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1、10申请公布号CN104083381A43申请公布日20141008CN104083381A21申请号201410365971622申请日20140729A61K31/575200601A61P27/02200601A61P9/10200601A23L1/3020060171申请人上海中医药大学地址201203上海市浦东新区蔡伦路1200号72发明人季莉莉王峥涛余增洋盛雨辰张国庆74专利代理机构上海精晟知识产权代理有限公司31253代理人冯子玲54发明名称熊去氧胆酸的医药用途57摘要本发明涉及医药学领域，特别是涉及一种熊去氧胆酸的医药用途及其药物组合物。本发明的熊去氧胆酸可用于制备RF6A细胞。
2、增殖抑制剂。51INTCL权利要求书1页说明书9页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图3页10申请公布号CN104083381ACN104083381A1/1页21熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备RF6A细胞增殖抑制剂中的应用。2如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的RF6A细胞增殖由VEGF诱导产生。3熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备防治视网膜新生血管性疾病的药物或保健品中的应用。4熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备防治糖尿病性视网膜病变的药物或保健品中的应用。5如权利要求4所述的应用，其。
3、特征在于，所述的糖尿病性视网膜病变为增殖性糖尿病性视网膜病变。6熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备防治早产儿视网膜病变的药物或保健品中的应用。7熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备防治年龄相关性黄斑变性的药物或保健品中的应用。8如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的年龄相关性黄斑变性为湿性年龄相关性黄斑变性。9一种可抑制视网膜血管新生的药物组合物，其特征在于，它包含治疗有效量的熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药。10一种可抑制视网膜血管新生的保健品，其特征在于，它包含有效量的熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药。权利要求书CN10408338。
4、1A1/9页3熊去氧胆酸的医药用途技术领域0001本发明涉及医药保健品领域，特别是涉及一种熊去氧胆酸的医药用途及其药物组合物。背景技术0002视网膜新生血管性疾病是指因为视网膜内新生血管的生长，并伴随出血、渗出、增生等病理性的改变从而致盲的眼部疾病。目前，视网膜新生血管性疾病已经日渐成为世界范围内最严重的致盲性眼病之一，包括糖尿病性视网膜病变DIABETICRETINOPATHY，DR、早产儿视网膜病变RETINOPATHYOFPREMATURITY，ROP、年龄相关性黄斑变性AGERELATEDMACULARDEGENERATION，AMD、视网膜血管阻塞性疾病、视网膜静脉周围炎等。研究证实。
5、，血管内皮细胞的分化、增殖、迁移、微血管形成等活动是视网膜新生血管性疾病整个病理过程的中心环节，故而抑制血管内皮细胞增殖和新生血管生长是治疗这类疾病的关键。0003糖尿病性视网膜病变DIABETICRETINOPATHY，DR是糖尿病性微血管病变中最重要的表现之一，是一种具有特异性改变的眼底病变，是糖尿病的严重并发症之一。临床上根据是否出现视网膜新生血管为标志，将没有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为非增殖性糖尿病性视网膜病变NONPROLIFERATIVEDIABETICRETINOPATHY，NPDR或称单纯型或背景型，而将有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为增殖性糖尿病性。
6、视网膜病变PROLIFERATIVEDIABETICRETINOPATHY，PDR。0004早产儿视网膜病变RETINOPATHYOFPREMATURITY，ROP是由于新生儿的视网膜血管异常增殖所致的一类疾病，与早产、低出生体重、接受氧疗等因素有关。常见于出生后36周，临床上分成活动期及纤维膜形成期。早产儿视网膜病变的治疗主要依靠外科手术以及新生血管抑制剂等内科治疗。0005年龄相关性黄斑变性AGERELATEDMACULARDEGENERATION，AMD又称老年性黄斑变性，为黄斑区结构的衰老性改变。主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余。
7、小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，沉积于BRUCH膜，形成玻璃膜疣。玻璃膜疣继而引起BRUCH膜本断裂，脉络膜毛细血管通过破裂的BRUCH膜进入RPE下及视网膜神经上皮下，形成脉络膜新生血管。由于新生血管壁的结构异常，导致血管的渗漏和出血，进而引发一系列的继发性病理改变。年龄相关性黄斑变性大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高，是当前老年人致盲的重要疾病。本病在临床上分为干性与湿性两型。湿性年龄相关性黄斑变性的特点是色素上皮层下有活跃的新生血管，从而引起一系列渗出、出血、瘢痕改变。0006熊去氧胆酸URSODEOXYCHOLICACID,UDCA是从中药熊胆中分离的活性成分之。
8、一，为胆甾酸类化合物，即3，7二羟基5胆烷酸。国内外研究表明，熊去氧胆酸具有溶解胆结石的作用，且具有毒性小、剂量小的优点。是70年代以来治疗胆固醇型胆结石的有效药物。近年发现尚有降血脂、降血糖、镇痉、抗惊厥、溶血和脂酶促进作用。临床用于说明书CN104083381A2/9页4胆石症、急慢性肝炎、胆囊炎、胆管炎等疾病的治疗。发明内容0007本发明的目的旨在提供一种熊去氧胆酸的新的医药用途及其药物组合物。0008具体地说，本发明的第一方面是提供了熊去氧胆酸在制备RF6A细胞增殖抑制剂中的应用。0009在一优选例中，所述的RF6A细胞增殖由VEGF诱导产生。0010本发明的第二方面是提供了熊去氧胆酸。
9、在制备防治视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。0011本发明的第三方面是提供了熊去氧胆酸在制备防治糖尿病性视网膜病变的药物中的应用。0012在一优选例中，所述的糖尿病性视网膜病变为增殖性糖尿病性视网膜病变。0013本发明的第四方面是提供了熊去氧胆酸在制备防治早产儿视网膜病变的药物中的应用。0014本发明的第五方面是提供了熊去氧胆酸在制备防治年龄相关性黄斑变性的药物中的应用。0015在一优选例中，所述的年龄相关性黄斑变性为湿性年龄相关性黄斑变性。0016本发明的第六方面是提供了一种可抑制视网膜血管新生的药物组合物，它包含治疗有效量的熊去氧胆酸。0017本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽。
10、描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。附图说明0018图1CD31检测UDCA对STZ诱导DR小鼠及正常小鼠视网膜中新生血管的作用。视网膜局部放大图100。0019A正常对照组B糖尿病视网膜病模型组CUDCA1MG/KGDUDCA10MG/KG,E血管计数统计图DATAMEANSSEM，N68，与CONTROL组比较P0001，与DRMODEL组比较P0001。0020图2CD31检测UDCA对OIR小鼠视网膜中新生血管的作用。视网膜局部放大图100。A正常对照组BOIR模型组CUDCA10MG/KGDUDCA40MG/KGE血管计数统计图DATAMEANSSE。
11、M，N68，与CONTROL组比较P0001，与OIRMODEL组比较P0001。图3伊文思蓝EVANSBLUE检测UDCA对视网膜组织中血管渗漏的影响。DATAMEANSSEM，N68，与CONTROL组比较P0001，与OIRMODEL组比较P0001。具体实施方式0021本发明的问世部分是基于这样一个意外发现熊去氧胆酸UDCA可以显著抑制VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞RF6A的增殖。因此，上述化合物可有望开发成为一种抑制RF6A细胞增殖的物质即RF6A细胞增殖抑制剂。如本领域的技术人员所知，所述的“RF6A细胞增殖抑制剂”可以是各种形式的物质，包括但不限于药物、保健品等。进而，说明书C。
12、N104083381A3/9页5用熊去氧胆酸制备的“RF6A细胞增殖抑制剂”可用于防治各种视网膜新生血管性疾病，这些疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病变DIABETICRETINOPATHY，DR、早产儿视网膜病变RETINOPATHYOFPREMATURITY，ROP、年龄相关性黄斑变性AGERELATEDMACULARDEGENERATION，AMD、视网膜血管阻塞性疾病以及视网膜静脉周围炎等。0022进而，本发明的第一方面是提供了熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备RF6A细胞增殖抑制剂中的应用。0023较优选地，所述的RF6A细胞增殖由VEGF诱导产生。0024本发明的第二。
13、方面是提供了熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备防治视网膜新生血管性疾病的药物或保健品中的应用。0025本发明的第三方面是提供了熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备防治糖尿病性视网膜病变的药物或保健品中的应用。0026较优选地，所述的糖尿病性视网膜病变为增殖性糖尿病性视网膜病变。0027本发明的第四方面是提供了熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备防治早产儿视网膜病变的药物或保健品中的应用。0028本发明的第五方面是提供了熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备防治年龄相关性黄斑变性的药物或保健品中的应用。0029较优选地，所述的年龄相关性黄斑。
14、变性为湿性年龄相关性黄斑变性。0030本发明的第六方面是提供了一种可抑制视网膜血管新生的药物组合物，它包含治疗有效量的熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药。0031本发明还提供了一种可抑制视网膜血管新生的保健品，它包含有效量的熊去氧胆酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药。0032如本领域的技术人员所知，本发明的熊去氧胆酸UDCA具有如下结构通式00330034分子式C24H40O4分子量392580035本发明还包括上述化合物的相应的所有药学上可以接受的盐、水合物或前药。这些盐可以由化合物中带正电荷的部分例如，胺基与具有相反电性的带负电荷例如，三氟醋酸形成；或者由化合物中带负电荷的部分。
15、例如，羧基与正电荷例如，钠、钾、钙、镁形成。化合物可以含有一个非芳香性的双键，具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。所有这些异构体都是可预期的。所述的“熊去氧胆酸的前药”通常指一种物质，当用适当的方法施用后，可在受试者体内进行代谢或化学反应而转变成熊去氧胆酸或其盐。0036本发明的熊去氧胆酸可通过商业途径从SIGMA公司等处购买获得，其纯度均符合说明书CN104083381A4/9页6药用标准。或者利用市售原料，通过现有技术中传统的化合物合成方法合成获得。本领域的普通技术人员根据现有公知。
16、技术可以合成本发明的化合物。合成的化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。0037合成化学改造、保护官能团方法学保护或去保护对合成应用化合物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，如RLAROCK,COMPREHENSIVEORGANICTRANSFORMATIONS,VCHPUBLISHERS1989；TWGREENEANDPGMWUTS,PROTECTIVEGROUPSINORGANICSYNTHESIS,3RDED,JOHNWILEYANDSONS1999；LFIESERANDMFIESER,FIESERANDFIESERSREAGENTSFORORGANI。
17、CSYNTHESIS,JOHNWILEYANDSONS1994；ANDLPAQUETTE,ED,ENCYCLOPEDIAOFREAGENTSFORORGANICSYNTHESIS,JOHNWILEYANDSONS1995中都有公开。0038以将本发明的熊去氧胆酸制成药物为例。本发明的熊去氧胆酸可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的熊去氧胆酸及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有01999重量百分比的作为活性成分的本发明的熊去氧胆酸。“可药用载体”不会破坏本发明的熊去氧胆酸的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。0039所述可。
18、药用载体包括但不限于软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。0040其他常用的药物辅料如粘合剂如微晶纤维素、填充剂如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒、崩解剂如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、润滑剂如硬脂酸镁以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。0041本发明的熊去氧胆酸以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径。
19、给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。0042本发明的熊去氧胆酸以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经肌肉或皮下、静脉、尿道、阴道等。0043下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。0044除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
20、。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。0045本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似说明书CN104083381A5/9页7特征的一般性例子。0046实施例1熊去氧胆酸体外抑制视网膜血管新生的活性0047血管内皮细胞的增殖、迁移、管腔形成是体外评价血管新生的主要实验方法。我们在恒河猴视网膜血管内皮细胞RF/6A细胞上，观察了熊去氧胆酸。
21、对重要的促血管因子血管内皮生长因子VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR,VEGF促进血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。在VEGF诱导的RF/6A细胞增殖实验中，熊去氧胆酸10M，25M能显著抑制VEGF诱导的RF/6A细胞增殖，而对静息期的RF/6A细胞没有明显的影响。熊去氧胆酸25M，5M，10M，25M都可以明显抑制VEGF诱导的RF/6A细胞迁移。熊去氧胆酸25M，5M，10M，25M都可以明显抑制VEGF诱导的RF/6A细胞的管腔形成。由此可见，熊去氧胆酸在体外可以抑制由VEGF诱导的视网膜血管新生，而VEGF是参与调控视网膜血管新生的最主要的促血管新生。
22、因子。004811实验材料0049111细胞0050RF6A细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。0051112药物0052熊去氧胆酸购自美国SIGMA公司，纯度99以上。0053113试剂0054明胶和溴化34,5二甲基噻唑22,5二甲苯基四氮唑MTT购自美国SIGMA公司，胎牛血清FBS、MATRIGEL、RPMI1640培养液、025胰蛋白酶购自美国INVITROGEN公司。血管内皮生长因子VEGF购自美国PEPROTECH公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。005512实验方法0056121药物配制0057熊去氧胆酸用二甲基亚枫DMSO溶解，配成母液浓度为01MOL/。
23、L，母液均用一次性灭菌滤器022M过滤灭菌。加药时用无血清RPMI1640培养基配制所需的5个浓度，使DMSO在培养中总浓度不超过01。0058122熊去氧胆酸抑制VEGF诱导的RF/6A细胞增殖实验0059取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，按一定的浓度铺入96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时，弃原培养基，换含1胎牛血清的RPMI1640培养基，加入待测药物15分钟后，加入血管内皮生长因子VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR,VEGF与细胞共孵48小时后，加入10LMTT终浓度05MG/ML置培养箱反应4小时，加入50L三联剂10SDS5异丁醇001MHCL于培。
24、养箱中充分溶解12小时以上，最后在OD570/630NM处测定吸光值。细胞存活率给药组OD570NM630NM/对照组OD570NM630NM100，对照组加含等量DMSO的细胞培养液而不加任何药物。0060123迁移实验0061TRANSWELL小室用01明胶包被1H后，取出晾干，将消化好的RF/6A细胞用无血清培液洗3次，稀释为4105/ML，于上室加入100UL4104CELLS/WELL细胞悬液。下室加入600L的无血清培液，并加入VEGF10NG/ML，穿膜8小时。吸去上下室培液，以44多聚甲醛室温固定30MIN，用棉签擦去内室上层未迁移细胞，01结晶紫常温染色10MIN。说明书CN。
25、104083381A6/9页8以PBS漂洗多余染。显微镜下拍照并计数，最后用10乙酸100UL/孔抽提10MIN，用酶标仪600NM下测定OD值。0062124管腔形成实验006396孔板每孔铺上冷的液体基质胶30L，在37下固化45分钟。每孔加100L细胞悬液1104CELLS/WELL同时加不同浓度的药物或对照，孵育4小时。用倒置差像显微镜记录图像，计算完整的管腔形成数。0064125统计学处理0065实验数据均用平均值标准误表示，采用SPSS115统计软件进行分析，以ONEWAYANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P005为具有统计学显著性差异标准。006613实验结果00。
26、67131熊去氧胆酸UDCA对血管内皮生长因子VEGF诱导RF/6A细胞增殖的影响0068由表1可见，UDCA于5M浓度开始均能够显著性地抑制VEGF诱导RF/6A细胞的增殖，并呈剂量依赖性。0069表1UDCA对VEGF诱导RF/6A细胞增殖的抑制率N1000700071与溶媒组比较，P0001；0072132熊去氧胆酸UDCA对VEGF诱导RF/6A细胞迁移的影响0073由表2可见，UDCA于5M开始均能够明显性地抑制VEGF诱导RF/6A细胞的迁移，并呈剂量依赖性。0074表2UDCA对VEGF诱导RF/6A细胞迁移的影响N600750076与溶媒组比较，P001；P0001；00771。
27、33熊去氧胆酸UDCA对VEGF诱导RF/6A细胞管腔形成的影响0078由表3可见，UDCA于2M开始均能够明显性地抑制VEGF诱导RF/6A细胞的管腔说明书CN104083381A7/9页9形成，并呈剂量依赖性。0079表3UDCA对VEGF诱导RF/6A细胞管腔形成的影响N600800081与溶媒组比较，P00010082实施例2熊去氧胆酸改善糖尿病视网膜病药效活性008321实验材料0084211动物0085SPF级C57小鼠，雄性，体重1824G，购自中国科学院上海实验动物中心。动物合格证编号SCXK沪20120002。饲养于上海中医药大学SPF级动物房，饲养一周后使用。饲养条件为温度。
28、221，湿度555，12小时光暗循环，饲料与水消毒后自由摄取。实验严格按照国家和上海中医药大学动物中心动物使用管理条例进行。0086212药物的配制0087取适量熊去氧胆酸URSODEOXYCHOLICACID,UDCA溶于DMSO中，配制成01M的母液，用生理盐水稀释后腹腔注射给药，浓度为1MG/KG和10MG/KG008822实验方法0089221动物实验00901将01M柠檬酸溶液与柠檬酸三钠溶液以1411的比例混匀，调混合液PH至4345，待用。称取适量STZ粉末，避光溶解，使之成为55MG/ML的溶液，立即给予已禁食12H的小鼠腹腔注射，01ML/10G，最终给予STZ的剂量为55M。
29、G/KG，连续给药5天。00912末次给药一周后用割尾法测小鼠血糖浓度，血糖值167MMOL/L250MG/DL视为造模成功。将造模成功的小鼠随机分为3组DR模型组DRMODEL组、UDCA1MG/KG组、UDCA10MG/KG组，每组10只。另外未IPSTZ的10只正常C57小鼠作为正常组CONTROL组。每两周检测体重变化，每月检测血糖变化。00923造模成功2个月后开始给药，腹腔注射，01ML/10G，UDCA1MG/KG组、UDCA10MG/KG组分别给予不同浓度的UDCA溶液，终剂量分别为1MG/KG，10MG/KG，MODEL组给予同体积的溶媒对照，给药2个月后处死，取视网膜观察视。
30、网膜新生血管情况。0093222视网膜铺片CD31免疫荧光检测熊去氧胆酸URSODEOXYCHOLICACID,UDCA对糖尿病视网膜病小鼠视网膜血管新生治疗情况00941视网膜分离将处死后小鼠的眼球取下，固定于4多聚甲醛INPBS中，4过夜。在解剖镜下将视网膜剥离，PBS中略漂洗34次。00952封闭将漂洗后的视网膜放入装有BLOCKINGBUFFER5BSA，05TRIXTONX100INPBS的15MLEPP管中，常温摇床慢摇孵育3H。00963一抗孵育将封闭好的视网膜放于CD31一抗反应液中抗体1200稀释，抗说明书CN104083381A8/9页10体稀释液为1BSA，05TRIXT。
31、ONX100INPBS，4摇床慢摇孵育12天。00974洗涤一抗以WASHBUFFER05TRIXTONX100INPBS在室温下摇床上清洗6次，每次20MIN。00985二抗孵育将视网膜封入含FITCCONJUGATEDANTIRATIGG的二抗反应液中1200稀释，室温避光孵育2H。00996洗涤二抗以WASHBUFFER05TRIXTONX100INPBS在室温下摇床上避光清洗6次，每次20MIN。01007封片在解剖镜下将视网膜铺于载玻片上，剪开成花瓣状，滴加数滴抗荧光猝灭剂，以GELATINMOUTINSOLUTION2G/MLGELATIN封片，盖上盖玻片。01018拍照将视网膜免。
32、疫荧光铺片稍晾干后于荧光显微镜下拍照，观察视网膜中血管新生情况。01029血管密度计数选取CD31免疫荧光照片200，每个组选35张照片，计算照片中心点横竖对称轴上的血管数目作为血管密度。0103223数据分析0104数据结果以MEANSSE表示。实验数据采用SPASS160软件统计，两两比较采用独立样本T检验。P005时认为具有统计学显著性差异。010523实验结果0106231熊去氧胆酸URSODEOXYCHOLICACID,UDCA对糖尿病小鼠血糖和体重的影响0107从表4可见，UDCA各剂量组均不能改善糖尿病小鼠体重的减轻，也不能降低升高的血糖，说明UDCA没有改善糖尿病的药效活性。0。
33、108表4UDCA对糖尿病小鼠血糖和体重的影响01090110P0001与正常相比0111232熊去氧胆酸URSODEOXYCHOLICACID,UDCA对糖尿病小鼠视网膜血管新生的影响0112从图1可见，糖尿病小鼠视网膜中血管明显新生，而UDCA各剂量组可以明显降低视网膜的血管新生。提示UDCA可以抑制促血管生长因子的释放，抑制视网膜的血管新生，从而改善糖尿病视网膜病。0113实施例3熊去氧胆酸改善氧诱导新生小鼠视网膜病变的药效活性011431实验材料0115311动物0116SPF级C57BL小鼠，雌雄各5只，8周龄，购自中国科学院上海实验动物中心合格证号SCXK沪20120002。饲养于。
34、上海中医药大学动物实验中心，雌雄随机组合为5对说明书CN104083381A109/9页11进行繁殖，温度221，湿度555，饲料与水消毒后自由摄取，12小时光暗循环。实验严格按照国家和上海中医药大学动物中心动物使用管理条例进行。011732实验方法0118321药物的配制0119取适量UDCA溶于DMSO中，配制成01M的母液，用生理盐水稀释后腹腔注射给药，浓度为20MG/KG。0120322OIR模型建立0121C57BL小鼠出生后第7天P7，随机分为正常组与缺氧组，每组10只。正常组小鼠饲养于正常氧环境中；缺氧组小鼠饲养于755氧分压氧舱中，高氧环境5天后即第12天返回至正常氧环境中，继。
35、续饲养5天至第17天P17，期间每天腹腔注射给药，连续给药5天。0122323视网膜免疫荧光铺片0123取P17天小鼠处死，摘取眼球，于4多聚甲醛INPBS中4固定过夜，于解剖显微镜下，用虹膜剪缘角膜边缘剪开，移除晶状体和玻璃体，取出完整视网膜，PBS洗23次，BLOCKINGBUFFER5BSA，05TRIXTONX100INPBS封闭2小时，与CD31抗体于4孵育2天，WASHBUFFER05TRIXTONX100INPBS洗6次，与二抗避光孵育2小时，WASHBUFFER洗6次，剪视网膜成花瓣状，平铺于载玻片上，明胶2G/ML固定并封片，于荧光显微镜下观察并拍照。0124324视网膜渗漏。
36、实验0125取P17天小鼠，腹腔注射2伊文思蓝EVANSBLUEIN生理盐水,10UL/G体重，循环2H；剖开胸腔，左心室灌洗生理盐水37；摘取眼球，解剖显微镜下分离出视网膜；视网膜组织于55，真空干燥5H后称干重；加入120ULFORMAMIDE，70水浴18H；取上清，离心10000G，10MIN；取上清60UL，于酶标仪620NM检测；减去FORMAMIDE对照孔检测值，带入EVANSBLUE标准吸收曲线；结果除以视网膜组织干重，即EVANSBLUE渗漏值NG/G。0126325数据分析0127数据结果以MEANSSE表示。实验数据采用SPASS160软件统计，两两比较采用独立样本T检验。
37、。P005时认为具有统计学显著性差异。012833实验结果0129331UDCA对氧诱导新生小鼠视网膜血管新生的影响0130从图2可见，OIR模型组小鼠视网膜有大量血管新生，而给予UDCA后增生的血管明显减少。提示UDCA可以抑制OIR模型组小鼠视网膜血管新生，从而改善早产儿视网膜病变。0131332UDCA对氧诱导新生小鼠视网膜血管渗漏的影响0132从图3可见，OIR模型组小鼠视网膜有大量伊文思蓝EVANSBLUE从血管中渗漏出来，而给予UDCA后渗漏的伊文思蓝EVANSBLUE明显减少。提示UDCA可以抑制OIR模型组小鼠中已经升高的血管通透性，从而改善早产儿视网膜病变。0133本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。说明书CN104083381A111/3页12图1说明书附图CN104083381A122/3页13图2说明书附图CN104083381A133/3页14图3说明书附图CN104083381A14。