产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母 【技术领域】
本发明涉及具有降低活性的突变型谷胱甘肽合成酶的酵母和利用酵母细胞的食品。从其中产生的γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸可用于食品领域中。
背景技术
半胱氨酸用于增强食品的味道等目的。已知的半胱氨酸生产方法包括蛋白质分解方法和半合成的方法。目前应用的方法主要是蛋白酶解方法和半合成的方法。尽管为了应用它们以增强食品味道的目的需要具有高半胱氨酸含量的天然食品材料，但这样的天然食品材料已知的很少。另一方面，人们已报道对含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物的热或酶处理可产生具有高半胱氨酸含量的食品材料(WO00/30474)。
γ-谷氨酰半胱氨酸是通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的功能从作为底物的半胱氨酸和谷氨酸合成的。另一方面，谷胱甘肽是通过谷胱甘肽合成酶的功能从作为底物地γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成的。因此，作为繁殖以高含量累积γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的方法，可以提议对编码谷胱甘肽合成酶的基因进行破坏。其编码谷胱甘肽合成酶的基因已被破坏的酵母报道于WO 00/30474；Otake等人，Agri.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990；Chris等人，Molecular Biologyofthe Cell.，8，1699-1707，1997；Inoue等人，Biochimica et BiophysicaActa，1395(1998)315-320中。
然而，每一种上述酵母均具有生长速率在很大程度上降低的缺点。进一步地，Otake等人报道与含有谷胱甘肽的培养基中的培养相比，其编码谷胱甘肽合成酶的基因已被破坏的酵母在不含谷胱甘肽的培养基中的培养显示不佳的生长(Otake等人，Agri.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。然而，由于富含谷胱甘肽的培养基通常是昂贵的且谷胱甘肽本身也是昂贵的，所以这种培养基对于工业应用不是优选的。另一方面，将上述酵母以高密度培养于含有不足量谷胱甘肽的便宜培养基中以在工业水平上应用也是不合适的。
发明公开
在上述背景技术下，本发明的一个目的是提供一种酵母和利用该酵母的含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品，该酵母带有降低活性的突变型谷胱甘肽合成酶并产生γ-谷氨酰半胱氨酸。
作为为了实现上述目的的大量研究的结果，本发明者已发现具有特定突变的突变型谷胱甘肽合成酶具有适合于γ-谷氨酰半胱氨酸累积和酵母生长的适度谷胱甘肽合成酶活性，且带有突变型酶的酵母累积γ-谷氨酰半胱氨酸，因此实现了本发明。
即本发明提供了下列各项。
(1)一种带有突变型谷胱甘肽合成酶且产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母，所述突变型谷胱甘肽合成酶具有至少一个或两个突变，所述突变选自在位置47由异亮氨酸残基替代苏氨酸残基的突变和在位置387由天冬氨酸残基替代甘氨酸残基的突变。
(2)根据(1)的酵母，其中该酵母进一步具有在位置54由亮氨酸残基替代脯氨酸残基的突变。
(3)根据(2)的酵母，其中突变型谷胱甘肽合成酶具有在位置47由异亮氨酸残基替代苏氨酸残基的突变和在位置54由亮氨酸残基替代脯氨酸残基的突变。
(4)根据(2)的酵母，其中突变型谷胱甘肽合成酶具有在位置387由天冬氨酸残基替代甘氨酸残基的突变和在位置54由亮氨酸残基替代脯氨酸残基的突变。
(5)根据(1)～(4)中任何一项的酵母，其中无突变的谷胱甘肽合成酶具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
(6)根据(1)～(5)中任何一项的酵母，其中该酵母属于酵母属(Saccharomyces)。
(7)一种包含通过在适当条件下培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母获得的培养物的食品或饮料，或者上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培养物的分级分离产物，或者在其中已通过热处理而产生半胱氨酸的培养物或分级分离产物。
(8)根据(7)的食品或饮料，其中该食品或饮料是含酒精的饮料、面包食品或发酵的食品调味品。
(9)应用培养物产生的酵母提取物，该培养物是通过在适当条件下培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母获得的。
(10)一种生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品或饮料的方法，该方法包含以下步骤：在适当条件下培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母，将获得的培养物或其分级分离产物或者进行了热处理的培养物或其分级分离产物与食品或饮料原材料混合，并将该混合物加工为食品或饮料。
在下文中将对本发明进行详细描述。
本发明的酵母是带有突变型谷胱甘肽合成酶且产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母，该突变型谷胱甘肽合成酶具有下面的突变之一或两者：
(1)在位置47由异亮氨酸残基替代苏氨酸残基的突变(在下文中也称为“T47I-型”突变)；和
(2)在位置387由天冬氨酸残基替代甘氨酸残基的突变(在下文中也称为“G387D-型”突变)。
在本发明中，“带有(harboring)突变型谷胱甘肽合成酶”预示基本不带有野生型谷胱甘肽合成酶。
同样地，在本发明中，“产生γ-谷氨酰半胱氨酸”指在微生物细胞中以比野生型酵母菌株更大的量累积γ-谷氨酰半胱氨酸。优选地，当在SD培养基中培养时，本发明的酵母在其对数生长期含有按重量计算为1.0％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸，更优选地按重量计算为1.1％或更多。此外，当在SD培养基中培养时，本发明的酵母在其对数生长期含有按重量计算为0.0001％～0.1％的谷胱甘肽，优选地按重量计算为0.001％～0.006％。在此处所用的术语“对数生长期”指在培养过程中酵母细胞数目关于培养时间对数增加的阶段。
谷胱甘肽合成酶突变和在下文描述的任选突变的上述位置是关于报道的由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)谷胱甘肽合成酶基因(GSH2)编码的氨基酸序列确定的(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320，GenBank编号Y13804)(表示于序列列表中的SEQ ID NO：2中)。相同基因的核苷酸序列表示于SEQ IDNO：1中。
例如，在本发明的酵母带有的突变型谷胱甘肽合成酶与参考序列相比在N-末端部分具有1个氨基酸残基缺失的情况下，上述位置47和387分别相应于自突变型谷胱甘肽合成酶N-末端的第46和第386个氨基酸残基。
本发明的酵母除上述突变之外可进一步具有下面的突变之一或两者：
(3)在位置54由亮氨酸残基替代脯氨酸残基的突变(在下文中也称为“P54L-型”突变)。
本发明的酵母带有的突变型谷胱甘肽合成酶的一个优选实施方案如下：
(i)具有T47I-型突变和P54L-型突变的谷胱甘肽合成酶。
(ii)具有G387D-型突变和P54L-型突变的谷胱甘肽合成酶。
此外，上述突变型谷胱甘肽合成酶优选地是其中无突变的谷胱甘肽合成酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的谷胱甘肽合成酶。
由于具有上述突变的突变型谷胱甘肽合成酶与野生型谷胱甘肽合成酶相比具有降低的活性，所以带有该突变型酶的酵母产生γ-谷氨酰半胱氨酸。此外，由于带有上述突变型谷胱甘肽合成酶的酵母保持了降低的谷胱甘肽合成酶活性，所以它也可在不含谷胱甘肽的培养基中良好生长。
本发明的酵母是不特别限制的，只要它可产生γ-谷氨酰半胱氨酸。特定地，它包括属于酵母属如酿酒酵母、裂殖酵母属(Schizosacchromyces)如粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)等的酵母。考虑到良好的生长，本发明的酵母优选地具有二倍性或更多的多倍性。具有二倍性或更多多倍性的酵母可通过如下方法获得，即使得用于繁殖带有上述突变型谷胱甘肽合成酶的酵母的单倍体酵母与带有野生型谷胱甘肽合成酶的单倍体菌株进行杂交，并从获得的二倍体酵母中选择带有突变型谷胱甘肽合成酶并产生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株。类似地，可获得具有三倍性或更多多倍性的酵母。
本发明的酵母可应用如编码具有上述突变型谷胱甘肽合成酶的DNA进行基因置换而生成。本发明的酵母也可通过对野生型酵母进行普通的突变处理如紫外辐射或用诱变剂处理而获得，该诱变剂如N-甲基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸或吖啶。可通过如PCR方法等证实获得的突变具有目标突变。
上述基因置换可进行如下。即，用重组DNA对酵母进行转化，该重组DNA含有编码在其中引入了目标突变的谷胱甘肽合成酶的核苷酸序列，从而导致突变型谷胱甘肽合成酶基因和染色体上的谷胱甘肽合成酶基因进行重组。在这种情况下，在重组DNA中插入的依赖于如宿主营养缺陷型特征的标记基因使操作变得容易。此外，通过用限制性内切酶等切割而使上述重组DNA线性化及此外从重组DNA中去除在酵母中发挥功能的复制控制区可有效地产生一个菌株，在该菌株中重组DNA整合入染色体中。
其中重组DNA以上述方式整合入染色体中的菌株进行了与染色体上固有的谷胱甘肽合成酶基因的重组，从而将两个融合的基因即野生型谷胱甘肽合成酶基因和突变型谷胱甘肽合成酶基因插入到染色体上，所以重组DNA的其他部分(载体区段和标记基因)应该存在于两个融合基因之间。因此，野生型谷胱甘肽合成酶以这种状态发挥功能。
下一步，为了仅将突变型谷胱甘肽合成酶基因留在染色体DNA上，通过两个谷胱甘肽合成酶基因的重组将一个拷贝的谷胱甘肽合成酶基因连同载体区段(也包括标记基因)一起从染色体DNA上去除。在这种情况下，有两种情形。一种情形中，野生型谷胱甘肽合成酶基因留在染色体DNA上而突变型谷胱甘肽合成酶基因被从其上切除。相反，在另一种情形中，突变型谷胱甘肽合成酶基因留在染色体DNA上而野生型谷胱甘肽合成酶基因被切除。在两种情形中，标记基因均被去除，从而第二次重组的出现可通过相应于标记基因的表型进行证实。目标基因置换的菌株可通过用PCR方法扩增谷胱甘肽合成酶基因并检查其结构而进行选择。
用于基因置换中的突变型谷胱甘肽合成酶可为编码全长谷胱甘肽合成酶的基因，但也可为编码酶的部分的基因片段，只要它包括突变位点。同样地，当应用基因片段时，以相同方式进行的基因置换将导致目标突变引入到染色体DNA上的野生型谷胱甘肽合成酶基因中。
在如下情形中，即染色体上的谷胱甘肽合成酶基因和预期要引入的突变型谷胱甘肽合成酶基因相互之间具有低到不能在那里应用基因置换的程度的同源性，可将染色体基因上的谷胱甘肽合成酶基因破坏，随后在质粒或染色体DNA上容纳突变型谷胱甘肽合成酶。
具有预期突变的突变型谷胱甘肽合成酶基因可用合成的寡核苷酸通过位点专一性突变获得。已报道了酿酒酵母谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320，GenBank编号Y13804，SEQ ID NO：1)，且该基因可通过PCR方法从酿酒酵母的染色体DNA上获得，其中将基于核苷酸序列制备的寡核苷酸用作引物。
对于酵母的转化，可应用那些常规用于酵母转化的方法，如原生质体方法、KU方法、KUR方法、电穿孔方法等。此外，操作程序如酵母的孢子形成和单倍体酵母的分离等描述于“Chemistry andOrganisms，Experimental Line 31，Experimental Techniques onYeasts”，第一版，Hirokawa Shoten；“Bio Manual Series 10，GeneExperimental Methods with Yeasts”，第一版，Youdosha等中。
本发明的酵母除带有突变型谷胱甘肽合成酶之外可具有增强的γ-谷氨酰半胱氨酸活性。
本发明的酵母以一定的量或更多的量产生γ-谷氨酰半胱氨酸，且在工业水平上应用的不含谷胱甘肽的培养基中生长良好，从而它具有极好的每单位时间产生γ-谷氨酰半胱氨酸的能力。
通过在适当条件下培养如上所述获得的产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母获得的培养物含有γ-谷氨酰半胱氨酸。这种培养物或其分级分离产物含有γ-谷氨酰半胱氨酸。该培养物可为含有酵母细胞的液体培养基，或者可为从其中收集的酵母细胞、破坏的细胞或细胞提取物(酵母提取物)。同样建议从细胞片段或酵母提取物中获得含有γ-谷氨酰半胱氨酸的分级分离产物。
加热上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培养物或其分级分离产物可从γ-谷氨酰半胱氨酸中释放半胱氨酸。
用于进行培养的培养基是不特别限制的，只要它使得本发明的酵母能良好生长并有效产生γ-谷氨酰半胱氨酸。对于本发明的酵母，由于其在不含谷胱甘肽的培养基上良好生长的能力，所以可应用通常在工业规模上应用的培养基。应注意到依赖于应用的酵母的特征，在必要时可将必要的养分添加到培养基中。
培养条件和酵母提取物等的制备以与进行通常的酵母培养和酵母提取物等的制备相同的方式进行。酵母提取物可为那些通过处理酵母细胞的热水提取物获得的或那些通过处理消化的酵母细胞获得的。
含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的上述培养物或其分级分离产物可用于生产食品或饮料。该食品和饮料包括含酒精的饮料、面包食品或发酵的食品调味品。通过热处理从γ-谷氨酰半胱氨酸生产半胱氨酸可在生产食品和饮料过程中或其生产之后进行。
上述食品和饮料通过将含有γ-谷氨酰半胱氨酸与半胱氨酸的培养物或其分级分离产物与食品和饮料原材料混合并将混合物加工为食品和饮料进行生产。除了应用上述的培养物或其分级分离产物之外，本发明的食品和饮料可应用与那些用于通常的食品和饮料中的相同的原材料并通过与用于通常的食品和饮料中的相同的方法进行生产。这种原材料对于含酒精的饮料包括如稻、大麦、玉米淀粉等，对于面包食品包括小麦面粉、糖、精制食盐、黄油、发酵酵母等，对于发酵的食品调味品包括大豆和小麦等。
附图简述
图1是表示K2菌株在SD培养基和含有1-mM谷胱甘肽的SD培养基(SDGSH)中生长的图解，其中每一种培养基均含有必需量的尿嘧啶。
图2是表示K3菌株在SD培养基和含有1-mM谷胱甘肽的SD培养基(SDGSH)中生长的图解，其中每一种培养基均含有必需量的尿嘧啶。
图3是分别表示K1、K2和K3菌株在SD培养基(含有必需量的尿嘧啶)中生长的图解。
优选实施方案描述
在下文中，本发明将关于实施例进行详细描述。
用于实施例中的培养基组成如下。应注意到琼脂培养基含有2％的纯化的琼脂。
[YPD培养基组成]
葡萄糖 2％
蛋白胨 1％
酵母提取物 0.5％
(pH5.0)
[SD培养基组成]
葡萄糖 2％
含氮碱基 1-倍浓度
(10-倍浓度的含氮碱基是1.7g不含氨基酸和硫酸铵的细菌用酵母含氮碱基(Difco Laboratories，Inc.)和5g硫酸铵溶于100ml蒸馏水中的混合物，将其调节到pH5.2并通过滤器过滤进行灭菌)。
[SDFOA培养基组成]
终浓度中含有50mg/l尿嘧啶和1g/l 5-氟乳清酸水合物的SD培养基。
比较例1其中编码谷胱甘肽合成酶的基因被破坏的酵母的繁殖
使得商业上可购得的用于食品的酿酒酵母能够形成孢子以获得单倍体面包酵母，即S菌株(MATα)。此外，通过应用含有尿嘧啶的SDFOA琼脂培养基从S菌株获得尿嘧啶营养缺陷型S2菌株。从S2菌株获得酵母K1菌株，其中谷胱甘肽合成酶基因(GSH2)由描述于WO 00/30474A中的方法进行破坏。
实施例1具有突变型谷胱甘肽合成酶的酵母的繁殖
<1>用于置换降低型谷胱甘肽合成酶基因的盒(cassette)的制备
(1)用于置换G3 87D型谷胱甘肽合成酶基因的盒的制备
在生产商所示的条件下，应用引物F1(CATAAAACAACTGAAGCGTTAGCTC(SEQ ID NO：3))和R1(CAGGCCAAAGATTTTCAGTACGAGC(SEQ ID NO：4))和PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo)通过聚合酶链反应(PCR)方法扩增了一个区域，该区域编码从S2菌株谷胱甘肽合成酶基因可读框(ORF)的中游到ORF下游约40bp的区段。
将如上所述扩增的基因片段纯化，并在下面条件下于72℃进行10分钟的酶促反应以向每一个末端添加核苷酸A。
(反应混合物组成)
基因片段溶液 5μl
10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mM dATP 5μl
Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo) 0.5μl
纯化的水 31.5μl
总计 50μl
根据生产商的说明书将上述反应产物与质粒pGEM-T Easy(Promega Corporation)连接以获得质粒GSH2MS41/pGEM。
下一步，通过位点专一性突变，使与包含于GSH2MS41/pGEM中的谷胱甘肽合成酶基因中第387个氨基酸(Gly)相应的密码子(GGT)由Asp密码子(GAT)替代。该操作是根据由生产商提供的规程通过应用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)进行的。应用引物F2(CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG(SEQ IDNO：5))和引物R2(CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG(SEQID NO：6))作为引物。因而，制备了质粒GSH2MS41dash/pGEM。
另一方面，制备了相应于质粒pYES2(Invitrogen)的质粒，其中去除了2μori。用限制性内切酶Ssp I和Nhe I切割pYES2并使切割的末端形成平端，然后再次环化以获得质粒pYES2dash。将pYES2dash和GSH2MS41dash/pGEM各自用限制性内切酶Sac I和SphI切割以从pYES2dash中切除含有URA3基因的片段及从GSH2MS41dash/pGEM中切除具有突变的谷胱甘肽合成酶基因片段，并将这些相互进行连接。从而制备了质粒GSH2MS41dash/pYES2dash。用限制性内切酶Mun I消化GSH2MS41dash/pYES2dash以获得盒1。
(2)用于置换T47I-型谷胱甘肽合成酶基因的盒的制备
在生产商所示的条件下，应用引物F3(CTAATATGGATGTCGGCAACCCAAG(SEQ ID NO：7，相应于编码谷胱甘肽合成酶的GSH2基因ORF上游约700碱基对的区域))和引物R3(CCACAGCTTTGGCCAATGCCTTAG(SEQ ID NO：8))和Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)通过聚合酶链反应(PCR)方法扩增了一个片段，该片段包括S2菌株的谷胱甘肽合成酶基因。
将如上所述扩增的基因片段纯化，并在与上述相同的条件下于72℃进行10分钟的酶促反应以向每一个末端添加核苷酸A。
根据由生产商提供的说明书将如上所述获得的反应产物与质粒pGEM-T Easy(Promega)连接以获得质粒GSH2FD63/pGEM。
下一步，使与包含于GSH2FD63/pGEM中的谷胱甘肽合成酶基因中第47个氨基酸Thr相应的密码子(ACT)由Ile密码子(ATT)替代。该操作是根据由生产商提供的规程通过应用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)进行的。应用引物F4(CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC(SEQ ID NO：9))和引物R4(GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG(SEQ IDNO：10))作为引物。因而，制备了质粒GSH2FD63dash/pGEM。
将pYES2dash和GSH2FD63dash/pGEM各自用限制性内切酶SacI和Sph I切割以从pYES2dash中切除含有URA3基因的片段及从GSH2FD63dash/pGEM中切除具有突变的谷胱甘肽合成酶基因片段，并将这些相互进行连接。从而制备了质粒GSH2FD63dash/pYES2dash。用限制性内切酶切割GSH2FD63dash/pYES2dash以获得盒2。
<2>带有降低型谷胱甘肽合成酶的酵母的繁殖
(1)带有G387D-型谷胱甘肽合成酶的酵母的繁殖
应用如上所述制备的盒1，进行了S2菌株谷胱甘肽合成酶基因的基因置换。在对S2菌株进行预先培养后，将培养物传代培养于50mlYPD培养基中，并培养到对数生长期为止。将培养的细胞悬浮于1M山梨糖醇中，并将盒1混合以通过电穿孔进行转化。将转化体菌株培养于含有1mM谷胱甘肽的SD平板上，并对在其上生长的菌株进行选择。在通过PCR证实盒1插入到染色体的目标位点后，将获得的菌株命名为K2中间体。将K2中间体进行培养并涂布在SDFOA琼脂培养基上。然后从生长的菌株中获得了其中谷胱甘肽合成酶由G387D-型置换的酵母K2菌株。
与酿酒酵母谷胱甘肽合成酶基因报道的核苷酸序列(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320，GenBank编号Y13804)比较的结果显示K2菌株的突变型谷胱甘肽合成酶基因除上述G387D-型突变之外还具有在位置54由亮氨酸残基密码子(CCT)对脯氨酸残基密码子(CCT)的替代。
(2)带有T47I-型谷胱甘肽合成酶的酵母的繁殖
应用如上所述制备的盒2，进行了S2菌株谷胱甘肽合成酶基因的基因置换。在对S2菌株进行预先培养后，将培养物传代培养于50mlYPD培养基中，并培养到对数生长期为止。将培养的细胞悬浮于1M山梨糖醇中，并将盒2混合以通过电穿孔进行转化。将转化体菌株培养于含有1mM谷胱甘肽的SD平板上，并对在其上生长的菌株进行选择。在通过PCR方法证实盒2插入到染色体的目标位置后，将获得的菌株命名为K3中间体。将K3中间体进行培养并涂布在SDFOA琼脂培养基上。将生长的转化体涂布在SDFOA琼脂培养基上，并对生长的菌株进行选择以获得在其中引入了基因置换盒2的K3中间体菌株。将K3中间体菌株进行培养并涂布在SDFOA琼脂培养基上。然后从生长的菌株中获得了其中谷胱甘肽合成酶由T47I-型置换的酵母K3菌株。
与酿酒酵母谷胱甘肽合成酶基因报道的核苷酸序列(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320，GenBank编号Y13804)比较的结果显示K3菌株突变型谷胱甘肽合成酶基因除上述T47I-型突变之外还具有在位置54由亮氨酸残基密码子(CCT)对脯氨酸残基密码子(CCT)的替代。
(3)二倍体酵母的制备
通过常规方法使具有G387D-型突变型谷胱甘肽合成酶的单倍体酵母(MATα)(K2菌株)与单倍体酵母(MATa)交配以获得二倍体酵母。通过常规方法使二倍体酵母形成孢子以获得具有G387D-型突变型谷胱甘肽合成酶的单倍体酵母(MATa)。然后，使具有G387D-型突变型谷胱甘肽合成酶的单倍体酵母(MATα)和具有G387D-型突变型谷胱甘肽合成酶的单倍体酵母(MATa)相互交配以获得二倍体酵母Z1菌株，该Z1菌株以纯合子的形式具有G387D-型突变型谷胱甘肽合成酶。以相似的方式也获得了具有T47I-型突变型谷胱甘肽合成酶的二倍体酵母Z2菌株。人们证实Z1和Z2菌株以每个干酵母细胞1％或更多的量累积γ-谷氨酰半胱氨酸。
<3>对具有突变型谷胱甘肽合成酶的酵母生长及其γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的研究
(1)K2和K3菌株的生长
将K1、K2和K3菌株培养于SD培养基(含有必需量的尿嘧啶)或含有1mM谷胱甘肽的SD培养基(含有必需量的尿嘧啶)中。对其生长的测量开始于当酵母生长达到对数生长期及660nm的吸收为1.4或更大时。获得的结果显示于图1～3中。
K2菌株在含有谷胱甘肽的培养基上的特定生长速率(每1小时生长的程度)为1.171，而它在不含谷胱甘肽的培养基上的特定生长速率为1.161。K3菌株的特定生长速率在含有谷胱甘肽的培养基上为1.169，而在不含谷胱甘肽的培养基上为1.156。如在图1～3和特定生长速率中显而易见的，K2和K3菌株在不含谷胱甘肽的培养基上也生长良好，因此比谷胱甘肽合成酶基因被破坏的菌株更适合于在工业水平上进行培养。因此，具有G387D-型或T47I-型谷胱甘肽合成酶的酵母可有利地用于在工业水平上培养于不含或含有少量谷胱甘肽的培养基上。
(2)K2和K3菌株的γ-谷氨酰半胱氨酸生产力
将K1、K2和K3菌株培养于SD培养基(含有必需量的尿嘧啶)中。对其生长和γ-谷氨酰半胱氨酸累积量的测量开始于当酵母生长达到对数生长期及660nm的吸收为1.4或更大时。菌株的特定生长速率分别为1.104、1.161和1.156。K2和K3菌株以每个干酵母细胞0.001％或更多及0.006％或更少的量累积谷胱甘肽。对数生长期中每一个菌株每个干酵母细胞的γ-谷氨酰半胱氨酸累积量如下。
表1 开始测量后的培养时间 γ-谷氨酰半胱氨酸(％) K1菌株 约2.6小时后 1.750 K1菌株 约5.3小时后 1.747 K2菌株 约1.5小时后 1.121 K2菌株 约3.8小时后 1.125 K3菌株 约1.5小时后 1.118 K3菌株 约3.8小时后 1.120
下一步，测量了每单位时间γ-谷氨酰半胱氨酸的生产力。当将每一个菌株在坂口烧瓶(Sakaguchi flask)中培养于50ml SD培养基(含有必需量的尿嘧啶)中时，通过每单位时间包含于该坂口烧瓶中的γ-谷氨酰半胱氨酸量的增加对每单位时间的γ-谷氨酰半胱氨酸生产力进行测量。该值受每个干细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸累积量和酵母生长速率的控制。该值对于K1菌株为0.116mg/小时，对于K2菌株为0.130mg/小时，而对于K3菌株为0.127mg/小时。
已报道以每个干酵母细胞按重量计算1％或更多的量含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其酵母提取物可用于增强食品的味道(WO00/30474)。因此，比K1菌株具有更大特定生长速率的K2和K3菌株有利于产生每个干酵母细胞含有1％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其酵母提取物。此外，K2和K3菌株每单位时间的γ-谷氨酰半胱氨酸生产力比K1菌株的更高。而且，由于K2和K3菌株含有0.001％或更多的谷胱甘肽，所以它们适合于在其中不含谷胱甘肽的工业水平上进行培养。从上述观点看，可认为具有G387D-型或T47I-型突变型谷胱甘肽合成酶的酵母适合于产生含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其酵母提取物。
(3)对K2和K3菌株传代培养稳定性的研究
将K2、K3、Z1和Z2菌株培养于YPD培养基上。将这些菌株各自传代培养10次，并检查是否发生了回复突变。传代培养进行如下。即将每一种菌株接种于含有4ml YPD液体培养基的试管中并于30℃进行振荡培养。在充分生长后，将一部分培养物传代培养于含有4mlYPD液体培养基的试管中。将该操作重复10次。
是否发生了回复突变证实如下。即从液体培养基中收集酵母细胞并收集其染色体DNA，随后证实突变位点的核苷酸序列。此外，对当于30℃培养于含有10-mM甲基乙二醛的SD琼脂培养基(含有必需量的尿嘧啶)上时是否存在生长进行了证实。这些结果证明了K2、K3、Z1和Z2菌株传代培养的稳定性。
(4)对P57L突变的研究
研究了P54L突变对突变型谷胱甘肽合成酶的影响。
制备了含有谷胱甘肽合成酶基因的质粒，该谷胱甘肽合成酶基因具有T47I-型或G387D-型突变。应用pEGSH2作为含有谷胱甘肽合成酶基因的质粒。该质粒根据描述于文献中的方法制备(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320)。
首先，使与质粒pEGSH2的谷胱甘肽合成酶基因中第47个氨基酸Thr相应的密码子(ACT)由Ile的密码子(ATT)替代。该操作是根据生产商的规程应用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)进行的。应用引物F4(CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC(SEQ ID NO：9))和引物R4(GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG(SEQ IDNO：10))作为引物。因而，构建了质粒pEGSH2-T47I。
下一步，使与质粒pEGSH2的谷胱甘肽合成酶基因中第387个氨基酸Gly相应的密码子(GGT)由Asp的密码子(GAT)替代。该操作是根据生产商的规程应用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)进行的。应用引物F2(CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG(SEQ ID NO：5))和引物R2(CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG(SEQ IDNO：6))作为引物。因而，构建了质粒pEGSH2-G387D。
另一方面，显示尿嘧啶必需型的K1dash菌株可如下从K1菌株获得。即，将K1菌株在YPD培养基中于30℃培养80小时，并将培养物涂布在SDFOA平板上。从在SDFOA平板上生长的酵母中选择酵母菌株K1dash，该菌株显示尿嘧啶必需型且其谷胱甘肽合成酶已被破坏。
将如上所述获得的K1dash菌株分别用上述质粒pEGSH2、pEGSH2-T47I和pEGSH2-G387D进行转化以获得pEGSH2/K1dash、pEGSH2-T47I/K1dash和pEGSH2-G387D/K1dash。用每一种质粒对K1dash菌株的转化进行如下。即在对K1dash菌株进行预先培养后，将培养物传代培养于50ml YPD培养基中，并培养到对数生长期为止。将培养的细胞悬浮于1M山梨糖醇中，混合目标质粒，并通过电穿孔进行转化。将转化体培养于含有1mM谷胱甘肽的SD琼脂培养基上，并对在其上生长的菌株进行选择。
将pEGSH2/K1dash、pEGSH2-T47I/K1dash和pEGSH2-G387D/K1dash菌株在SD培养基上于30℃振荡培养30小时，并将培养物以2％的浓度接种于SD培养基中，然后于30℃进行振荡培养。对其对数生长期(该培养开始后10小时)中细胞中累积的谷胱甘肽的量进行了测量。谷胱甘肽在pEGSH2/K1dash菌株的情形中以约0.80％的量累积，而在pEGSH2-T47I/K1dash和pEGSH2-G387D/K1dash菌株的情形中以0.001～0.006％的量累积。
上述结果显示单独具有突变T47I或G387D而不具有突变P54L的酵母可具有降低的谷胱甘肽合成酶活性，且可在细胞中含有微量的谷胱甘肽，因此可对γ-谷氨酰半胱氨酸的高生产力有贡献。
工业适用性
根据本发明，提供了一种带有降低活性的突变型谷胱甘肽合成酶且产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母。本发明的酵母可用于生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品或含有半胱氨酸的食品。
序列表
<110>味之素公司
<120>产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母
<130>C032MKOP1420
<140>
<141>2002-11-21
<150>JP 2001-359782
<151>2001-11-26
<160>10
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>2630
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1476)
<400>1
atg gca cac tat cca cct tcc aag gat caa ttg aat gaa ttg atc cag 48
Met Ala His Tyr Pro Pro Ser Lys Asp Gln Leu Asn Glu Leu Ile Gln
1 5 10 15
gaa gtt aac caa tgg gct atc act aat gga tta tcc atg tat cct cct 96
Glu Val Asn Gln Trp Ala Ile Thr Asn Gly Leu Ser Met Tyr Pro Pro
20 25 30
aaa ttc gag gag aac cca tca aat gca tcg gtg tca cca gta act atc 144
Lys Phe Glu Glu Asn Pro Ser Asn Ala Ser Val Ser Pro Val Thr Ile
35 40 45
tat cca acc cca att cct agg aaa tgt ttt gat gag gcc gtt caa ata 192
Tyr Pro Thr Pro Ile Pro Arg Lys Cys Phe Asp Glu Ala Val Gln Ile
50 55 60
caa ccg gta ttc aat gaa tta tac gcc cgt att acc caa gat atg gcc 240
Gln Pro Val Phe Asn Glu Leu Tyr Ala Arg Ile Thr Gln Asp Met Ala
65 70 75 80
caa cct gat tct tat tta cat aaa aca act gaa gcg tta gct cta tca 288
Gln Pro Asp Ser Tyr Leu His Lys Thr Thr Glu Ala Leu Ala Leu Ser
85 90 95
gat tcc gag ttt act gga aaa ctg tgg tct cta tac ctt gct acc tta 336
Asp Ser Glu Phe Thr Gly Lys Leu Trp Ser Leu Tyr Leu Ala Thr Leu
100 105 110
aaa tct gca cag tac aaa aag cag aat ttt agg cta ggt ata ttt aga 384
Lys Ser Ala Gln Tyr Lys Lys Gln Asn Phe Arg Leu Gly Ile Phe Arg
115 120 125
tca gat tat ttg att gat aag aaa aag ggt act gaa cag att aag csa 432
Ser Asp Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Lys Gly Thr Glu Gln Ile Lys Gln
130 135 140
gtc gag ttt aat aca gtg tca gtg tca ttt gca ggc ctt agc gag aaa 480
Val Glu Phe Asn Thr Val Ser Val Ser Phe Ala Gly Leu Ser Glu Lys
145 150 155 160
gtt gat aga ttg cac tct tat tta aat agg gca aac aag tac gat cct 528
Val Asp Arg Leu His Ser Tyr Leu Asn Arg Ala Asn Lys Tyr Asp Pro
165 170 175
aaa gga cca att tat aat gat caa aat atg gtc att tct gat tca gga 576
Lys Gly Pro Ile Tyr Asn Asp Gln Asn Met Val Ile Ser Asp Ser Gly
180 185 190
tac ctt ttg tct aag gca ttg gcc aaa gct gtg gaa tcg tat aag tca 624
Tyr Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ala Lys Ala Val Glu Ser Tyr Lys Ser
195 200 205
caa caa agt tct tct aca act agt gat cct att gtc gca ttc att gtg 672
Gln Gln Ser Ser Ser Thr Thr Ser Asp Pro Ile Val Ala Phe Ile Val
210 215 220
caa aga aac gag aga aat gtg ttt gat caa aag gtc ttg gaa ttg aat 720
Gln Arg Asn Glu Arg Asn Val Phe Asp Gln Lys Val Leu Glu Leu Asn
225 230 235 240
ctg ttg gaa aaa ttc ggt acc aaa tct gtt agg ttg acg ttt gat gat 768
Leu Leu Glu Lys Phe Gly Thr Lys Ser Val Arg Leu Thr Phe Asp Asp
245 250 255
gtt aac gat aaa ttg ttc att gat gat aaa acg gga aag ctt ttc att 816
Val Asn Asp Lys Leu Phe Ile Asp Asp Lys Thr Gly Lys Leu Phe Ile
260 255 270
agg gac aca gag cag gaa ata gcg gtg gtt tat tac aga acg ggt tac 864
Arg Asp Thr Glu Gln Glu Ile Ala Val Val Tyr Tyr Arg Thr Gly Tyr
275 280 285
aca acc act gat tac acg tcc gaa aag gac tgg gag gca aga cta ttc 912
Thr Thr Thr Asp Tyr Thr Ser Glu Lys Asp Trp Glu Ala Arg Leu Phe
290 295 300
ctc gaa aaa agt ttc gca ata aag gcc cca gat tta ctc act caa tta 960
Leu Glu Lys Ser Phe Ala Ile Lys Ala Pro Asp Leu Leu Thr Gln Leu
305 310 315 320
tct ggc tcc aag aaa att cag caa ttg ttg aca gat gag ggc gta tta 1008
Ser Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln Leu Leu Thr Asp Glu Gly Val Leu
325 330 335
ggt aaa tac atc tcc gat gct gag aaa aag agt agt ttg tta aaa act 1056
Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Glu Lys Lys Ser Ser Leu Leu Lys Thr
340 345 350
ttt gtc aaa ata tat ccc ttg gat gat acg aag ctt ggc agg gaa ggc 1104
Phe Val Lys Ile Tyr Pro Leu Asp Asp Thr Lys Leu Gly Arg Glu Gly
355 360 365
aag agg ctg gca tta agt gag ccc tct aaa tac gtg tta aaa cca cag 1152
Lys Arg Leu Ala Leu Ser Glu Pro Ser Lys Tyr Val Leu Lys Pro Gln
370 375 380
cgg gaa ggt ggc gga aac aat gtt tat aaa gaa aat att cct aat ttt 1200
Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn Val Tyr Lys Glu Asn Ile Pro Asn Phe
385 390 395 400
ttg aaa ggt atc gaa gaa cgt cac tgg gat gca tat att ctc atg gag 1248
Leu Lys Gly Ile Glu Glu Arg His Trp Asp Ala Tyr Ile Leu Met Glu
405 410 415
ttg att gaa cca gag ttg aat gaa aat aat att ata tta cgt gat aac 1296
Leu Ile Glu Pro Glu Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ile Leu Arg Asp Asn
420 425 430
aaa tct tac aac gaa cca atc atc agt gaa cta gga att tat ggt tgc 1344
Lys Ser Tyr Asn Glu Pro Ile Ile Ser Glu Leu Gly Ile Tyr Gly Cys
435 440 445
gtt cta ttt aac gac gag caa gtt tta tcg aac gaa ttt agt ggc tca 1392
Val Leu Phe Asn Asp Glu Gln Val Leu Ser Asn Glu Phe Ser Gly Ser
450 455 460
tta cta aga tcc aaa ttt aat act tca aat gaa ggt gga gtg gcg gca 1440
Leu Leu Arg Ser Lys Phe Asn Thr Ser Asn Glu Gly Gly Val Ala Ala
465 470 475 480
gga ttc gga tgt ttg gac agt att att ctt tac tag gtgtacatgt 1486
Gly Phe Gly Cys Leu Asp Ser Ile Ile Leu Tyr
485 490
actatacaca tagatgctag gaagatgatg ctagaacttg attaacaatt agttaaggaa 1546
tatataatca cacttctaca taaatttgct gttttaggct cattccttct ttctttcacc 1606
ctttagtagc gaagtacacc atttagctgc accaacagtg ttgctagata tggtgactat 1666
tgtgaagaag ggtattaaGt ctagtagacc ggcagacata ccgaaacata tgaaacttgc 1726
gtaatgctcg tactgaaaat ctttggcctg tttcttactg aatcccttta gtaaaaagta 1786
cctctgcaaa taggtaaagg ttctttttgg ggccattagt tgatttgcca agattggtcc 1846
tacaatagga attagcgaca gtaatgttag tgaagtaaaa ttggagactt taaaaaacat 1906
tctgaatagt aatctgggaa tcttaaaaat ccgacttccc tttattgtgt tgaaatttct 1966
caccgcatca ggttcatcga tttttctatg tggcttttgt ggtttaggca ataccttcac 2026
ctcgtttaga aattcatctt ggtcttgcaa caccaaagat atatcaaata tctgattcgt 2086
aatatgggtc aggaccagtg ttctacaaac aaaggcagtc aagacattcg tttgtaaaat 2146
ccattgaata tgaaccagta tcacaccaag aggccctaat aacagtatgg cccatgtcac 2206
taaaagcggt acaagtgtga cataaaagag accagcaata gtgacaaaaa tcagggcata 2266
gcaaaccgca aacagtaaaa tatgcttcca ataaacagga ttcgtcagca cttcataaaa 2326
cccctacggt taacaaataa aaattaaata tgttagtcat aaaacaagtc atatcaatgc 2386
aaacaaaaat catgtactta ctaagaatgg gtagataaat gctcttgagt tgaaa tttc 2446
tttaatgaag ttttttctaa 2476
<210>2
<211>491
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>2
Met Ala His Tyr Pro Pro Ser Lys Asp Gln Leu Asn Glu Leu Ile Gln
1 5 10 15
Glu Val Asn Gln Trp Ala Ile Thr Asn Gly Leu Ser Met Tyr Pro Pro
20 25 30
Lys Phe Glu Glu Asn Pro Ser Asn Ala Ser Val Ser Pro Val Thr Ile
35 40 45
Tyr Pro Thr Pro Ile Pro Arg Lys Cys Phe Asp Glu Ala Val Gln Ile
50 55 60
Gln Pro Val Phe Asn Glu Leu Tyr Ala Arg Ile Thr Gln Asp Met Ala
65 70 75 80
Gln Pro Asp Ser Tyr Leu His Lys Thr Thr Glu Ala Leu Ala Leu Ser
85 90 95
Asp Ser Glu Phe Thr Gly Lys Leu Trp Ser Leu Tyr Leu Ala Thr Leu
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Ser Asp Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Lys Gly Thr Glu Gln Ile Lys Gln
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Val Glu Phe Asn Thr Val Ser Val Ser Phe Ala Gly Leu Ser Glu Lys
145 150 155 160
Val Asp Arg Leu His Ser Tyr Leu Asn Arg Ala Asn Lys Tyr Asp Pro
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Tyr Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ala Lys Ala Val Glu Ser Tyr Lys Ser
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Gln Arg Asn Glu Arg Asn Val Phe Asp Gln Lys Val Leu Glu Leu Asn
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Leu Leu Glu Lys Phe Gly Thr Lys Ser Val Arg Leu Thr Phe Asp Asp
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Arg Asp Thr Glu Gln Glu Ile Ala Val Val Tyr Tyr Arg Thr Gly Tyr
275 280 285
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Leu Lys Gly Ile Glu Glu Arg His Trp Asp Ala Tyr Ile Leu Met Glu
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Gly Phe Gly Cys Leu Asp Ser Ile Ile Leu Tyr
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<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
cataaaacaa ctgaagcgtt agctc 25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
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caggccaaag attttcagta cgagc 25
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
ccacagcggg aagatggcgg aaacaatg 28
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
cattgtttcc gccatcttcc cgctgtgg 28
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<211>25
<212>DNA
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<220>
<223>人工序列的描述：引物
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ctaatatgga tgtcggcaac ccaag 25
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
ccacagcttt ggccaatgcc ttag 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
cggtgtcacc agtaattatc tatccaaccc c 31
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<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
ggggttggat agataattac tggtgacacc g 31