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具有PDE抑制活性的芳基茚并吡啶
    【相关申请的交叉引用】

    根据35 U.S.C.§119(e)条款，本申请要求2001年4月18日提交的美国临时申请顺序号60/284,465的权益，该临时申请通过引用结合到本文中。

    本发明领域

    本发明涉及新的芳基茚并吡啶及其治疗和预防用途。使用这些化合物治疗和/或预防的疾病包括炎症和AIDS相关性疾病。

    【发明背景】

    磷酸二酯酶(PDE)家族已知有11个，广泛分布在许多细胞类型和组织中。按照其命名原则，数字表示家族，其后的大写字母表示不同基因。PDE抑制剂增加组织细胞中的cAMP浓度，因此对预防或治疗由cAMP水平降低引起的各种疾病有效，cAMP水平降低由cAMP异常代谢诱导。这些疾病包括例如过敏反应、变态反应、关节炎、哮喘、蜂螫伤、动物咬伤、支气管痉挛、痛经、食道痉挛、青光眼、早产、尿道疾病、炎性肠病、中风、勃起功能障碍、HIV/AIDS、心血管疾病、胃肠动力性疾病和牛皮癣。

    在目前已知的磷酸二酯酶中，PDE1家族由钙-钙调蛋白激活，其成员包括优先水解cGMP的PDE1A和PDE1B以及对cAMP和cGMP都表现出高亲和力的PDE1C。PDE2家族特征为由cGMP特异性刺激。赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)特异性抑制PDE2A。PDE3家族的酶(例如PDE3A、PDE3B)由cGMP特异性抑制。PDE4(例如PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D)是存在于T细胞中的cAMP特异性PDE，参与炎症反应。PDE3和/或PDE4抑制剂预计对以下疾病有效：自身免疫病(例如关节炎)、炎性肠病、支气管病(例如哮喘)、HIV/AIDS和牛皮癣。PDE5(例如PDE5A)抑制剂应对以下疾病的治疗有效：心血管疾病和勃起功能障碍。光受体PDE6(例如PDE6A、PDE6B、PDE6C)酶特异性水解cGMP。PDE8家族对cAMP和cGMP的水解都具有高亲和力，但灵敏度相对低于其它PDE家族特异性酶抑制剂。

    磷酸二酯酶7(PDE7A、PDE7B)是一种环腺苷一磷酸(cAMP)特异性的环核苷酸磷酸二酯酶。PDE7通过水解cAMP的3′-磷酸二酯键催化cAMP转化为腺苷一磷酸(AMP)。通过调节该转化，PDE7可使cAMP的胞内分布不均一，由此控制不同激酶信号转导途径的激活。PDE7A主要在T细胞中表达，已经表明PDE7A的诱导对于T细胞活化是必须地(Li，L.；Yee，C.；Beavo，J.A.Science 1999，283，848)。因为PDE7A活化对T细胞活化是必须的，所以小分子PDE7抑制剂作为免疫抑制剂应当有效。预计PDE7A抑制剂在诸如器官移植、自身免疫病(例如关节炎)、HIV/AIDS、炎性肠病、哮喘、变态反应和牛皮癣等的治疗领域中应具有免疫抑制功效。

    几乎没有报导过有效的PDE7抑制剂。大多数其它磷酸二酯酶的抑制剂对PDE7的IC50在100μM范围内。最近，Martinez等(J.Med.Chem.2000，43，683)报导了一系列PDE7抑制剂，其中两种最佳化合物的PDE7 IC50为8和13μM。然而，这些化合物对PDE7的选择性仅是对PDE4和PDE3选择性的2-3倍。

    最后，已经公开了以下化合物，其中一些化合物据报导对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、白色念珠菌(Canduda albicans)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之类的菌株表现出抗微生物活性(Gorlitzer，K.；Herbig，S.；Walter，R.D.Pharmazie 1997，504)：

    发明概述

    本发明提供一种具有式I结构的化合物或其药学上可接受的盐：

                              式I

    其中

    (a)R1选自：

    (i)-COR5，其中R5选自H、任选取代的C1-8直链或支链烷基、

       任选取代的芳基和任选取代的芳烷基；

       其中所述烷基、芳基和芳烷基上的取代基选自C1-8烷氧基、

       苯乙酰氧基、羟基、卤素、对甲苯磺酰氧基、甲磺酰氧基、

       氨基、氰基、烷氧羰基或NR20R21(其中R20和R21独立选

       自H、C1-8直链或支链烷基、C3-7环烷基、苄基、芳基或杂

         芳基)或者NR20R21一起构成杂环基或杂芳基；

    (ii)-COOR6，其中R6选自H、任选取代的C1-8直链或支链烷

         基、任选取代的芳基和任选取代的芳烷基；

         其中所述烷基、芳基和芳烷基上的取代基选自C1-8烷氧基、

         苯乙酰氧基、羟基、卤素、对甲苯磺酰氧基、甲磺酰氧基、

         氨基、氰基、烷氧羰基或NR20R21(其中R20和R21独立选

         自H、C1-8直链或支链烷基、C3-7环烷基、苄基、芳基或杂

         芳基)或者NR20R21一起构成杂环基或杂芳基；

    (iii)氰基；

    (iv) 与R4形成内酯或内酰胺；

    (v) -CONR7R8，其中R7和R8独立选自H、C1-8直链或支链烷

         基、C3-7环烷基、三氟甲基、羟基、烷氧基、酰基、烷羰

         基、羧基、芳烷基、芳基、杂芳基和杂环基；

         其中所述烷基、环烷基、烷氧基、酰基、烷羰基、羧基、

         芳烷基、芳基、杂芳基和杂环基可以被羧基、烷基、芳基、

         取代芳基、杂环基、取代杂环基、杂芳基、取代杂芳基、

         异羟肟酸、氨磺酰基、磺酰基、羟基、硫羟基、烷氧基或

         芳烷基取代，

         或者R7和R8和与其连接的氮一起形成杂环基或杂芳基；

    (b)  R2选自任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂

         芳基、任选取代的杂环基和任选取代的C3-7环烷基；

    (c)  R3为1-4个独立选自以下的基团：

    (i) H、卤代、C1-8直链或支链烷基、芳烷基、C3-7环烷基、C1-8

         烷氧基、氰基、C1-4烷氧羰基、三氟甲基、C1-8烷基磺酰

         基、卤素、硝基、羟基、三氟甲氧基、C1-8羧酸基、芳基、

         杂芳基和杂环基；

    (ii)-NR10R11，其中R10和R11独立选自H、C1-8直链或支链烷

         基、芳烷基、C3-7环烷基、羧基烷基、芳基、杂芳基和杂

         环基，或者R10和R11与氮一起形成杂芳基或杂环基；

    (iii)-NR12COR13，其中R12选自H或烷基，而R13选自H、烷

         基、取代烷基、C1-3烷氧基、羧烷基、R30R31N(CH2)p-、

        R30R31NCO(CH2)p-、芳基、芳烷基、杂芳基和杂环基，或

         者R12和R13与羰基一起形成含羰基的杂环基，其中R30和

         R31独立选自H、OH、烷基和烷氧基，而p是1-6的整数，

         其中所述烷基可以被羧基、烷基、芳基、取代芳基、杂环

         基、取代杂环基、杂芳基、取代杂芳基、异羟肟酸、氨磺

         酰基、磺酰基、羟基、硫羟基、烷氧基或芳烷基取代；

    (c)  R4选自以下基团：(i)氢、(ii)C1-3直链或支链烷基、(iii)苄

         基和(iv)-NR13R14，其中R13和R14独立选自H和C1-6烷基；

         其中所述C1-3烷基和苄基任选被一个或多个选自以下的基

         团取代：C3-7环烷基、C1-8烷氧基、氰基、C1-4烷氧羰基、

         三氟甲基、C1-8烷基磺酰基、卤素、硝基、羟基、三氟甲

         氧基、C1-8羧酸基、氨基、NR13R14、芳基和杂芳基；以及

    (e)  X选自S和O；

    前提是当R4为异丙基时，则R3不是卤素。

    在一个选择性实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中R1、R3和R4如上所述，而R2是-NR15R16，其中R15和R16独立选自氢、任选取代的C1-8直链或支链烷基、芳烷基、C3-7环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，或者R15和R16与氮一起形成杂芳基或杂环基；前提是当R2为NHR16时，则R1不是-COOR6，其中R6为乙基。

    本发明还提供一种含所述化合物和一种药学上可接受的载体的药用组合物。

    本发明进一步提供一种治疗患病受治疗者的方法，其中所述疾病可通过降低适当细胞的PDE活性得到改善，该方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的所述药用组合物。

    最后，本发明提供一种在受治疗者中预防疾病的方法，所述疾病可通过降低适当细胞的PDE活性得到改善，该方法包括在预期引起疾病(可通过降低受治疗者适当细胞的PDE活性得到改善)的发病过程之前或之后，给予所述受治疗者预防有效量的权利要求1的化合物。

    发明详述

    式I的化合物是有效的小分子磷酸二酯酶抑制剂，已经证实了其对PDE7、PDE5和PDE4有抑制力。本发明的某些化合物是有效的小分子PDE7抑制剂，还证实其对PDE5和PDE4具有良好选择性。

    R1的优选实施方案为COOR6，其中R6选自H、任选取代的C1-8直链或支链烷基、任选取代的芳基和任选取代的芳烷基。R6优选为H或可任选被选自CN和羟基的取代基取代的C1-8直链或支链烷基。

    R2的优选实施方案是任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。优选的取代基为1-3个选自以下的基团：卤素、烷基、烷氧基、烷氧基苯基、卤代、三氟甲基、三氟甲氧基或二氟甲氧基、氨基、烷基氨基、羟基、氰基和硝基。R2优选为任选取代的苯基或萘基，或者R2为任选被1-3个选自以下的基团取代的卤素、烷基、羟基、氰基和硝基。在所述化合物的另一个实施方案中，R2为-NR15R16。

    优选的R3取代基包括：

    (i) H、卤代、C1-8直链或支链烷基、C1-8烷氧基、氰基、C1-4

         烷氧羰基、三氟甲基、C1-8烷基磺酰基、卤素、硝基和羟

         基；

    (ii)-NR10R11，其中R10和R11独立选自H、C1-8直链或支链烷

         基、芳基C1-8烷基、C3-7环烷基、羧基C1-8烷基、芳基、

         杂芳基和杂环基，或者R10和R11与氮一起形成杂芳基或

         杂环基；

    (iii)-NR12COR13，其中R12选自氢或烷基，而R13选自氢、烷

         基、取代烷基、C1-3烷氧基、羧基C1-8烷基、芳基、芳烷

         基、R30R31N(CH2)p-、R30R31NCO(CH2)p-、杂芳基和杂环基，

         或者R12和R13与羰基一起形成含羰基的杂环基，其中R30

         和R31独立选自H、OH、烷基和烷氧基，而p是1-6的整

         数。

    R3特别选自以下基团：

    烷基(CO)NH-、NH2和NO2。

    R4的优选实施方案包括氢、C1-3直链或支链烷基，特别是甲基和氨基。

    在所述化合物的再一个实施方案中，R1为COOR6，而R2选自取代苯基和取代萘基，或者R2为NR15R16。

    更具体地说，R1为COOR6，其中R6为烷基，R2为取代的苯基或萘基，或者R2为NR15R16，而R3选自H、硝基、氨基、NHAc、卤代、羟基、烷氧基或下式基团：

    烷基(CO)NH-，而R4选自H、C1-3直链或支链烷基，特别是甲基和氨基。

    在一个优选实施方案中所述化合物选自下文表1所示的化合物。

    所述化合物更优选选自以下化合物：

                                化合物22

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，2-氨基-4-(1，3-苯并二氧杂环戊-5-基)-5-氧代，乙酯

                                化合物24

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(6-溴-1，3-苯并二氧杂环戊-5-基)-2-甲基-5-氧代，乙酯

                                化合物40

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，7-氨基-4-(1，3-苯并二氧杂环戊-5-基)-2-甲基-5-氧代，乙酯

                                化合物49

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(6-溴-1，3-苯并二氧杂环戊-5-基)-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物51

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(3，5-二甲基苯基)-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物56

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，8-(乙酰氨基)-4-(1，3-苯并二氧杂环戊-5-基)-2-甲基-5-氧代，乙酯

                                化合物67

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，2-甲基-4-(3-甲基苯基)-5-氧代，甲酯

                                化合物82

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，7-氨基-4-(3，5-二甲基苯基)-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物90

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，7-氨基-2-甲基-4-(4-甲基-1-萘基)-5-氧代，甲酯

                                化合物169

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(3，5-二溴-4-羟苯基)-2-甲基-8-硝基-5-氧代，甲酯

                                化合物170

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，7，8-二氯-4-(3，5-二溴-4-羟苯基)-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物192

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，7-溴-4-(3，5-二溴-4-羟苯基)-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物193

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，8-溴-4-(3，5-二溴-4-羟苯基)-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物241

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，8-[(3-羧基-1-氧代丙基)氨基]-4-(3，5-二甲基苯基)-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物242

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，8-[(3-羧基-1-氧代丙基)氨基]-2-甲基-4-(4-甲基-1-萘基)-5-氧代，甲酯

                                化合物245

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(3，5-二甲基苯基)-8-[[4-(羟氨基)-1，4-二氧代丁基]氨基]-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物250

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(3，5-二甲基苯基)-8-[[[(2-羟乙基)氨基]乙酰基]氨基]-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物251

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，8-[(4-羧基-1-氧代丁基)氨基]-4-(3，5-二甲基苯基)-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物254

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(3，5-二甲基苯基)-8-[[[(2-羟乙基)甲基氨基]乙酰基]氨基]-2-甲基-5-氧代，甲酯

                                化合物261

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(3，5-二甲基苯基)-2-甲基-8-[(4-吗啉基乙酰基)氨基]-5-氧代，甲酯

                                化合物262

    5H-茚并[1，2-b]吡啶-3-羧酸，4-(3，5-二甲基苯基)-2-甲基-5-氧代-8-[(1-哌嗪基乙酰基)氨基]-，甲酯

    可分离所述化合物并用其作为游离碱。还可以分离它们并用其作为药学上可接受的盐。这些盐的实例包括：氢溴酸盐、氢碘酸盐、盐酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、马来酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、羟乙磺酸盐、苯磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐(palmoic)、2-萘磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己烷氨基磺酰盐和葡糖二酸盐。

    本发明还提供一种包含所述化合物和一种药学上可接受的载体的药用组合物。

    药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于约0.01至约0.1M的磷酸缓冲液(优选0.05M)或0.8％的盐水。所述药学上可接受的载体可以为水性或非水性溶液、悬浮液和乳浊液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性溶媒包括水、乙醇、醇/水性溶液、甘油、乳浊液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。口服载体可以为酏剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂等。典型的固体载体为惰性物质，如乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、甘露醇等。胃肠外载体包括氯化钠溶液、Ringer氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化Ringer氏及非挥发性油类。静脉内载体包括液体和有营养的补充物、电解质补充物(如基于Ringer氏葡萄糖的那些物质)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。所有载体都可以根据需要使用本领域已知的常规技术和崩解剂、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂等混合。

    本发明还提供一种治疗患病受治疗者的方法，所述疾病通过降低适当细胞的PDE活性可得到改善，该方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的所述药用组合物。

    在一个实施方案中所述疾病为炎性疾病。在另一个实施方案中所述疾病为AIDS相关性疾病。可用所述药用组合物治疗的疾病实例包括但不限于器官移植、自身免疫病(例如关节炎)、免疫攻击(如蜂螫伤)、炎性肠病、支气管病(例如哮喘)、HIV/AIDS、心血管病、勃起功能障碍、变态反应和牛皮癣。在优选实施方案中所述疾病为类风湿性关节炎。

    本文使用的术语“受治疗者”包括但不限于任何动物或人工改良使其患通过降低适当细胞的PDE活性可改善的疾病的动物。在一个优选实施方案中所述受治疗者为人。在一个更优选的实施方案中所述受治疗者为人。

    作为实例，本文使用的“适当细胞”包括显现出PDE活性的细胞。适当细胞的具体实例包括但不限于T-淋巴细胞、肌肉细胞、神经细胞、脂肪组织细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞。

    可使用本领域技术人员已知的各种方法中的任一种，实施或进行所述药用组合物的给予。所述化合物例如可静脉内、肌内、口服和皮下给药。在优选实施方案中所述药用组合物口服给予。另外，给药可包括在合适的时间段内给予受治疗者多种剂量。这样的给药方案可按照常规方法确定。

    本文使用的药用组合物的“治疗有效量”是指足以终止、逆转或减缓疾病进程的量。药用组合物的“预防有效量”是指足以预防疾病(即消除、改善和/或延迟疾病发生)的量。测定所述药用组合物的治疗和预防有效量的方法在本领域是已知的。例如，可根据动物研究的结果用数学方法确定给予人的所述药用组合物的有效量。

    在一个实施方案中所述治疗和/或预防有效量是足以传递约0.001mg/kg体重至约200mg/kg体重的所述药用组合物的量。在另一个实施方案中所述治疗和/或预防有效量是足以传递约0.05mg/kg体重至约50mg/kg体重的所述药用组合物的量。更具体地说，在一个实施方案中，口服剂量在每日约0.05mg/kg至约100 mg/kg的范围内。在另一个实施方案中，口服剂量在每日约0.05mg/kg至约50mg/kg的范围内，而在再一个实施方案中，口服剂量在每日约0.05mg/kg至约20mg/kg的范围内。在再另一个实施方案中，输注剂量范围为在约几分钟至约几天的周期范围内，给予与药用载体混合的、约1.0μg/kg/分钟至约10mg/kg/分钟的抑制剂。在再一个实施方案中，对于局部给予，所述化合物可与药用载体以约0.001至约0.1的药物/载体比率组合。

    本发明还进一步提供一种预防受治疗者的炎症反应的方法，包括在预计引起所述受治疗者的炎症反应之前或之后，给予所述受治疗者预防有效量的所述药用组合物。在优选实施方案中所述事件为昆虫螫伤或动物咬伤。

    定义和命名原则

    除非另有说明，整个说明书中所使用的标准命名法，首先叙述指定侧链的末端部位，然后叙述连接点的相邻官能团。

    本文所使用的以下化学术语应具有以下段落所阐述的含义：“独立”当关联化学取代基时，应表示如果存在不止1个取代基，则所述取代基可相同或不同。

    “烷基”将表示直链、环状和支链烷基。除非另有说明，所述烷基将包含1-20个碳原子。除非另有说明，所述烷基将任选被以下的一个或多个基团取代：例如卤素、OH、CN、巯基、硝基、氨基、C1-C8-烷基、C1-C8-烷氧基、C1-C8-烷硫基、C1-C8-烷基-氨基、二(C1-C8-烷基)氨基、(一、二、三和四-)卤代-烷基、甲酰基、羧基、烷氧基羰基、C1-C8-烷基-CO-O-、C1-C8-烷基-CO-NH-、甲酰胺基、异羟肟酸、磺酰胺基、磺酰基、硫羟基、芳基、芳基(C1-C8)烷基、杂环基和杂芳基。

    “烷氧基”将表示-O-烷基，除非另有说明，烷氧基将具有1-8个碳原子。

    “卤素”将表示氟、氯、溴或碘；“PH”或“Ph”表示苯基；“Ac”表示酰基，“Bn”表示苄基。

    本文所用的术语“酰基”无论单独使用还是作为取代基的一部分使用，都表示通过去除羟基而得自有机酸的具有2-6个碳原子(支链或直链)的有机基。本文所使用的术语“Ac”无论单独使用还是作为取代基的一部分使用，都表示乙酰基。

    “芳基”或“Ar”无论单独使用还是作为取代基的一部分使用，都是碳环芳基，其包括但不限于苯基、1-或2-萘基等。碳环芳基可通过以下基团独立取代其上的1-5个氢原子进行取代：卤素、OH、CN、巯基、硝基、氨基、C1-C8-烷基、C1-C8-烷氧基、C1-C8-烷硫基、C1-C8-烷基-氨基、二(C1-C8-烷基)氨基、(一、二、三和全-)卤代-烷基、甲酰基、羧基、烷氧基羰基、C1-C8-烷基-CO-O-、C1-C8-烷基-CO-NH-或甲酰胺基。说明性芳基包括例如苯基、萘基、联苯基、氟苯基、二氟苯基、苄基、苯甲酸基苯基、乙氧羰基苯基、乙酰基苯基、乙氧基苯基、苯氧基苯基、羟苯基、羧苯基、三氟甲基苯基、甲氧基乙基苯基、乙酰氨基苯基、甲苯基、二甲苯基、二甲基氨甲酰基苯基等。“Ph”或“PH”表示苯基。

    本文所用的术语“杂芳基”无论单独使用还是作为取代基的一部分使用，都是指具有5-10个环原子的环状全不饱和基团，其中一个环原子选自S、O和N；0-2个环原子为另外的独立选自S、O和N的杂原子；而其余的环原子为碳。所述基团可通过任一个环原子连接至其余的分子。代表性的杂芳基包括例如：吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯甲酰、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、三唑基、三嗪基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、异噻唑基、2-噁氮杂_基、氮杂_基、N-氧代-吡啶基、1-二氧代噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基-N-氧化物、苯并咪唑基、苯并吡喃基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并二嗪基、苯并呋咱基、苯并硫代吡喃基、吲唑基、中氮茚基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋吡啶基(例如呋[2，3-c]吡啶基、呋[3，2-b]吡啶基或呋[2，3-b]吡啶基)、咪唑并吡啶基(例如咪唑并[4，5-b]吡啶基或咪唑并[4，5-c]吡啶基)、1，5-二氮杂萘基、2，3-二氮杂萘基、嘌呤基、吡啶并吡啶基、喹唑啉基、噻吩并呋喃基、噻吩并吡啶基、噻吩并噻吩基和呋喃基。杂芳基可被以下基团独立取代其上的1-5个氢原子进行取代：卤素、OH、CN、巯基、硝基、氨基、C1-C8-烷基、C1-C8-烷氧基、C1-C8-烷硫基、C1-C8-烷基-氨基、二(C1-C8-烷基)氨基、(一、二、三和全-)卤代-烷基、甲酰基、羧基、烷氧羰基、C1-C8-烷基-CO-O-、C1-C8-烷基-CO-NH-或甲酰胺基。杂芳基可用一氧代取代，产生例如4-氧代-1H-喹啉。

    术语“杂环基”是指任选取代的完全或部分饱和的环基，例如其是4-7元单环系、7-11元双环系或10-15元三环系，其在包含至少一个碳原子的环中具有至少一个杂原子。含有杂原子的杂环基的每个环都可以具有选自氮原子、氧原子和硫原子的1、2或3个杂原子，其中N和S杂原子还可以任选地被氧化。N原子可任选地被季铵化。所述杂环基可以连接在任何杂原子或碳原子上。

    代表性的单环杂环基包括：吡咯烷基、氧杂环丁烷基、吡唑啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、4-哌啶酮基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃基砜、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、1，3-二氧戊环、二噁烷基、硫杂环丁烷基、硫杂丙环基等。代表性双环杂环基包括奎宁环基、四氢异喹啉基、二氢异吲哚基、二氢喹唑啉基(例如3，4-二氢-4-氧代-喹唑啉基)、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噻喃基、二氢苯并噻喃基砜、二氢苯并吡喃基、二氢吲哚基、异苯并二氢吡喃基、异二氢吲哚基、胡椒基、四氢喹啉基等。

    取代芳基、取代杂芳基和取代杂环基还可以被第二个取代芳基、第二个取代杂芳基或第二个取代杂环基取代，产生例如4-吡唑-1-基-苯基或4-吡啶-2-基-苯基。

    指定的碳原子数(例如C1-8)独立地表示烷基或环烷基部分中的碳原子数目，或者独立地表示较大取代基的烷基部分(其中烷基作为较大取代基的前缀词根出现)中的碳原子数目。

    除非另有说明，否则在分子中一个具体位置上的任何取代基或变量的定义都与它在那个分子的其它任何位置的定义无关。可以理解，本领域的普通技术人员就可以选择在本发明化合物上的取代基和取代形式，以提供化学上稳定并可通过本领域已知技术以及本文所述的那些方法轻易合成的化合物。

    当根据本发明的化合物具有至少一个立体(stereogenic)中心时，它们可以相应地作为对映体存在。当所述化合物具有两个或更多个立体中心时，它们可以另外作为非对映异构体存在。此外，一些所述化合物的晶形可以作为多晶形物存在，并且也将其包括在本发明范围内。另外，一些所述化合物可以与水(即水合物)或普通有机溶剂形成溶剂化物，也将这些溶剂化物包括在本发明范围内。

    本发明的某些化合物可具有反式和顺式异构体。另外，当用于制备本发明化合物的方法产生立体异构体的混合物时，通过常规技术如制备层析法可以将这些异构体分离。所述化合物可以制备成单一的立体异构体或某些可能立体异构体的外消旋形式混合物。通过合成或拆分可以获得非外消旋形式。可以将所述化合物例如通过标准技术(如通过形成盐形成非对映异构对)拆分成其组成的对映异构体。也可以通过共价键合形成手性助剂，随后经层析分离和/或结晶分离并除去手性助剂，将所述化合物拆分。或者，所述化合物可以使用手性层析拆分。

    参照以下的实验详述可更好地理解本发明，但本领域技术人员应容易理解：这些实验详述仅用于阐述本发明，下文的权利要求书更全面地描述了本发明。另外，在本申请中引用了各种公开出版物。这些公开出版物的公开内容通过引用结合到本申请中，以便更全面地阐述本发明所属领域的状态。

    实验详述

    I.通用合成流程

    可按照以下描述的通用合成方法合成本发明的代表性化合物，并用以下的通用流程图图示说明。某些流程的产物可用作中间体来生产不止一种的所述化合物。选择用于生产后续本发明化合物的中间体是一个判断问题，完全属于本领域技术人员的能力范围之内。

                                流程1

    流程1描述的步骤可用于制备本发明的化合物，其中X是O，流程1中的R3a、R3b、R3c和R3d独立为任何R3基团，而R1、R2、R3、和R4如上所述。

    亚苄基2可由已知方法获得(Bullington，J.L.；Cameron，J.C.；Davis，J.E.；Dodd，J.H.；Harris，C.A.；Henry，J.R.；Pellegrino-Gensey，J.L.；Rupert，K.C.；Siekierka，J.J.Bioorg.Med.Chem.Lett.1998，8，2489；Petrow，V.；Saper，J.；Sturgeon，B.J.Chem.Soc.1949，2134)。亚苄基化合物和烯胺3的Hantzsch反应可在回流乙酸中进行(Petrow等，同上)。在无法获得所需要的烯胺时，可使用包括将乙酸铵加入反应的替代性Hantzsch条件。获得的二氢吡啶4用三氧化铬氧化，以获得所需的吡啶1(Petrow等，同上)。在稠合芳环(R3)上的取代形式产生区域异构体(regioisomers)混合物的情况下，可通过柱层析分离产物。

    在某些情况下，特别是在R2为烷基的情况下，可进行使用三种组分的另一个改进型Hantzsch反应(Bocker，R.H.；Buengerich，P.J.Med.Chem.1986，29，1596)。当R2为烷基时还必须用DDQ或MnO2代替氧化铬(VI)进行氧化(Vanden Eynde，J.J.；Delfosse，F.；Mayence，A.；Van Haverbeke，Y.Tetrahedron 1995，51，6511)。

                                流程2

    为了获得对应的羧酸和酰胺，如上制备氰乙酯5。通过用NaOH的丙酮和水溶液处理将酯转化为羧酸(Ogawa，T.；Matsumoto，K.；Yokoo，C.；Hatayama，K.；Kitamura，K.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.11993，525)。然后可使用标准方法由酸获得对应的酰胺。

                            流程3

    可稍加修改制备其中R4为NH2的化合物的方法。如流程4所示，由亚苄基2和烷基脒并乙酸酯一步制备这些化合物(Kobayashi，T.；Inoue，T.；Kita，Z.；Yoshiya，H.；Nishino，S.；Oizumi，K.；Kimura，T.Chem.Pharm.Bull.1995，43，788)，流程4中的R为如上所述的R5或R6。

                            流程4

    如流程5所示，由亚苄基8(Zimmer，H.；Hillstrom，W.W.；Schmidt，J.C.；Seemuth，P.D.；Vogeli，R.J.Org.Chem.1978，43，1541)和2，3-二氢-1，3-茚二酮可合成二氢吡啶内酯9，然后通过用MnO2氧化获得对应的吡啶。

                            流程5

    以下列出改良稠合芳环上的取代基的代表流程。通过用氯化锡(II)还原由对应的硝基化合物10获得胺11(流程6)。胺和乙酰氯反应产生酰胺12。

                                流程6

    按照流程7，还可将末端具有羧酸的烷基链加入到胺11，在流程7中Y是O，n是1-3的整数。例如，与琥珀酸酐(Omuaru，V.O.T.；Indian J.Chem.Sect B.1998，37，814)或β-丙醇酸内酯(Bradley，G.；Clark，J.；Kernick，W.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1 1972，2019)反应可产生对应的羧酸13。然后通过用氯甲酸乙酯和羟胺处理将这些羧酸转化为异羟肟酸14(Reddy，A.S.；Kumar，M.S.；Reddy，G.R.Tetrahedron Lett.2000，41，6285)。

                                流程7

    如流程8所示，还可用乙醇酸处理胺11产生醇15(Jursic，B.S.；Zdravkovski，Z.Synthetic Comm.1993，23，2761)。

                                流程8

    如流程9所示，还可以先后用氯乙酰氯后用胺处理氨基茚并吡啶11产生更复杂的胺16(Weissman，S.A.；Lewis，S.；Askin.，D.；Volante，R.P.；Reider，P.J.Tetrahedron Lett.1998，39，7459)。在R6为羟乙基时，所述化合物可进一步转变为哌嗪酮17。

                                流程9

    可使用已知的方法(Gorlitzer，K.；Herbig，S.；Walter，R.D.Pharmazie 1997，504)或通过钯催化偶合，由4-氯茚并吡啶19合成4-氨基茚并吡啶18(流程10)。

                                流程10

    II.特定化合物的合成

    可按照以下实施例制备本发明代表性的特定化合物。还没有尝试对这些反应中获得的产量进行优化。但是，根据以下内容，本领域技术人员应当知道如何通过对反应时间、温度、溶剂和/或试剂进行常规改变而增加产量。

    某些合成产物可用作中间体来生产不止一种的所述化合物。在此情况下，选择用于生产本发明化合物的中间体是一个判断问题，完全属于本领域技术人员的能力范围之内。

                               实施例1

                      Hantzsch缩合形成二氢吡啶4

     (R1＝COOMe；R2＝3，5-二甲基苯基；R3b，c＝Cl；R3a，b＝H；R4＝Me)

    向亚苄基2(0.500g，1.5mmol)的乙酸(10ml)溶液的回流溶液中加入甲基-3-氨基丁烯酸酯(0.695g，6.0mmol)。将反应物加热至回流达20分钟，然后加入水，直至开始形成沉淀。将反应物冷却至室温。过滤混合物，用水洗涤，获得0.354g(55％)的红色固体。MSm/z 450(M++23)，428(M++1)。

                                实施例2

                    替代性Hantzsch条件形成二氢吡啶4

             (R1＝CO2Me；R2＝2，4-二甲基苯基；R3＝H；R4＝Et)

    向亚苄基2(1.00g，3.82mmol)的乙酸(12ml)溶液的回流溶液中加入丙酰乙酸甲酯(1.98g，15.2mmol)和乙酸铵(1.17g，15.2mmol)。将反应物加热20分钟，然后冷却至室温。溶液没有产物沉淀，于是将反应物加热至回流，然后加入水，直至固体开始沉淀。将混合物冷却至室温后过滤，用水洗涤红色固体，获得1.29g(90％)产物。MSm/z 396(M++23)，374(M++1)。

                                实施例3

                          二氢吡啶4氧化为吡啶1

      (R1＝COOMe；R2＝3，5-二甲基苯基；R3b，c＝Cl；R3a，d＝H；R4＝Me)

    向二氢吡啶4(0.250g，0.58mmol)的乙酸(10ml)溶液的回流溶液中加入氧化铬(VI)(0.584g，0.58mmol)的1mL水溶液。回流30分钟后，用水稀释反应物，直至开始形成沉淀。将混合物冷却至室温，让其静置过夜。过滤混合物，用水洗涤，产生0.199g(81％)黄色固体。MS m/z 448(M++23)，426(M++1)。

                            实施例4

                       二氢吡啶4氧化为吡啶1

    (R1＝COOMe；R2＝(4-甲基)-1-萘基；R3b，c＝H，NO2/NO2，H；R＝Me)

    向区域异构体二氢吡啶4(3.59g，8.16mmol)的乙酸(40ml)溶液的回流悬浮液中加入氧化铬(VI)(0.816g，8.16mmol)的3ml水溶液。回流20分钟后，用水稀释反应物，直至开始形成沉淀。将混合物冷却至室温，让其静置过夜。过滤混合物，用水洗涤，产生为黄色固体的区域异构体混合物。通过柱层析纯化产物，用己烷∶乙酸乙酯洗脱产生1.303g(37％)的吡啶1(R3b＝NO2；R3c＝H)和0.765g(21％)的其区域异构体(R3b＝H；R3c＝NO2)。MS m/z 461(M++23)，439(M++1)。

                              实施例5

                替代性三组分Hantzsch反应形成二氢吡啶4

                 (R1＝CO2Me；R2＝环己基；R3＝H；R4＝Me)

    使环己烷甲醛(2.0g，17.8mmol)、2，3-二氢-1，3-茚二酮(2.6g，17.8mmol)、乙酰乙酸甲酯(2.0g，17.8mmol)和氢氧化铵(1ml)在8ml甲醇中回流1.5小时。将温度降低至大约50℃，反应物搅拌过夜。将反应物冷却至室温，过滤，并用水洗涤固体。然后用热乙醇溶解残余物，趁热过滤。将滤液浓缩，产生4.1g(68％)产物，该产物不用纯化就可使用。MS m/z 336(M--1)。

                                实施例6

                            DDQ氧化二氢吡啶4

                  (R1＝CO2Me；R2＝环己基；R3＝H；R4＝Me)

    向二氢吡啶4(2.50g，7.40mmol)的15ml二氯甲烷溶液中加入2，3-二氯-3，6-二氰基-1，4-苯醌(1.70g，7.40mmol)。于室温搅拌反应物4小时。过滤混合物，用二氯甲烷洗涤残余物。浓缩滤液后，通过柱层析纯化残余物，用乙酸乙酯∶己烷洗脱产生0.565g(23％)的黄色固体。MS m/z 358(M++23)，336(M++1)。

                            实施例7

                       MnO2氧化二氢吡啶4

        (R1＝CO2Me；R2＝4-(二甲基氨基)苯基；R3＝H；R4＝Me)

    向二氢吡啶4(0.50g，1.3mmol)的10ml二氯甲烷溶液中加入MnO2(2.5g，28.7mmol)。于室温搅拌反应物过夜，然后过滤，并用二氯甲烷洗涤。浓缩滤液，产生0.43g(88％)的橙色固体1。MS m/z 395(M++23)，373(M++1)。

                            实施例8

                         羧酸酯5的裂解

             (R2＝2，4-二甲基苯基；R3＝H；R4＝Me)

    向酯5(2.75g，6.94mmol)的丙酮(50ml)悬浮液中加入1M NaOH水溶液(100ml)。于室温搅拌24小时后，用100ml水稀释反应混合物，并用二氯甲烷(2×100ml)洗涤。将水层冷却至0℃，用浓盐酸酸化。过滤混合物，用水洗涤，产生1.84g(77％)的黄色固体6。MS m/z366(M++23)，343(M++1)。

                             实施例9

                            酰胺7的制备

         (R2＝2，4-二甲基苯基；R3＝H；R4＝Me；R5＝H；R6＝Me)

    将羧酸6(0.337g，0.98mmol)的亚硫酰氯(10ml)溶液回流加热1小时。冷却溶液，真空浓缩。用CCl4稀释残余物，浓缩去除残余的亚硫酰氯。然后用THF(3.5ml)溶解残余物，将其加入到0℃的甲胺(1.47ml的2.0M的THF溶液，2.94mmol)的6.5ml THF溶液中。将反应物温至室温，搅拌过夜。将混合物倾至水中，过滤，用水洗涤，干燥得到0.263g(75％)棕褐色固体。MS m/z 357(M++1)。

                           实施例10

                          吡啶1的制备

          (R1＝CO2Et；R2＝4-硝基苯基；R3＝H；R4＝NH2)

    向亚苄基2(1.05g，3.76mmol)的10ml乙酸溶液的回流溶液中加入乙基脒并乙酸酯乙酸盐(0.720g，3.76mmol)。获得的溶液回流加热过夜。冷却至室温后，通过过滤取出产生的沉淀，用水洗涤。将此不纯的残余物在少量乙醇中加热，然后过滤产生0.527g(35％)黄色固体。MS m/z 412(M++23)，390(M+1)。

                             实施例11

                        亚苄基8的Hantzsch缩合

              (R2＝3-甲氧基苯基和2，3-二氢-1，3-茚二酮)

    将亚苄基8(2.00g，9.2mmol)、2，3-二氢-1，3-茚二酮(1.34g，0.2mmol)和乙酸铵(2.83g，36.7mmol)加入到30ml乙醇中，加热至回流过夜。将反应混合物冷却至室温，用乙醇稀释。通过过滤收集黄色沉淀，用乙醇洗涤，真空干燥，产生1.98g(63％)的二氢吡啶9。MS m/z346(M++1)。

                             实施例12

                           还原制备胺11

                (R1＝CO2Me；R2＝4-甲基萘基；R4＝Me)

    向吡啶10(0.862g，1.97mmol)的35ml乙醇溶液的回流悬浮液中加入二水氯化锡(II)(1.33g，5.90mmol)的6ml 1∶1乙醇∶浓盐酸溶液。将获得的溶液回流加热过夜。加入水，直至开始形成沉淀，将反应物冷却至室温。然后过滤混合物，用水洗涤。干燥后，通过柱层析纯化残余物，用己烷∶乙酸乙酯洗脱产生0.551g(69％)的橙色固体。MS m/z 431(M++23)，409(M++1)。

                            实施例13

                          胺11的乙酰化

          (R1＝CO2Et；R2＝3，4-亚甲基二氧基苯基；R4＝Me)

    向胺11(0.070g，0.174mmol)的15ml二氯甲烷溶液中加入三乙胺(0.026g，0.261mmol)和乙酰氯(0.015g，0.192mmol)。于室温搅拌过夜后，用水稀释反应混合物，然后用二氯甲烷(3×35ml)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥并浓缩。通过硅胶层析纯化残余物，用己烷∶乙酸乙酯洗脱产生0.054g(70％)的酰胺12。MS m/z467(M++23)，445(M++1)。

                             实施例14

                            羧酸13的制备

        (R1＝CO2Me；R2＝3，5-二甲基苯基；R4＝Me；Y＝O；n＝2)

    向胺11(0.079g，0.212mmol)的5ml苯悬浮液中加入琥珀酸酐(0.021g，0.212mmol)。回流加热24小时后，过滤反应混合物，并用苯洗涤。在高真空下干燥残余物，然后用乙醚洗涤，以去除过量的琥珀酸酐。由此产生0.063g(63％)的羧酸13。MS m/z 473(M++1)。

                             实施例15

                             羧酸13的制备

       (R1＝CO2Me；R2＝3，5-二甲基苯基；R4＝e；Y＝H2；n＝1)

    向胺11(0.078g，0.210mmol)的5ml乙腈溶液的回流溶液中加入β-丙醇酸内酯(0.015g，0.210mmol)。将反应物加热至回流达72小时，然后冷却至室温。浓缩反应混合物。将残余物与10％NaOH水溶液混合，并用乙醚和乙酸乙酯序贯洗涤。用浓盐酸酸化水层，并用二氯甲烷(2×25ml)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥、过滤并浓缩。通过柱层析纯化残余物，用5％MeOH的二氯甲烷溶液洗脱产生0.020g(21％)橙色固体。MS m/z 467(M++23)，445(M++1)。

                          实施例16

                      异羟肟酸14的制备

       (R1＝CO2Me；R2＝(4-甲基)-1-萘基；Y＝O；n＝2；R4＝Me)

    向羧酸13(0.054g，0.106mmol)的10ml乙醚的0℃悬浮液中加入三乙胺(0.014g，0.138mmol)，然后加入氯甲酸乙酯(0.014g，0.127mmol)。于0℃搅拌混合物30分钟，将其温至室温。加入羟胺(0.159mmol)的甲醇溶液，反应物于室温搅拌过夜。过滤混合物，用乙醚洗涤残余物，真空干燥，产生0.030g(54％)黄色固体。MS m/z 524(M++1)。

                             实施例17

                            酰胺15的制备

          (R1＝CO2Me；R2＝3，5-二甲基苯基；R4＝Me)

    将胺11(0.201g，0.54mmol)和乙醇酸(0.049g，0.65mmol)的混合物于120-160℃加热30分钟。在加热过程中，加入更多的乙醇酸，以确保存在过量试剂。一旦原料耗尽，将反应物冷却至室温，用二氯甲烷稀释。获得的混合物用以下物质萃取：20％NaOH、接着为10％HCl、最后为水。浓缩合并的有机相，用乙醚研磨。通过柱层析纯化，用乙酸乙酯∶己烷洗脱，产生0.012g(5％)黄色固体。MS m/z 453(M++23)，431(M++1)。

                           实施例18

                          酰胺16的制备

     (R1＝CO2Me；R2＝3，5-二甲基苯基；R4＝Me；NR6R7＝吗啉代)

    向胺11(0.123g，0.331mmol)的2ml 20％NaHCO3水溶液和3ml乙酸乙酯溶液的0℃混合物中加入氯乙酰氯(0.047g，0.413mmol)。将反应物温至室温，并搅拌45分钟。将混合物倾至分液漏斗，去除水层。不用纯化就可使用含粗氯酰胺的有机层。向乙酸乙酯溶液中加入吗啉(0.086g，0.992mmol)，将反应物加热至大约65℃过夜。用水稀释反应物，并冷却至室温。用乙酸乙酯(3×25ml)萃取后，用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥并浓缩，产生0.130g(79％)黄色固体。MS m/z 522(M++23)，500(M++1)。

                           实施例19

                         哌嗪酮17的制备

            (R1＝CO2Me；R2＝3，5-二甲基苯基；R4＝Me；R7＝H)

    向0℃的酰胺16(R6＝CH2CH2OH)(0.093g，0.20mmol)、三正丁基膦(0.055g，0.27mmol)的0.35ml乙酸乙酯溶液中缓慢加入二叔丁基偶氮二羧酸酯(0.062g，0.27mmol)的0.20ml乙酸乙酯溶液。让反应物静置15分钟，然后加热至40℃过夜。滴加4.2M的盐酸乙醇。将混合物冷却至0℃，并让其静置2小时。过滤混合物，并用冷乙酸乙酯洗涤。通过使用1-5％MeOH的CH2Cl2溶液的柱层析纯化，产生0.011g(12％)白色固体。MS m/z 478(M++23)，456(M++1)。

                           实施例20

                     4-氨基茚并吡啶19的制备

                (R1＝CO2Me；R4＝Me；R6＝Me；R7＝苯基)

    向4-氯茚并吡啶18(0.069g，0.240mmol)的10ml 2-乙氧基乙醇溶液中加入N-甲基苯胺(0.026g，0.240mmol)。将反应物回流加热96小时。冷却至室温后，浓缩所述溶液。通过柱层析纯化残余物，用己烷∶乙酸乙酯洗脱，产生0.029g(34％)橙色固体。MS m/z 359(M++1)。

                             实施例21

                 通过钯催化偶合制备4-氨基茚并吡啶19

                (R1＝CO2Me；R4＝Me；R6＝H；R7＝环戊基)

    将4-氯茚并吡啶18(0.100g，0.347mmol)、环戊胺(0.035g，0.416mmol)、乙酸钯(II)(0.004g，0.0017mmol)、2-(二叔丁基膦基)联苯基(0.010g，0.0035mmol)和碳酸铯(0.124g，0.382mmol)的10ml二噁烷溶液的混合物回流加热过夜。将反应物冷却至室温，用水稀释，并用乙酸乙酯(3×35ml)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，经Na2SO4干燥并浓缩。通过柱层析纯化残余物，用乙酸乙酯∶己烷洗脱。用乙醚溶解纯化的油状物，冷却至0℃。向该溶液中缓慢加入1.0M HCl的乙醚溶液。通过过滤分离产生的沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥，产生0.032g(25％)的黄色固体。MS m/z 359(M++23)，337(M++1)。

    按照以上概述的通用合成方法和实施例1-21，制备以下表1的化合物。

                                表1

    III.生物测定和活性

    基于以下原则：存在硫酸锌时线性核苷酸优先结合硅酸钇珠，按照同源SPA(闪烁亲近测定法)方式测定磷酸二酯酶活性。

    在该测定中，所述酶将放射性标记的环核苷酸(反应底物)转变为线性核苷酸(反应产物)，线性核苷酸经离子螯合选择性捕获在含闪烁体的珠上。放射性标记产物与珠表面结合导致能量转移到珠闪烁体，产生可定量检测的信号。未结合的放射性标记无法实现与闪烁体的紧密接近，因此不能产生任何信号。

    具体地说，用含有0.1％卵清蛋白的PDE缓冲液(50mM pH7.4Tris、8.3mM MgCl2、1.7mM EGTA)稀释酶，使得最终的信噪比(酶∶非酶)为5-10。用PDE(4、5、7A)缓冲液将底物(2，8-3H-cAMP或8-3H-cGMP，购自Amersham Pharmacia)稀释至1nCi/μl(或1μCi/ml)。对于每个测试孔，将48μl酶与47μl底物和5μl测试化合物(或DMSO)混合在白色Packard板中，接着振摇混合，于室温温育15分钟。将均匀悬浮的硅酸钇SPA珠的硫酸锌溶液以50μl等份加入每个孔，以终止反应并捕获产物。使用Topseal-S(Packard)片密封所述板，使珠自由沉降15-20分钟，然后在使用具有颜色猝灭校正的3H glassprogram的Packard TopCount闪烁计数器上计数。输出为已经以颜色猝灭校正的dpm。

    用100％DMSO稀释测试化合物，使其浓度为最终测定浓度的20倍。将单独的DMSO载体加入到未抑制的对照孔中。如下计算抑制(％)：

    非特异性结合(NSB)＝(底物+缓冲液+DMSO)孔的CPM平均值

    总结合(TB)＝(酶+底物+DMSO)孔的平均值

    表1列出的

    使用Deltagraph 4参数曲线拟合程序计算IC50值。以下表2列出了所示化合物对PDE 4、5和7A的IC50和抑制％数据。

                              表2