
8、行 RT-PCR，结果表明，每反应病毒 NA 拷贝数从 1.6x109 到1.6x103 是均能扩增出目的条带，而每反应病毒 RNA 拷贝数从 1.6x102 到 1.6x100 均不能扩增出目的条带，上述结果表明，该人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR最低检测下限为1600 拷贝 / 每反应，与常规单一冠状病毒检测所用 RT-PCR 及 real-time RT-PCR 灵敏性相当。6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述人冠状病毒 通用引物One-step RT-PCR 检测特异性验证，病毒 RNA 分别以 HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、。
9、HCoV-HKU1 以及 Influenza virusA、Influenza virus B、诺如病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒、人鼻病毒为模板，以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 为引物对进行 PCR 扩增，结果表明，分别以上述四种人冠状病毒 RNA 为模板，以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 为通用引物进行 One-step RT-PCR 反应后都能扩增出大小为 600bp 的单一目的条带，而加入其它病毒 RNA 模板均不能扩增出条带，表明该人冠状病毒通用检测引物对特异性较好。权 利 要 求 书CN 104498636 A1/4 页3一种用于检测人冠状病毒感染的通用引。
10、物序列及检测方法技术领域0001 本发明属于分子生物学和病毒学领域，更具体涉及一种新的利用一对简并引物，通过 One-step RT-PCR 反应即可达到对人冠状病毒感染定性检测的目的。背景技术0002 冠状病毒 (Coronavirus) 在病毒学分类上属于巢式病毒目 (orderNidovirals)、冠状病毒科 (family Coronavirade)、冠状病毒属 (genus Coronavirus) 的成员，基因组为单链、正链的 RNA，全长在 26 32kb 之间，是目前已知 RNA 病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒在自然界的感染普非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以。
11、及家禽类等都易感。近几年来，又从白鲸、骆驼，尤其是蝙蝠体内分离到多种类型的冠状病毒。冠状病毒依据核酸序列的系统发生分析，国际病毒学分类委员会 (ICTV，2012) 在第九次报告中将冠状病毒属又分成了 、 及 共四个亚组。人及其他哺乳类冠状病毒主要位于 和 亚组，禽类及其它鸟类冠状病毒主要位于 和 亚组。冠状病毒感染后，能够侵害机体的呼吸道、消化道、肝脏、肾脏以及神经系统等多种器官，造成不同程度的病理性损，从而引起不同程度的病理性疾病，严重者甚至能造成死亡。0003 人冠状病毒目前已知共有六种，分别是二十世纪 60 年代最早发现的人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E。
12、,HCoV-229E)和HCoV-OC43 ；20022003年在我国广东地区出现并迅速爆发的严重急性呼吸道综合征 (Severe acute respiratory syndrome,SARS)冠状病毒 SARS-CoV ；2004 年在荷兰分离的新型人冠状病毒 HCoV-NL63 ；2005 年在香港鉴定的新型人冠状病毒HCoV-HKU1以及2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS) 冠状病毒 MERS-CoV。其中，HCoV-229E 和 HCoV-NL63位于 亚组，HCoV-OC43 和 HCoV-HKU。
13、1 位于 亚组中的 2a 亚组，SARS-CoV 属于 亚组中的 2b 亚组，MERS-CoV 属于 亚组中的 2c 亚组。分子流行病学研究表明，人冠状病毒主要感染婴幼儿及免疫功能低下或缺陷者，既能感染上呼吸道引起发热、咳嗽、喉炎等普通感冒症状，又能感染下呼吸道引起支气管炎、毛细支气管炎及肺炎等急性呼吸道症状。其中，SARS-CoV 和 MERS-CoV 感染后能够引发呼吸系统和肾功能衰竭，严重者甚至造成死亡。除了 SARS-CoV 和 MERS-CoV 外，冠状病毒在常见人呼吸道病毒感染中的平均检出率为 15(Perlman S,et al.2009)。0004 冠状病毒基因组不连续的复制转。
14、录机制、RNA 依赖的 RNA 聚合酶 (RNA dependent RNApolymerase,RdRp) 复制的低忠实性、广泛的宿主嗜性使其在进化过程中极易发生碱基的插入、缺失以及基因重组或重配，在此过程中新型别或新的冠状病毒不断出现。因此，深入开展冠状病毒及新出现的冠状病毒的分子流行病学调查，及时研发新的快速、灵敏的分子检测技术对于阐释冠状病毒跨种属传播的分子机制以及满足快速诊断的要求等具有重要意义。目前，人冠状病毒分子检测方法主要有常规 RT-PCR、real-time RT-PCR 及血清学诊断法。这些方法通常利用特异性引物针及探针对某一特定种类的人冠状病毒进行单一检测，属于盲筛检测。
15、，不仅费时费力，而且检测试剂昂贵且容易造成污染。说 明 书CN 104498636 A2/4 页4发明内容0005 本发明的目的是以 GenBank 上登陆的目前已知的六种人冠状病毒全基因组序列为基础，通过对人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区设计了一对简并引物用于对人冠状病毒的通用定性检测。0006 本发明提供的技术方案是 ：0007 一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO ：1 所示，即 ：hCoV-For ：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG ；其下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO ：2 所示，。
16、即 ：hCoV-Rev ：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG。0008 一种用所述通用引物序列检测人冠状病毒感染的检测方法，包括 ：0009 (1) 人冠状病毒检测通用引物设计0010 通过对 GenBank 上登录的六种人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区设计了一对简并引物hCoV-For和hCoV-Rev用于对人冠状病毒感染的初步确诊，引物对序列分别为上游引物 hCoV-For ：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物hCoV-Rev ：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，扩增目的片段大小为 605bp ；0011 (。
17、2) 人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测验证0012 利 用 QIAamp Viral RNA Mini kit 分 别 从 四 种 人 冠 状 病 毒 ：HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E 和 HCoV-HKU1 的阳性样本中提取病毒 RNA，然后以 hCoV-For 和hCoV-Rev为引物对，通过One-step RT-PCR Quick Master Mix对四种人冠状病毒分别进行检测验证。0013 所述步骤 (2) 中，对四种人冠状病毒分别进行检测验证的反应体系为 25L ：2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5L。
18、，50mM Mn(OAC)21.25L，10M hCoV-For和hCoV-Rev各1L，病毒RNA 5L，去离子水7.25L ；反应程序为 ：9030s，6030min，94，1min ；94 30s,56 30s,72 1min,35 个循环 ；72 7min ；反应产物经 1.2琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果，结果表明，分别以上述四种人冠状病毒 RNA 为模板，以 hCoV-For 和hCoV-Rev 为通用引物进行 One-step RT-PCR 反应后都能扩增出大小 600bp 的单一目的条带，PCR 产物经测序验证后序列正确且不存在交叉反应。0014 所述步骤(2)中人冠状病毒。
19、通用引物One-step RT-PCR检测验证包括人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测灵敏性验证和人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测特异性验证。0015 所述人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测灵敏性验证，利用 QIAamp Viral RNA Mini kit提取人冠状病毒RNA，并用分光光度计进行定量，并通过公式计算出每微升的拷贝数，将病毒 RNA 进行稀释，然后分别取各个稀释倍数的 RNA 为模板进行 RT-PCR，结果表明，每反应病毒 RNA 拷贝数从 1.6x109 到 1.6x103 是均能扩增出目的条带，而每反应病毒RNA 拷。
20、贝数从 1.6x102 到 1.6x100 均不能扩增出目的条带，上述结果表明，该人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 最低检测下限为 1600 拷贝 / 每反应，与常规单一冠状病毒检测所用 RT-PCR 及 real-time RT-PCR 灵敏性相当 ；0016 所述人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测特异性验证，病毒 RNA 分别以HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1 以及 Influenza virus A、Influenza virus 说 明 书CN 104498636 A3/4 页5B、诺如病毒、呼吸道合。
21、胞体病毒、副流感病毒、人鼻病毒为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为引物对进行 PCR 扩增，结果表明，分别以上述四种人冠状病毒 RNA 为模板，以 hCoV-For 和hCoV-Rev为通用引物进行One-step RT-PCR反应后都能扩增出大小为600bp的单一目的条带，而加入其它病毒 RNA 模板均不能扩增出条带，表明该人冠状病毒通用检测引物对特异性较好。0017 本发明改变了以往对人冠状病毒检测的思路，以 GenBank 上登陆的目前已知的六种人冠状病毒 (HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1 和 MERS-CoV)。
22、 全基因组序列为基础，通过多序列比对在其基因组 1b 区设计了一对简并引物 hCoV-For 和hCoV-Rev，通过One-step RT-PCR实现对人冠状病毒感染快速定性检测，通过PCR产物测序即可准确判定人冠状病毒感染的种类。本发明可用于开发人冠状病毒感染快速确诊的核酸定性检测试剂盒。附图说明0018 图 1 是人冠状病毒检测通用引物设计图。0019 图 2 是人冠状病毒通用引物对信息图。0020 图 3 是人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测特异性图。具体实施方式0021 一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO ：1 。
23、所示，即 ：hCoV-For ：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG ；其下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO ：2 所示，即 ：hCoV-Rev ：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG。0022 一种用通用引物序列检测人冠状病毒感染的检测方法，包括 ：0023 (1) 人冠状病毒检测通用 ( 简并 ) 引物设计0024 通过对GenBank上登录的六种人冠状病毒包括人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E,HCoV-229E)、HCoV-OC43、SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coro。
24、navirus)、HCoV-NL63、HCoV-HKU1 和 MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus) 全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区 (1b区 ) 设计了一对简并引物 hCoV-For 和 hCoV-Rev 用于对人冠状病毒感染的初步确诊 ( 如图 1)，引物对序列分别为上游引物 hCoV-For ：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物hCoV-Rev ：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，扩增目的片段大小为 605bp( 其中，HCoV-HKU1 为608bp)( 。
25、如图 2)。0025 (2) 人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测验证0026 利用病毒 RNA 提取试剂盒 QIAamp Viral RNA Mini kit(QIAGEN) 分别从四种人冠状病毒 (HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E 和 HCoV-HKU1) 阳性样本中提取病毒 RNA，然后以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 为引物对，通过 One-step RT-PCR Quick Master Mix(TOYOBO 公司 ) 对四种人冠状病毒分别进行检测验证 ；反应体系为 25L ：2x RT-PCR Quick Master Mix。
26、 12.5L，50mM Mn(OAC)21.25L，10M hCoV-For 和 hCoV-Rev 各1L，病毒 RNA 5L，去离子水 7.25L。反应程序为 ：90 30s，60 30min，94，1min ；94 30s,56 30s,72 1min,35 个循环 ；72 7min。反应产物经 1.2琼脂糖凝胶电泳后说 明 书CN 104498636 A4/4 页6在紫外灯下观察结果。结果表明，分别以上述四种人冠状病毒 RNA 为模板，以 hCoV-For 和hCoV-Rev为通用引物进行One-step RT-PCR反应后都能扩增出大小约600bp的单一目的条带。PCR 产物经测序验证。
27、后序列正确且不存在交叉反应。0027 人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测验证包括灵敏性验证和特异性验证其中人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测灵敏性验证如下 ：0028 以人冠状病毒 HCoV-NL63 为例来说明该通用引物 One-step RT-PCR 检测的灵敏性。利用 QIAamp Viral RNA Mini kit(QIAGEN) 提取 HCoV-NL63 病毒 RNA 并用分光光度计 (NANODROP 2000c，Thermo) 进行定量，并通过 ( 拷贝 /L (6.02x1023)x 浓度 (ng/)x10-9/( 目的片段碱基数 x3。
28、40) 公式计算出每微升的拷贝数。将病毒 RNA 进行 10 倍倍比稀释 ( 从 3.2x108 倍比稀释到 3.2x100), 然后分别取 5L 各个稀释倍数的 RNA 为模板进行 RT-PCR，结果表明，每反应病毒 RNA 拷贝数从 1.6x109 到 1.6x103 是均能扩增出目的条带，而每反应病毒 RNA 拷贝数从 1.6x102 到 1.6x100 均不能扩增出目的条带。上述结果表明，该人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 最低检测下限为 1600 拷贝 / 每反应，与常规单一冠状病毒检测所用 RT-PCR 及 real-time RT-PCR 灵敏性相当。0029 。
29、其中人冠状病毒通用引物 One-step RT-PCR 检测特异性验证如下 ：0030 按照 (2) 中所述 25L 反应体系配制反应液。其中，病毒 RNA 分别以 HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1 以及 Influenza virus A(H3N2)、Influenza virus B、诺如病毒 (Norovirus)、呼吸道合胞体病毒 (RSV)、副流感病毒 (PIV2&PIV3)、人鼻病毒(Rhinovirus) 为模板，以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 为引物对进行 PCR 扩增。反应程序为 ：90 30s，60 30min，94。
30、，1min ；94 30s,56 30s,72 1min,35 个循环 ；72 7min。反应产物经1.2琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。结果表明，分别以上述四种人冠状病毒 RNA 为模板，以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 为通用引物进行 One-step RT-PCR 反应后都能扩增出大小约 600bp 的单一目的条带，而加入其它病毒 RNA 模板均不能扩增出条带 ( 如图3)，表明该人冠状病毒通用检测引物对特异性较好。说 明 书CN 104498636 A1/1 页70001 序 列 表CN 104498636 A1/2 页8图1图2说 明 书 附 图CN 104498636 A2/2 页9图3说 明 书 附 图CN 104498636 A。