免疫球蛋白是糖蛋白，即，它们是带有连在不同部位上的寡糖的蛋白质。这些寡糖上的邻二醇可以被高碘酸盐氧化产生二醛。产生的醛基可以和各种胺和肼反应，形成希夫碱和腙。例如，Willan等人在《欧洲生化学会联合会快报》（FEBS letters）80 133（1977）中氧化一个在兔的IgG的CH2区中与第297位天门冬酰胺残基相连的寡糖。（此位置采用人体IgGl骨髓瘤蛋白Eu的编号系统）这个氧化了的物质，在纯化后，与4-氨基-2，2，6，6-四甲基-哌啶-1-烃氧基自由基反应，产生的亚胺（氨基和糖上的醛基反应）用NaBH3CN还原产生一个自旋标记的蛋白质。Timofeev等人在《欧洲生化学会联合会快报》89 191（1978）中也用氧化了的糖蛋白单克隆抗体来制备自旋标记的物质。Murayama等人在《免疫学化学》（Immunochemistry）15 523（1978）将高碘酸盐氧化了的一个免疫球蛋白（IgG）中的寡糖与含氨基的化合物通过形成希夫碱进行标记。天门冬氨酸和辣根过氧化物酶是所用的“胺”。天门冬氨酸-希夫碱通过逆流免疫电泳可用于检测人体IgG的抗原性。O′Shannessy等人在《免疫学快报》（Immunology letters）8 273（1984）中将生物素酰肼化物和氧化了的免疫球蛋白的醛基偶连，并建议采用将荧光染料偶连到单克隆抗体的技术。 Chua等人在《生物化学和生物物理学报》（Biochimica and Biophysica Acta）800 291（1984）中氧化了IgM的重链地稳定区的糖基（此区有较高的糖含量）产生醛。这些醛基和连在脂质体膜上的酰肼基团反应。该单克隆IgM抗体对于带有1-二甲氨基萘-5-磺酰基半抗原的蛋白质具有特异性。
Rothfus等人在《生物化学杂志》（J.B.C.）238 1402（1963）中用高碘酸盐氧化然后用硼氢化物还原的方法来测定人体γ-球蛋白糖肽的糖成分的一致性。
Blair等人在《免疫学方法杂志》（J.Immun.Meth.）59 129（1983），和Ghose，Blair，Kulkarni在《酶学方法》（Methods in Enzymology）93 280（1983）中综述了将细胞毒试剂连接到免疫球蛋白上的方法。Blair等人在130页，揭示了将细胞毒试剂连接到一个Ig上的寡糖上的可能性。但未提及氧化成醛并将细胞毒试剂与醛偶连。Ghose等人提到了将兔子的连有寡糖的抗牛血清白蛋白IgG用高碘酸盐氧化成醛基并将这些基团和乙二胺反应，然后硼氢物还原该希夫碱形成新的连在糖蛋白上寡糖部分上的氨乙基一级胺。
《欧洲专利申请公报》（EPO Application Publication）88695广泛地叙述了一些诸如上述文章所描述的方法，即从糖部分氧化衍生出来的醛基与一种化合物的肼、酰肼或氨基这些连接基团反应来形成结合物。这份申请很显然是针对连接基的，这些连接基可以和醛-抗体结合，并且连接基本身连到一种不溶性的支持剂或次级化合物上。也对抗体结合物申请专利权，这些抗体结合物包括任一通过共价的腙、亚胺或烯胺键结合在抗体糖基上的化合物。更专门的权利要求是针对肽连接基团，一种氨基酸连接基团或具有通式为W（CH2）nQ的连接基团，其中W为C6H5NHCH2-或-CH2-，Q为氨基酸、肽、螯合剂或螯合剂衍生物。明确地公开用这种系统以进行抗体中介输送的药物包括柔红霉素、博来霉素、长春碱（VLB）、长春新碱及5-氟尿嘧啶。但未指明这些药物是如何连接的。特别是没有指明长春碱或长春新碱是如何连接的，因为这两个化合物中任何一个都不含有酰肼或氨基官能团。它强调了与Fab抗体片段的偶连。但具体公开的只限于ALKERAN（N-〔双（β-氯乙基）苯基〕丙氨酸）和抗羊红细胞的单克隆抗体的结合。没有提供在体内的数据。
进一步地，长春碱、长春新碱和其它抗肿瘤药也已经连到免疫球蛋白或其它蛋白质上。
英国专利申请G.B.2 090 837A公开了免疫球蛋白通过形成酰胺共价键连接到长春花生物碱部分。酰胺键本身通过长春花中吲哚-二氢吲哚生物碱（诸如4-去乙酰基-长春碱）经C-3羧酰叠氮基与免疫球蛋白或其片段的游离氨基反应来形成。叠氮化物是由4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼制备，而后者又是通过长春碱与肼反应而得。在长春花生物碱部分和免疫球蛋白之间形成的共价键一般是不可逆的，即这个键在生理pH条件下不被水解（化学上）。
美国专利4 203 898（CullinanⅠ）公开并申请了长春花吲哚-二氢吲哚生物碱诸如长春碱，长春新碱等的3-羧酰叠氮化合物的专利。正是这些叠氮化物在上述文献中用于制备共价键结合到免疫球蛋白的结合物。叠氮化物从吲哚-二氢吲哚生物碱的4-去乙酰基-3-羧酰肼制得，这些酰肼物也已被公开并申请了专利。
美国专利4 166 810（Cullinan Ⅱ）公开了一组4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼的衍生物，包括N2-烷基衍生物。这些化合物是通过将N2-氨基与醛基或酮基反应形成腙，然后再还原生成的烯胺来制得。
Neuss等人在Tetrahedron Letters 783（1968）中公开了环氧长春碱的酰肼化物。
Barnett等人在J.Med.Chem.21 88（1978）中也公开了长春碱和相关的吲哚-二氢吲哚衍生物的酰肼。
Conrad等人在同杂志22，391（1978）中一般性地讨论了长春碱的酰胺和它们作为抗肿瘤药的活性。而与Cullinan Ⅰ有关系的上面讨论的相同酰胺也已公开。另外，制得了桥二硫化物，其中，羧酰氨基团连接到乙基二硫乙基羧酰胺（ethyldithioethyl carboxamide）基团上。也还公开了对长春碱和长春新碱的放射免疫分析。放射免疫分析是通过将4-去乙酰基-长春花酸叠氮化物（4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰叠氮）结合到牛血清蛋白上来进行的。这个抗原用来制备兔体内的抗体，这个抗体就将结合在抗原的长春碱部分。抗原的数量可由氚标记的长春碱来测定。参见Root等人的文章F.A C.S.S.，2nd National Meeting，10月6-10日，1975，摘要183。
Hargrove在美国专利3 392 173和3 387 001中公开了一个新颖的长春碱、长春新碱、异长春碱等的C-4酯，在这些酯中有氯乙酸酯。这一衍生物在欧洲专利EPO 124 502中用于和蛋白质结合。HargroveⅡ将这个4-氯乙酸酯和氨基反应制得，例如，N，N-二甲基甘氨酸酯-vinglycinate。
Langone等人在Anal.Biochem.，95 214（1979）中发展了对长春碱和长春新碱的放射免疫分析的方法。所用的抗原是通过氧化长春碱至二羧酸，然后用碳化二亚胺偶连试剂将其结合到蛋白质上来制得。
Teale等人在Brit.J.Clin.Pharm.4 169（1977）中也发展了对长春碱和长春新碱的放射免疫分析的方法。长春花生物碱通过用蛋白质（牛血清白蛋白）中的一个胺基基团、甲醛和长春碱进行曼尼希反应而结合到白蛋白上。但并未说明长春花生物碱，长春碱或长春新碱的连接点。
Johnson等人在Brit.J.Can.44 372（1981）中公开了将长春碱酰胺通过叠氮化物连到抗-癌胚抗原免疫球蛋白上的制备方法。应该强调从去乙酰基长春碱而得的叠氮化物和长春碱酰胺的叠氮化物的同类物质是等同的，因为这些化合物的区别只在于C-3羧酸部分，而且这一部分（酯或酰胺）在偶连反应后消失了。这些结合物在体外实验发现对人体肿瘤细胞是有细胞毒性的，在英国专利申请G.B.2、090 837中，发明者Rowland和Simmonds也报道了同一主题内容。
Rowland等人在Cancer Immunolgy and Immunotherapy 19 1（1985）中讨论了长春碱酰胺-单克隆抗体结合物的抗癌性（4-去乙酰基-长春碱衍生物，是通过C-3-羧酰叠氮偶连的，与英国专利2 090 837A和Johnson等的相同）。试验了四个结合物对于在无胸腺小鼠身上人体肿瘤组织的异种移植物的活性，所有结合物都显示了某些抗肿瘤活性，而长春碱酰胺在无毒水平下对于同一肿瘤组织是无活性的。
欧洲专利EPO 124502包括了从免疫球蛋白和4-去乙酰基-长春碱或长春碱酰胺或其它4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰胺通过4-丁二酸酯结合制得的结合物，即，在4-羟基和蛋白质之间存在着桥基或连接基团。桥基的结构可以是-CO-CH2-（从4-氯乙酰基而来）或-CO（CH2）nCO-（从丁二酸或戊二酸而来）。相同的4-丁二酰衍生物也公开在英国专利申请GB2 137 202，而由此制得的结合物也公开在GB2 137 210。
Bumol等人在Proc.Am.Assn.Cancer Research 25 356，摘要1410（1984）（BumolⅠ）中讨论了根据GB2 137 210制得的结合物（即4-去乙酰基-4-丁二酰基-长春碱与人体腺癌单克隆抗体（KS1/4）的结合物的性质。Bumol等人在Federation Proceedings 44 1864，摘要8484，（1985）（BumolⅡ）中讨论了一个类似的和人体黑素瘤的单克隆抗体相结合的结合物。Bumol等人在J.Cellular Biochemistry补编9A摘要0124（1985）（BumolⅢ）中讨论了关于4-去乙酰基-4-丁二酰基-长春碱KS1/4结合物（腺癌）的进一步的工作。
但上述文献中没有一个公开或建议将一个抗肿瘤的二聚吲哚-二氢吲哚生物碱的胺或肼衍生物结合到单克隆抗体表面上的一个氧化了的糖（氧化成一个或多个醛基）上，而此单克隆抗体也是糖蛋白。
本发明提供了将一氧化了的糖蛋白（它含有一个或多个醛基）与长春花生物碱的酰肼物反应形成的结合物。这个酰肼基可以是C-3-羧酰肼（下面分子式Ⅰ中的-COR）或C-4通过烃链相连的含酰肼的酯（下面定义的R6）。
结合物的长春花生物碱部分用下面的分子式Ⅰ描述。本发明的结合物是通过氧化了的糖蛋白的醛基和具有结构Ⅰ的化合物反应而得，
其中，R2是H，CH3或CHO;当R4和R5单独考虑时，R5是H，R3和R4之一是乙基，而另一个是H或OH;当R4和R5和与它们相连的碳一起考虑时，它们形成一个环氧乙烷环，R3为乙基;R是-NHNH2，
-O（C1-3烷基），-NH2，-NH（C1-3烷基），-NH-CH2CH2-Y，1-吡咯烷基或1-哌啶基，其中，n值为2-4，Y是-Cl，-OCH3或-SCH3;R1是H，（C1-3烷基）-CO，氯代（C1-3烷基）-CO或R6，其中R6是-COXCONHNH2，这里X是C1-4的直链亚烷基，C2-3的支链亚烷基，C2-4的亚链烯基，C3-4的亚链炔基，C3-6的亚环烷基，亚苯基，羟基取代的C1-4亚烷基，或一个直接的键，只是当R1是R6时，R不能是-NHNH2，而当R是-NHNH2时，R1不能是R6。
上述分子式中X的说明性例子包括：亚甲基、亚乙基、1，2-亚丙基、亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基，亚丁烯基，亚丁炔基，亚丙炔基，羟亚乙基，1，2-二羟亚乙基，1，2-二甲基亚乙基，1，2，3，4-四羟亚丁基，3，4-二甲基亚丁基、1，4-亚环己基，1，4-亚苯基，1，2-亚苯基等等。
在制备酰肼中间体（以形成本发明的结合物）时用的吲哚-二氢吲哚生物碱可用式Ⅱ表示：
其中，R2，R3，R4和R5具有前述的定义。
在上面的式Ⅱ中，R2是甲基，R3是羟基，R4是乙基，R5是H，则此为长春碱;R2为甲酰基，R3为羟基，R4是乙基，R5是H，则为长春新碱;R2是甲基，R3是乙基，R4是羟基，R5是H，则为异长春碱;R2是甲基或甲酰基，R3是乙基，R4和R5与相连的碳一起形成α-环氧环，则分别为环氧长春碱和甲酰白诺生（leuroformine）;当R2是甲基，R3是乙基，R4和R5是H，则为去氧长春碱“B”（4′-去氧异长春碱或4′-表去氧长春碱）;当R2为甲基，R4为乙基，R3和R5为H，则为去氧长春碱“A”或4′-去氧长春碱;当R2是CHO，R3是乙基，R4和R5是H，则为4′-表去氧长春新碱（1-甲酰基-1-去甲基-4′-去氧异长春碱）。
对于母体长春花生物碱（Ⅱ）的文献如下：环氧长春碱（美国专利，第3 370 057号），长春碱（美国专利第3 097 137号），异长春碱和长春新碱（美国专利第3 205 220号），去甲长春碱（美国专利第3 354 163号），4′-表长春新碱（美国专利第4 143 041号），甲酰白诺生、环氧长春新碱（美国专利第4 279 816号），去氧长春碱“A”和“B”〔Tetrahedron Letters，783（1958）〕。
对形成本发明的结合物有用的酰肼可有不同的方法。这取决于酰肼连在C-3还是C-4上。C-3酰肼可按美国专利4 203 898，12栏，65行以下部分和18栏，例3的操作合成。在此操作中，无水肼和分子式Ⅱ的长春花生物碱在封管内、乙醇中约60℃下反应，反应的产物是4-去乙酰基-3-羧酰肼，这是由于C-4的乙酰氧基在碱性反应条件下水解。如果需要制备在C-4位的酯，（在Ⅰ中R1为（C1-3烷基）-CO或氯代（C1-3烷基）-CO），按照式Ⅰ，R1为H的C-3羧酰肼首先通过与丙酮反应形成N2-亚丙基衍生物来保护。在酰肼的可酰化氨基被有效保护以防酰化后，这个“保护了”的衍生物即可按常规方法用酰卤（例如氯代乙酰氯）或酸酐（如丙酸酐）酰化。然后，保护基团可用酸处理除去。若酰化象一般那样也发生在C-3位羟基上，这个C-3酰基可以通过用湿硅胶处理优先除去。-参见Hargrove美国专利3 392 173。
当酰肼是C-4链上的一部分（即在前述式Ⅰ中R6的一部分）时，4-去乙酰基的起始物可按如下方法制备，取决于C-3基团的性质：当C-3是酯基时，4-去乙酰基衍生物用Hargrove步骤来制备，美国专利3 392 173例1-5;当C-3是酰胺基时，4-去乙酰基物用Conrad等人在前述文章中或Cullinan在美国专利4 203 898中的步骤来制。这一操作步骤涉及到C-3酰肼的制备并伴随着C-4位的水解。酰肼然后转化为叠氮化物，后者与氨或具有结构式NH2-（C1-3烷基）的一级胺或NH2-CH2CH2SCH3，NH2CH2OCH3，吡咯烷、哌啶或NH2CH2CH2Cl反应。制备该最后的化合物氯乙基酰胺，以产生所需的C-3-甲酰胺-C-4-羟基衍生物的优选方法是，通过分解上述式Ⅱ长春花生物碱3″-（β-氯乙基）-3-螺-5″-噁唑烷-2″，4″-二酮，这些噁唑烷二酮衍生物的制备由Miller和Gutowski提出，（美国专利RE30 560）。从上述的噁唑烷二酮制备β-氯乙基酰胺由Miller和Gutowski在美国专利4 357 334的例1中陈述（同一专利的例2经典的叠氮化物方法制备了相同的β-氯乙基酰胺）。一级酰胺（在分子式Ⅰ中，R为-NH2）也可以直接通过氨解或用阮内镍还原酰肼来制备，-参见美国专利4 203 898。最后，当分子式Ⅰ中R为
这里，n为2-4，即分别为环丁二酰亚胺，戊二酰亚胺，己二酰亚胺，4-羟基衍生物用Cullinan在共同未决的专利申请系列号745 562中提出的方法制备（此号相当于公布的欧洲专利申请第86304522.5号）
下列列举了一些具分子式Ⅰ的可用于本发明的长春花生物碱衍生物，及它们在文献中的俗名：
4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼（分子式Ⅰ，R＝NHNH2;R1＝R5＝氢;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基），
4-去乙酰基-长春碱-4-半丁二酸酯酰肼（R＝OCH3;R1＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢），
4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺-4-半丁二酸酯酰肼（;R1＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢），
4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰胺-4-半丁二酸酯酰肼（R＝NH2;R1＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢），
4-去乙酰基-长春碱-4-半戊二酸酯酰肼（R＝OCH3;R1＝COCH2CH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）
4-去乙酰基-长春新碱-4-半丁二酸酯酰肼（R＝OCH3;R1＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝CHO;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢），
4-去乙酰基-4′-表去氧-长春碱-半丁二酸酯酰肼（R＝OCH3;R1＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝乙基;R4＝R5＝H），
4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼-N2-戊二酰亚胺-4-半丁二酸酯酰肼（;R1＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢），
4-去乙酰基-长春新碱-3-羧酰肼（R＝NHNH2;R5＝氢;R2＝CHO;R3＝羟基;R4＝乙基），
4-去乙酰基-4′-表去氧-长春碱-3-羧酰肼（R＝NHNH2;R1＝R4＝R5＝氢;R2＝甲基;R3＝乙基），
4-去乙酰基-长春碱-3-乙基羧酰胺-4-半丁二酸酯酰肼（R＝NHCH2CH3;R1＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基，R5＝氢），
4-去乙酰基-长春碱-3-甲氧乙基羧酰胺-4-半丁二酸酯酰肼（R＝NHCH2CH2OCH3;R1＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢），
4-去乙酰基-长春碱-4-丙酰基-3-羧酰肼（R＝NHNH2;R1＝COCH2CH3;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）。
前面提到的欧洲申请专利系列号86304522.5中的一些环酰胺及它们盐的制备方法如下：
制备例Ⅰ
4′-去氧-4-去乙酰基-异长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺
制备1320毫克4′-去氧-4-去乙酰基-异长春碱-3-羧酰肼在25毫升吡啶中的溶液，加入175毫克丁二酸酐并在氮气下于室温搅拌反应大约24小时。真空除去反应混合物中的挥发性成分，生成的残存物溶于二氯甲烷中并加上足够量的甲醇以溶解全部残余物，有机层用等体积的水洗二次，而后干燥。真空蒸发挥发性组分就给出含有N2-丁二酰基-4′-去氧-4-去乙酰基异长春碱-3-羧酰肼的残留物，将残留物溶在25毫升吡啶中并加入350毫克乙酸酐，从而形成丁二酸和乙酸的混合酸酐。此混合酸酐即自动环合形成4′-去氧-4-去乙酰基-异长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺。将反应混合物真空蒸发至干，残余物溶在二氯甲烷中，将二氯甲烷萃取液用等体积水洗涤两次并干燥。蒸发二氯甲烷，生成4′-去氧-4-去乙酰基-异长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺。在硅胶上进行色谱层析，用乙酸乙酯并逐渐增加甲醇量（0-50%）作为洗脱剂。将用薄板层析显示具有所需丁二酰亚胺衍生物的组分合并，在真空下蒸发，得190毫克的4′-去氧-4-去乙酰基-异长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺，物理性质如下：
红外光谱（氯仿中）：峰值在3470，1736，1615和1572cm-1
核磁（CDCl3）δ 10.90，7.88，7.49，7.12，
6.48，6.05，5.80，4.10，3.76，
3.56，2.82，0.93，0.85
其硫酸盐的制备是通过将游离碱溶于pH大约8.0的无水乙醇中，然后，将pH用新鲜制备的2%硫酸乙醇溶液调到大约3.9，蒸发反应混合物至干，得4′-去氧-4-去乙酰基异长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺硫酸盐。
按上述反应步骤，将4-去乙酰基长春碱酰肼（2.4克）溶于125毫升吡啶中，然后加入385毫克戊二酸酐，生成的N2-戊二酰基-4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼按上述操作分离并用与上相同的溶剂系统在硅胶上色谱层析纯化。将戊二酰化合物和乙酸酐反应形成混合酸酐，即自动环合生成4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼-N2-戊二酰亚胺。化合物按上述的同一溶剂系统在硅胶上层析纯化，得到460毫克的N2-戊二酰亚胺衍生物。物理性质如下：
质谱m/e＝864（C48H60N6O9）
红外光谱（CHCl3）峰值 3475，1714，和1616cm-1
PKa（66%DMF水溶液）＝5.1，7.4，12.9
核磁（CDCl3）δ：9.96，8.91，8.04，7.52，7.14，
6.58，6.08，5.83，4.15，3.78，3.69，
3.61，2.86，0.93，0.89
其硫酸盐是按上述步骤制得，从290毫克的起始物质可得到210毫克硫酸盐。
按上述操作步骤，还是用4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼代替4′-去氧-4-去乙酰基-异长春碱-3-羧酰肼，并且用乙酰氯代替乙酸酐，得到的N2-丁二酰基-4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼。层析丁二酰亚胺产物得到两个组分，一个是预期的4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺，另一个是其4-乙酰基衍生物，它是在环合步骤中形成的副产物。4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺具有如下的物理性质：
质谱m/e＝850（C47H50N6O9）
红外光谱（KBr）峰值在3480，1734，和1616cm-1
核磁（CDCl3）δ：9.69，9.47，8.22，7.49，7.12，
6.53，6.07，5.82，5.71，4.01，3.77，
3.63，3.59，2.84，2.82和0.89。
其硫酸盐是按前述步骤制得。从350毫克起始物制得250毫克硫酸盐。
这些在C-3位有各种取代的（见分子式Ⅰ的R）二聚吲哚-二氢吲哚生物碱的C-4衍生物的制备是将按分子式Ⅰ的化合物（其中R1为H，R和R2-R5具有它们已指定的含义）根据《英国专利》2 137 202A（以前提到的）概述的多步反应过程或Cullinan在《美国专利》系列号745 562（以前提到过）的例4来反应。在这些步骤中，具有分子式为
（这里X具有它以前的含义）的环式酸酐与具有分子式Ⅰ的R1为H的化合物反应。这个反应的产物是半羧酸酯，分子式为（这里V是式Ⅰ的4-去乙酰基长春花生物碱），通过C-4羟基相连，酰化基团然后置换羧酸（CO2H）的“羟基”，酰氯是非常有用的酰化基团，或者也可采用由N-甲基吗啉和氯甲酸烷基酯依次同半羧酸的游离羧基反应生成的混合酸酐。这个活化了的羧酸，例如，和肼反应产生所需的酰肼，
具体的制备法（以说明此步骤）如下。
制备例Ⅱ
将2.5克（从英国专利2 137 202A例1而得）4-去乙酰基-长春碱-4-半丁二酸酯（4-丁二酰基长春碱）溶于50毫升氯仿，加入870毫克N-甲基吗啉，在溶解完后，将反应混合物在冰浴冷却，并通入氮气，再加入985毫克的氯甲酸异丁酯，反应混合物在0℃搅拌大约45分钟，加入1毫升的无水肼，将反应混合物搅拌大约10分钟，然后用水萃取反应混合物，分离水提取物并弃去，将有机层干燥。蒸发溶剂得含4-去乙酰基-长春碱-4-半丁二酸酯酰肼的残余物。将此残余物的二氯甲烷溶液在硅胶上层析，用乙酸乙酯/甲醇（100/0到50/50）作洗脱剂。从适当的组分可得950毫克的纯化了的4-去乙酰基-长春碱-4-半丁二酸酯酰肼。质谱m/e＝882，
其硫酸盐是通过将游离碱溶在25毫升无水乙醇，用2%的硫酸乙醇溶液（由24.5克无水乙醇，0.5克18摩尔H2SO4制备）调pH到大约4，在真空条件下除去溶剂而制成。
红外光谱：峰值在3400，3009，1738，1680和1616cm-1
核磁共振谱（CDCl3）δ：9.9，8.35，8.05，7.55，
7.10，6.85，6.10，5.85，5.45，5.30，
3.80，3.70，3.60，2.70，0.90，0.85
本发明的新型的结合物包括氧化了的糖蛋白，最好是免疫球蛋白，而免疫球蛋白中更为优选的是单克隆抗体（MoAb），此单克隆抗体是-γ-球蛋白诸如IgG或IgM。含有糖的免疫球蛋白（Ig）片段，如同在衍生出这些片段的母体免疫球蛋白中一样，也可用来形成本说明书中公开的新型的结合物。
优选的一类糖蛋白，免疫球蛋白，是那些起码能识别并能与期望的靶细胞的抗原反应的，即，它们有抗原识别性质，特别优选的是那些能够识别在所需要的靶细胞表面上的抗原的糖蛋白。
人们已经熟知从免疫了的动物的血清或通过培养分泌单克隆产物的杂交瘤中生产这种免疫球蛋白的生产技术。例如，见Kohler和Milstein的《自然杂志》（Nature）256 495（1975）。用于此发明的优选的一类抗体是免疫球蛋白（γ-球蛋白），特别优选的是IgG，IgA，IgE和IgM亚类。一些有代表性的免疫球蛋白如下，它们是对下列抗原的单或多克隆抗体：
（ⅰ）人体或动物肿瘤相关的抗原;
（ⅱ）人体B细胞和T细胞抗原;
（ⅲ）人体Ia抗原;
（ⅳ）病毒、真菌和细菌抗原;
（ⅴ）涉及人体炎症或过敏反应的细胞。
与人体或动物肿瘤相关的抗原，较好的抗体可提及如下：
（ⅰ）从用癌胚抗原免疫了的山羊或绵羊体中得到的Ig;
（ⅱ）从兔的抗急性淋巴母细胞白血病血清中得到的Ig;
（ⅲ）从各种灵长类中产生的抗急性淋巴母细胞白血病，急性成髓细胞白血病，慢性淋巴母细胞白血病和慢性粒细胞白血病的抗血清中得到的Ig;
（ⅳ）从用肺癌细胞或细胞碎片免疫了的山羊或绵羊体中得到的Ig;
（ⅴ）从分泌抗人体直肠结肠癌抗体的小鼠杂交瘤中得到的单克隆Ig;
（ⅵ）从分泌抗人体黑素瘤抗体的小鼠杂交瘤中得到的单克隆Ig;
（ⅶ）从分泌与人体白血病细胞反应的抗体的小鼠杂交瘤中得到的单克隆Ig;
（ⅷ）从分泌可以与人体成神经细胞瘤细胞反应的抗体的小鼠杂交瘤中得到的单克隆Ig;
（ⅸ）从分泌可以与人体乳腺癌抗原反应的抗体的小鼠杂交瘤中得到的单克隆Ig;
（ⅹ）从分泌可以与人体卵巢癌细胞反应的抗体的小鼠杂交瘤中得
到的单克隆Ig;
（ⅹⅰ）从分泌与人体骨肉瘤细胞、人体胰腺癌细胞、人体前列腺癌细胞等反应的抗体的小鼠杂交瘤中得到的单克隆Ig;
（ⅹⅱ）从分泌抗腺癌（其中包括肺、肾、乳腺和胰腺）的抗体的小鼠杂交瘤中得到的单克隆Ig;
（ⅹⅲ）从分泌与人体鳞状癌细胞反应的抗体的小鼠杂交瘤中得到的单克隆Ig;
（ⅹⅳ）从人体杂交瘤得到的单克隆Ig。此杂交瘤可分泌对人体肿瘤相关抗原的抗体（这些抗体包括，但又不限于上述的单克隆抗体）;
（ⅹⅴ）任何或在轻链或在重链上含有糖的抗体或抗体片段;
（ⅹⅵ）从大鼠、仓鼠或其它哺乳动物（前面设有专门提及）中，从分泌对人体肿瘤相关抗原的抗体的杂交瘤中得到的单克隆Ig（此抗体包括，但不限于上述范围）。
如上所说，结合物也可由从抗体衍生而来的免疫球蛋白片段Ig′（即也被称Fab，Fab′，F（ab′）2和IgM单体）来制备。这些片段从，例如，蛋白分解酶消化或还原烷基化抗体而得。这些原料和制备方法已众所周知。最好的制备这些片段的方法是用蛋白分解酶，如胃蛋白酶和木瓜酶，一般可参阅Parham在《免疫学杂志》131，2895（1983），Lamoyi等人在《免疫学方法杂志》56，235（1983），Parham在同杂志53 133（1982）和Matthew等人在同杂志50，239（1982）中的文章。
存在特异性的MoAb，对各种不同的肿瘤都有反应活性，这些免疫球蛋白在本发明中是很有用的，它们可结合或识别肿瘤细胞表面上的抗原，它们包括如下一些，但又不仅仅局限于这些：
表Ⅰ
肿瘤 单克隆抗体 参考文献
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较好的结合物是从单克隆抗体制得的，尤其是从那些能识别人体癌细胞，诸如腺癌，鳞状细胞癌，移行细胞癌，黑素瘤、成神经细胞瘤，小细胞癌，白血病，淋巴瘤和肉瘤的抗体来制备的。
前述类型的糖蛋白（GP）可用高碘酸盐或其它合适的氧化剂来氧化，这样表面上的糖的邻二醇间的价键就被断裂。在原来价键的两边都生成了醛基：
糖部分结构 二醛产物
所生成的二醛基单位的数目则取决于下列因素（这些因素被那些熟悉本领域的人所考虑）：所用高碘酸盐量，氧化反应的一般条件（如时间、温度、溶剂、浓度等），蛋白质中存在的邻二醇糖类的数目和它们对高碘酸盐试剂的可利用度。
或者，亦可与上述的用高碘酸盐氧化方法相结合，例如，亦可用半乳糖酶来进行酶氧化。这是一个催化糖蛋白糖链上的半乳糖残基中6位-CH2OH转化为醛基的更具选择性和限制性的试剂。这个6-CH2OH基团要被成功地氧化就必须是非取代的。暴露一个位阻基团，例如一个接有唾液酸残基的基团，可用唾液酸苷酶来完成，如上所述，产生的醛基部分的数目将是很多变量的一个函数。
含醛基的糖蛋白（OCH）m-GP，随后与长春花生物碱的酰肼，V′-3-CONHNH2，或V-4-O-CO-X-CONHNH2发生结合，得到一个腙，（V′-3-CONHN＝CH）m-GP或（V-4-O-COX-CONHN＝CH）m-GP，这里V′是结构Ⅰ中定义的长春花基团，但在3-位上少一个-COR，m是醛基或连在糖蛋白中的长春花基团的数目。这些结合物是本发明的主题，并且分别用结构Ⅰa和Ⅰb来定义：
一般地说，用m表示的数目是由以上所述的氧化过程中产生的醛基数目的函数，我们已经发现了有每一抗体中含高达25个长春花碱基的结合物，平均比例（长春花基数/抗体）约为1-10（即m是1-10），优选比例为4-10。
长春花的酰肼物与氧化的糖蛋白的结合可通过技术中已知的标准方法来完成。一般地说，把长春花部分溶在与水混溶的溶剂中，诸如二甲基甲酰胺中，然后将此溶液加到氧化了的糖蛋白的冷却了的缓冲水溶液中。温度最好约0-8℃，一般用0.1N醋酸钠缓冲液，反应最好在暗处和惰性气中进行。反应一般约10-24小时完成。所得结合产物可用标准方法，诸如在Sephadex上层析来进行纯化。
具体的MoAb的氧化和结合如下：
制备例Ⅲ
和X-63AG8-S1 MoAb的结合
把200毫克X-63AG8-S1（分子量约为150000，1.34×10-6摩尔;按ATCC TIB9细胞系贮存并可自由购得，美国各型培养物收集站，12301，Parklawn Drive，Rock-ville，MD20852）溶于20毫升pH＝5.6的0.1M醋酸钠缓冲液中（29.3克醋酸钠，2.44毫升醋酸加足够量的无菌水得到4升缓冲溶液）制成溶液，在约0℃下，把此溶液放置过夜（约10%的蛋白质没有被溶解）。在快速搅拌下，一次加入685毫克偏高碘酸钠。
此混合物在暗处约0℃下搅拌21分钟，然后停止搅拌，加入过量5倍（按高碘酸盐总量计）的1.28毫升的12.5摩尔浓度的乙二醇的无菌水溶液，这个新混合物在暗处0℃下搅拌5分钟，然后离心得到清彻的上清液和一白色小片。上层清液装入一个舍菲特（Sephadex）G25（中等颗粒）的凝胶柱上并用同一醋酸钠缓冲液洗脱产物。洗脱液用280纳米（nm）的紫外光检测，将高碘酸盐从柱上洗脱下，然后弃去，每一洗脱组分中所含的氧化的产物浓度可于279纳米（nm）下测定，产率是96%，同样再进行一次，给出96.5%的收率。
把含有4.72和4.02毫克/毫升氧化产物的上述洗脱液混合起来，加入0.1当量浓度（0.1N）醋酸钠缓冲液，得到一个最终蛋白质浓度为2.77毫克/毫升（总体积为69毫升）的溶液，把此溶液冷却至约0℃左右。
将4-去乙酰基长春碱-3-羧酰肼在DMF中的溶液（5.6毫升的浓度为53.7毫克/毫升的溶液）逐滴加入到冷却的缓冲的MoAb溶液里，反应容器里充填氮气，然后再密封。反应混合物于冷的暗处用磁力搅拌24小时，将反应容器然后开封，把澄清，淡黄色的反应混合物进行离心，上层清液在舍菲特（sephadex）G25凝胶上层析，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液（0.01摩尔浓度H3PO4，0.15摩尔浓度NaCl）先进行预平衡，此缓冲液亦用作为洗脱液，结合物（由3-羧酰肼基和MoAb中的糖上的醛基间形成的腙）最先被洗脱出来，紧接着是未反应的4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼，所得到的结合物的产率（从4个柱子上）为224毫升，含173毫克产品（90%产率），此结合物每1摩尔X-63AG-8-S1的MoAb含大约6摩尔4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰腙。
第二次的彻底反应是用200毫克的KS1/4（一个能够识别人体腺癌细胞表面抗原的MoAb）在20.0毫升的醋酸缓冲液胞，加入与在制备Ⅲ中的相同数量的高碘酸盐和乙二醇。产物在层析后得到39.9毫升缓冲溶液中的176毫克氧化的MoAb（收率88%）。与274毫克的4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼在pH＝5.6的醋酸缓冲液中结合得到146毫克（83%）的结合物，此结合物中每1摩尔KS1/4含有7.5摩尔的4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰腙。
按上述步骤，由4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼与经氧化9.2.27（一种能够识别人体黑素瘤细胞表面抗原位置的糖蛋白MoAb）的表层糖得到的醛基反应制得一种结合物，反应是用200毫克的MoAb在pH＝5.6的醋酸钠缓冲液（0.1摩尔浓度）中用685毫克的偏高碘钠氧化，以92%的产率（184毫克）得到含醛基的氧化了的9.2.27MoAb，把这个氧化产物与279毫克4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼结合。多聚的4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼与氧化了的含醛基的9.2.27之结合物的最终收率是91%。存在在磷酸盐缓冲盐液中。反应产物中每摩尔9.2.27含有约4.9摩尔的起始长春花生物碱。
按制备Ⅲ中的操作，用4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼作为长春花部分制得的几个其它的抗体结合物在表Ⅱ中概要列出：
表Ⅱ
抗体 在最终结合物中每摩尔抗体所
结合长春花基的平均摩尔数
11.285.14 4.2（3）++
11A8 5.7（4）
11B2 5.5（6）
13H1 4.1（1）
14.95.55 6.2（4）
17H12 4.2（1）
2A11 6.0（1）
324.9.4.10 5.9（2）
4D12 4.3（6）
4E8.11 4.4（3）
6D2 5.1（4）
F9 6.6（2）
L1KS 5.8（7）
L2KS 6.4（2）
L4KS 4.5（4）
L6KS 4.25（2）
ZCE-025 11.9＊（11）
++括号里的数目表示在计算平均值时所重复的实验次数。
＊在这一组内，观察到有一个结合体中每一抗体含约27个长春花生物碱基。
如上所述，结合物还能由免疫球蛋白片段Ig′，IgM单体或其它的Ig单体制备，这些单体含有的糖是从母体抗体通过，例如蛋白分解酶消化或还原性烷基化衍生而来。这些物质和制备方法已众所周知，制备这些片段最佳的蛋白分解酶是胃蛋白酶和木瓜酶。
对本发明所得到的结合物的评价可通过使用诸如亲合层析等众所周知的技术来进行。结合物的效能可通过把结合物与悬浮的肿瘤细胞相互作用后，所能存活下来的细胞计数来测定。或通过摄取的氚代尿苷值来测定。蛋白质和药物浓度可通过测定结合物在两个波长下，如270纳米和279纳米下的光密度，并将所测的数值与该游离的药物和未结合的免疫球蛋白在同样的该二波长下所测的数值相比较而得以测定。结合物还可以通过在体内试验其对于无胸腺小鼠人体肿瘤细胞异体移植物的活性进行评价。
本发明的新颖的结合物是有效的抗肿瘤剂，并最好以适合供注射用的制剂形式来制备，因而本发明也包括了药物的调配，例如可供注射的制剂包括将本发明的结合物与一个可供药用的载体或与稀释剂相调配，这在文献中是众所周知的，配制最好采取单位剂量的形式，每一剂量含有，例如，从0.01到10毫克的活性成分（按长春花药物部分计），可供药用的载体或稀释剂为在温血动物化疗中可用的载体或稀释剂。
新颖的结合物在很宽的剂量和每周剂量范围内均有效。例如，治疗患癌症的成年人，剂量一般在0.01至10毫克/公斤（按长春花药物部分计）的范围内，更常见的是在从0.03至9毫克/公斤的范围内。当然应该理解必须使用的结合物的量将由医生根据有关的情况，诸如治疗状况和给药途径来决定。
下表显示了上述结合物在治疗肿瘤疾病时的疗效。
表Ⅲ
9.2.27-去乙酰基-长春碱-酰肼结合物在黑素瘤异种移植模型中的最小有效剂量（长春花当量）
黑素瘤细胞系 MED＊
（毫克/千克 长春花含量）
M14黑素瘤 ＜0.0625
FTM黑素瘤 ＜0.375
SCl黑素瘤 ＜0.375
SKMEL28黑素瘤 ＜0.375
A375 ＜0.185
＊MED＝最小有效剂量，它表明28天后肿瘤生长抑制率大于50%，是9.2.27-去乙酰基-长春碱-酰肼结合物以三次静脉给药方式（在肿瘤移植后的2天，5天和8天），按其中长春花含量来求得的最小有效剂量。
表Ⅳ
KS 1/4-去乙酰基-长春碱酰肼结合物在腺癌异体移植模型中的最小有效剂量（长春花当量）
腺癌细胞系 MED＊
（毫克/千克 长春花含量）
P3-UCLA人体肺癌 ＜0.0625
HT-29直肠结肠癌 ＜0.25
表Ⅳ（续）
腺癌细胞系 MED＊
（毫克/千克 长春花含量）
HT-29VTE＊＊直肠结肠癌 ＜0.25
＊MED＝KS1/4-去乙酰基-长春碱-酰肼结合物的最小有效剂量，它表明大于50%的肿瘤生长抑制率。在肿瘤移植后的2天，5天和8天，以三次静脉给药方式，按长春花含量来计算求得。
＊＊HT-29VTE是在体内经过选择的对长春花生物碱治疗耐药的变异细胞系。
表Ⅴ
人体肿瘤在裸鼠上的异体移植模型中的单克隆抗体-4-去乙酰基-长春碱-酰肼结合物的最小有效剂量
抗体-结合物++靶细胞系＊＊M.E.D.（毫克/千克）＊
L1-KSAP3UCLA 0.05
HT-29 0.0625
FADU 0.5
LS174 0.3
L2-KSAP3UCLA 0.125
L4-KSAP3UCLA 0.125
11.285.14AP3UCLA 1.2
14.95.55 P3UCLA 0.6
LS174 .5
VX007BALS174 ＜0.5
P3X63AG-8（S1）AP3UCLA ＞1.0
HT29 3.0
表Ⅴ（续）
抗体-结合物++靶细胞系＊＊M.E.D.（毫克/千克）＊
11B2BT222 1-2
6D2BT222 1-2
FADU 0.5
4D12BP3UCLA ＞2.0
11A8BFADU 1-2
T222 ＞2.0
17H12BT222 1-2
13H1BT222 ＞2.0
＊见前表Ⅲ和Ⅳ
++结合物的长春花部分是4-去乙酰基-长春碱-酰肼
＊＊P3UCLA是肺腺癌，HT29是结肠腺癌，FADU是咽的鳞状细胞癌，LS174是结肠腺癌，T222是鳞状细胞癌。
A：动物在肿瘤组织移植后的2至8天内，用结合物治疗三次，在移植的28天后，测量肿瘤组织，与用PBS（磷酸盐缓冲盐水）治疗的动物相对照而定出抑制作用。
B：所用的指标与上述A中相同，不同处为在第3天，6天和9天时给药并在第2周，3周或4周时测量肿瘤。