一种中性植酸酶、编码该酶的基因 以及含有该酶的饲料 本发明涉及一种植酸酶，编码这种植酸酶的基因和含有这种酶的饲料。
磷是一种所有动物生长都需要的重要矿物质。磷占动物机体矿物质总量的四分之一还多，其中80％的磷以羟磷灰石的形式存在于骨胳中。骨骼不仅作为身体的骨架，而且也是钙、磷和其他矿物质的贮存库，当需要时它们能动员到其它组织中。另外的20％的磷存在于肌肉、血液和其它软骨组织中，它们作为许多有机化合物的组成成分，参与体内几乎每一种生命所需的生理生化反应。由于磷有如此重要的生物学功能，所以在动物日粮中提供充足的磷是非常重要的。否则，组织的生长受到抑制、骨骼变软变脆，长期磷缺乏会导致生长动物地佝偻病和成年动物的骨质疏松症，从而影响动物的生长性能。
目前在单胃动物如鸡、猪等饲料和鱼类饲料中是添加无机磷如磷酸氢钙、磷酸二氢钙来满足动物对磷的需求。但是在主要以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷，只不过是因为它们主要以动物不能利用的植酸磷的形式存在而已。
植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1-5％(Lolas M.Et a1.Food Sci.42：1094-1097，1977).它占植物中总磷的60-80％(Nelson T.S.Poultry Sci.47：862-871，1967).但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.AlltechTechnical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，其利用率仅在0-40％。
植酸磷不能被单胃动物和鱼类有效利用，从而在饲喂过程中造成了许多问题，第一、造成磷源浪费。一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中额外添加无机磷，提高了饲料成本。在实际生产中，添加无机磷时还常因无机磷中残留有氟、重金属等元素而造成动物中毒。第二、形成高磷粪便而污染环境。饲料中85％左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的磷使水和土壤受到严重污染。目前许多欧洲国家如荷兰等已因此问题开始限制畜禽的养殖数量。我国是畜牧生产大国，单胃动物占畜禽总数的比例远高于西方国家，因此，防止磷对环境的污染在我国更具有特殊的意义。第三、植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养元素的有效利用(Sharma C.B.et al.，Phytochemistry.17：201-204，1978)。
植酸酶(EC.3.1.3.8)是一种能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。植酸酶广泛存在于微生物中，如假单孢杆菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.23：1207-1220，1970)，乳酸杆菌(Shirai K.，LettersAppl.Biol.Sci.19：366-369，1994)，大肠杆菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303：107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.17：24-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.32：1275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)。其中来源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)具有较好的耐热性，在酸性条件下有较高的酶活性，被认为是目前最有应用前景的饲用植酸酶，它的最适pH值为2.5和5.5，最适温度为55℃，特异比酶活性为1×105U/mg酶蛋白。
植酸酶对单胃动物的饲喂效果已在世界范围内得到了确证(Ware J.H.et al.，US Patent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 101：1289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.47：1842-1848，1968)。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。
以往的研究都集中在用于单胃畜禽动物饲料中的酸性植酸酶，多种微生物来源的酸性植酸酶的编码基因已被分离克隆，如来源于酵母Saccharomyces cerevisiae(Bajwa et al.，1984；Meyhack et al.，1982)、Aspergillus niger(MacRae，1988)、A.terreus和Myceliophthora thermophila(Van Loon，1995)、A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt et al.，1993；Ehlich etal.，1993；Bin Y et al.，1998)、A.niger var.awamori(Piddington et al.，1993)、Talaromyces thermophilus(Pasamontes L et al.，1997)、Talaromyceslanuginosus(Berka R M et al.，1998)、Emericella nidulans(Pasamontes L et al.1997)、Schwanniomyces occidentalis(Mochizuki，1998)等的植酸酶。这些植酸酶的最适pH都在6.0以下，在pH6.5以上基本没有酶活性。
但这些植酸酶却不能用于无胃的鱼类饲料中。绝大多数淡水鱼类如清鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲂鱼等和部分海水养殖鱼类均是无胃鱼类。对单胃畜禽而言，植酸酶的主要作用场所是单胃动物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性条件下要有较高的酶活性，即酶反应的最适pH值为酸性的植酸酶，如国外目前商品化生产的来源于A.ficuumNRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom et al.，1995)，它的最适pH值为2.5和5.5。我国用基因工程酵母生产的植酸酶PHYA2最适pH值为1.8和5.5(姚斌等，中国专利公开号：CN1184156A)。
而对于淡水养殖的主要鱼类来说，它无胃，只有pH值呈中性(pH6.5～8.0)的肠道，因而在鱼类饲料中必需使用在中性pH值条件下有高活性的植酸酶。目前商品化生产的用于单胃畜禽的植酸酶在中性pH值环境下基本没有酶活性，因而不能用于这些鱼类饲料。本发明所述的具有中性植酸酶活性的植酸酶是指最适pH在6-9的植酸酶。
本发明的一个目的是筛选一种反应最适pH在中性的、能用于无胃鱼类的中性植酸酶并克隆中性植酸酶的编码基因，为进一步通过基因工程的方法，利用重组生物反应器来工业化廉价生产中性植酸酶提供基因资源。
本发明人提出了一种新思路，即在如淡水鲤科鱼类等无胃鱼类饲料中应用中性植酸酶，从而提高鱼类饲料中磷的利用率、降低饲料成本、提高鱼类的生产性能、减轻水域的磷污染。目前，国内外还未有人提出在鱼类饲料中应用中性植酸酶的思路，也未有中性植酸酶的生产及在鱼类饲料中的实际应用。
本发明筛选到一种天然菌株，它所产生的植酸酶适合于在鱼类饲料中使用。这种植酸酶必须在中性pH范围内具有高的酶活性。本发明筛选到的枯草芽胞杆菌酸Bacillus subtilis 98所产生的植酸酶的最适pH值为7.5，在中性的范围内。这种性质使其具备了优良的特性，适合应用于淡水鱼类饲料，在鱼的肠道中起作用。这种性质的植酸酶还未曾有过报道，例如，国外目前商品化生产的来源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom et al.，1995)的最适pH为5.5和2.5，在pH6以上基本没有活性，只能应用于单胃动物饲料中而不能用于淡水鱼类饲料中。
本发明的筛选到的天然菌株所产生的植酸酶在常温下具有高活性，即中温型植酸酶，因为这种植酸酶在鱼类饲料中应用时，它的作用场所是鱼类的肠道中，而鱼肠道的温度在15～30℃。本发明筛选到的Bacillussubtilis 98中性植酸酶最适温度为55℃，为中温型植酸酶，在15～30℃的范围内具有较高活性。
实验结果证明，这种中性植酸酶具有良好的饲喂效果，一方面添加中性植酸酶可以显著提高鲤鱼对饲料中磷的表观消化率，减少单位增重的磷排出量，可以减轻磷污染。另一方面每kg饲料中添加1000U的中性植酸酶可以满足鲤鱼正常生长对磷的需要，其生长效果与添加1.3％的磷酸二氢钙相同，无需额外添加无机磷。这是首次证明了中性植酸酶适合于在无胃鱼类饲料应用并有良好的饲喂效果。
本发明还提供了编码本发明的中性植酸酶的基因，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。通过PCR的方法分离克隆了这一植酸酶基因nphyA，DNA全序列分析结果表明，此基因全长1152个核苷酸，编码383个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则推断，N-端的26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的Ala之后，这一结果与成熟酶的N端氨基酸序列测定结果一致。此中性植酸酶的基因序列与以往大量报道的来源于丝状真菌和植物的植酸酶基因均无同源性，也不含有丝状真菌和植物来源的植酸酶蛋白中均存在的高度保守序列：RHGARYPT。
本发明还提供了一种使它能在各种表达系统中高效表达的方法，包括植酸酶基因改造和表达系统的选择。基因的改造可利用PCR技术、定点突变技术、基因设计后化学合成等技术来实现。可选择的表达系统包括低等真核表达系统如酵母、丝状真菌等；原核表达系统大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、杆状病毒等；高等真核表达系统如玉米、大豆、水稻、猪、鸡、鸭及各种鱼类和昆虫等。本发明中，我们通过PCR的方法将植酸酶基因nphyA原有的信号肽序列除掉，改造后的植酸酶基因以正确的阅读框架插入到大肠杆菌高效表达载体pTYB40上，转化到大肠杆菌中，得到重组菌株，重组菌株均培养后表达中性植酸酶蛋白。结果表明，中性植酸酶在大肠杆菌中得到了高效表达，表达的中性植酸酶蛋白约40Kda，与根据氨基酸序列推导出来的理论分子量相一致，其表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40％左右，并具有正常的生物学活性。表达的中性植酸酶蛋白与天然菌株Bacillus subtilis 98中的植酸酶相比，在酶学性质上无显著差异。
本发明分离了一种酶学性质优良、适合于在淡水鱼类饲料中使用的新的植酸酶，并进一步克隆了其编码基因。提供了一种在表达系统中高效表达植酸酶基因的方法。
菌株筛选按常规方法(Cosgrove，D.J.et al.Aust.J.Biol.Sci.23：339-343，1970)从土壤中筛选分泌植酸酶的天然菌株，进一步对所产植酸酶进行生理生化性质研究(Vallah A.H.J.Prep.Biochem.，18：459-471，1988)，筛选出具有高活性并且适于在无胃鱼类饲料中使用的中性植酸酶产生菌株Bacillus subtilis 98。此菌株作为进一步研究的供体材料。同样的筛选方法也可用来筛选各种各样特定性质的植酸酶产生菌。
植酸酶基因克隆从Bacillus subtilis 98中提取基因组DNA，通过PCR方法(Maniatis T.，et al.Molecular cloning.New York：Cold Spring harborlaboratory，1982)钓出植酸酶基因nphyA，然后克隆到大肠杆菌的质粒克隆载体如pPUC18、pPGEM等上，并进一步对此基因进行全序列分析。类似的方法也适用于从别的菌株中克隆不同的植酸酶基因。
植酸酶基因改造通过PCR、突变等DNA体外操作的方法，去掉或改造植酸酶基因中的影响其在大肠杆菌表达体系中高效表达的因素，提供其在重组大肠杆菌中的表达量。类似思路也同样可用来改造植酸酶基因使它在别的表达系统中高效表达，如借助杆状病毒的昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统等。植酸酶基因改造的具体方法可选用PCR方法、定点突变、基因人工设计合成等。
重组高效表达体系的构建 选择高效表达系统大肠杆菌作为表达nphyA的生物反应器。通过转化将含有nphyA的重组表达质粒体进入大肠杆菌细胞中，筛选出阳性重组子。别的真核表达系统如杆状病毒的昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统等也适应与此植酸酶基因的高效表达。
动物饲喂实验 使用不同剂量的中性植酸酶代替鲤鱼饲料中所添加的磷酸二氢钙，测定日增重和料肉比等生产指标，各指标均以重复组为数据单位。分别在饲喂的第5天、15天、35天以处理组为单位收集粪便，测定粪样中磷含量，计算饲料磷、单位增重磷排出量。各种无胃鱼类的饲喂实验均可用类似的实验来验证中性植酸酶的饲喂效果及确定中性植酸酶的使用剂量和方法。
由于Bacillus subtilis 98产生的植酸酶在鲤鱼等无胃鱼类中有良好的饲喂效果，使之在饲料工业中极具应用潜力，它的编码基因是构建各种生产中性植酸酶的基因工程生物反应器的优良材料。它能够在各种真核表达系统如酵母、曲霉、杆状病毒、动物、植物等生物反应器中应用。
图1 Bacillus subtilis 98在含植酸钙平板上形成的透明水解圈
图2中性植酸酶的SDS-PAGE分析
1.培养基上清液；2.85％(NH4)2SO4沉淀；3，4.HPLC纯化；
5.标准蛋白分子量
图3中性植酸酶的最适pH
图4.中性植酸酶的pH稳定性
图5中性植酸酶的最适反应温度
图6.中性植酸酶的热稳定性
图7.来源于Bacillus subtilis 98的中性植酸酶结构基因序列及推导出的氨基酸序列
图8.重组表达制粒pTYB41的物理图谱
图9.在大肠杆菌中表达的中性植酸酶的SDS-PAGE
1.蛋白标准分子量；
2，3.分别为两个含重组质粒pTYB41的大肠杆菌重组子表达的 植酸酶
4.含质粒pTYB40的大肠杆菌四、实施例
实验一
1.菌株与载体 大肠杆菌菌株E.coli DH5a、质粒pUC19等购自Promega公司，表达质粒pTYB40由BioLabs inc.的pTYB4 C-末端融合载体去除Intein融合蛋白编码序列后得到，为本实验室保存。。
2.酶与试剂盒 限制性内切酶、连接酶、Taq酶、Mung bean酶为Boehringer公司产品。T7DNA sequence kit购于Pharmacia公司。
3.生化试剂 DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。
4.培养基 细菌营养肉汁平板：1％蛋白胨、0.3％牛肉膏、0.5％NaCl、1.5％琼脂，pH7.0；筛选平板：2％葡萄糖、0.2％CaCl2、0.5％NH4NO3、0.05％KCl、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％FeSO4·7H2O、0.001％MnSO4·H2O、0.1％植酸钙、1.5％琼脂，pH7.0；产酶培养基WBE：100g麸皮加到900mL水中，121℃处理60min，8层纱布过滤，滤液定溶到1L，在其中加入0.4g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.05g KH2PO4、0.04g K2HPO4、2g CaCl2、10g Casitone、，pH6.5；LB培养基：1％蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母提取物。
实验二本实验说明产生中性植酸酶的天然菌株的筛选程序。
土样按常规稀释后涂布于细菌营养肉汁平板上，28℃培养2～3d，挑取菌落转接到含植酸钙的筛选平板上，30℃培养3d，挑取产生透明消解圈的菌株(图1)。根据在含有植酸钙的筛选平板上形成的透明消解圈粗筛到分泌植酸酶的菌株8株，并对这些菌株进行了进一步分离纯化。所得到的菌株(枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis 98)于2000年11月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京，中关村)进行了保藏，保藏号为CGMCC No.0515。
为了从中筛选到在中性条件下具有高植酸酶活性的产生菌株，这些菌株在液体产酶培养基中培养3天，培养液经稀释后在pH值为7.5(Tris-HCl缓冲液)的酶促反应体系条件下测定其酶活性。酶活性标准测定方法如下：0.2mL的酶稀释液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸钠[用含1mmol/L CaCl2的0.25mmol/LTris-HCl(pH7.5)配制]，37℃保温30min，加入1mL 10％TCA终止酶活反应，然后加入2mL硫酸亚铁-钼酸铵显色液，700nm测定无机磷含量。对照为先在0.2mL的酶稀释液中加入1mLTCA使酶失活，再加入同体积的底物保温。酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmol无机磷所需的酶量为一个酶活性单位。结果发现有3株在此条件下有可检测的酶活性，其酶活性单位分别为0.8、1.1和2.0U/mL培养液。经生理生化鉴定，此3株菌均为枯草芽孢杆菌，分别定名为Bacillussubtilis 981，Bacillus subtilis 982和Bacillus subtilis 983。因Bacillus subtilis983分泌植酸酶较稳定且分泌量相对较大，被选为进一步研究的材料。
实验三本实验说明中性植酸酶NPHYA的纯化程序。
挑取菌株接种于细菌营养肉汁培养基中，30℃摇振培养过夜，按10％接种量接种于1L产酶培养基WBE中，于30℃下300r/min摇振培养4天。
中性植酸酶的纯化在4℃下完成。培养4天后的培养液，10000r/min离心20min去菌体，上清液中加入CaCl2至终浓度1mmol/L，加入3倍体积无水乙醇，混匀后-20℃过夜，1800g离心20min，沉淀用-20℃乙醇洗两次，冷冻干燥后重新溶解在100mL含1mmol/LCaCl2的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，缓慢加入硫酸铵至饱和度65％，4℃过夜，9000g离心60min，取上清液，加硫酸铵至饱和度达到85％，4℃过夜，9000g离心60min，弃上清液，沉淀溶于1mL含1mmol/LCaCl2的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中。植酸酶蛋白进一步用HPLC纯化(KTA FPLC，Pharmacia公司)纯化。含酶的浓缩液首先用HiPrep-26/10-Desalting柱脱盐，缓冲液为20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，流速为5mL/min，收集洗脱峰，接着用离子交换柱Hitrip-SP-Sepharose-XL(5mL)分离，A泵为20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，B泵为1mol/LNaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)高盐缓冲液，流速为2mL/min，高盐缓冲液从0～100％梯度洗脱10个柱床，分部收集洗脱峰，通过酶活性测定后的洗脱峰进一步用凝胶柱Superdex-75-HR-10/30纯化，缓冲液同样为20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，流速为0.5mL/min，收集洗脱峰得到纯蛋白。
在纯化过程中的乙醇沉淀、65％硫酸铵沉淀、85％硫酸铵沉淀、HPLC纯化等各步骤中进行酶活性测定，结果表明(表1)植酸酶蛋白的回收率分别为95％、60％、29％和18％。纯化完成后植酸酶蛋白的含量为362U/mL，比活性为150.8U/mg。SDS-PAGE结果表明(图2)，纯化后的植酸酶蛋白仅有一条单一的条带，中性植酸酶的分子量约为45KD。
表1 纯化植酸酶的比活性 酶样品 体积 /mL 蛋白质浓度 /mg/mL 比活性 /U/mg 总酶性 /U 回收率 /％培养上清液 500 0.3 6.7 1012 100乙醇沉淀后 30 2.4 13.4 963 9565％(NH4)2SO4沉淀后的上清液 33 0.2 92.0 607 6085％(NH4)2SO4沉淀后 2 1.3 113.5 295 29HPLC 0.5 2.4 150.8 181 18
实验四本实验说明中性植酸酶的酶学性质的测定方法。
中性植酸酶的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
经纯化的植酸酶在不同的pH值下进行酶促反应以测定其最适pH。底物植酸钠用不同pH的含1mmol/L CaCl2的0.2mmol/L缓冲液配制(pH1.0、pH2.0为HCl-KCl缓冲液；pH3.0为HCl-甘氨酸；pH4.0、5.0、5.6为HAc-NaAc缓冲液；pH6.0、6.4、6.8为Tris-Maleate缓冲液；pH7.2、7.5、8.0、8.6、9.0为Tris-HCl缓冲液；pH10为甘氨酸-NaOH缓冲液)，37℃和55℃测定酶活性。中性植酸酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理30min，再在Tris-HCl(pH7.5)缓冲液体系中37℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。纯化的植酸酶在不同pH的缓冲体系、37℃和55℃下测定的pH适性结果(图3)表明，37℃时酶最适pH为7.5，在pH6.5～8.5这一较宽的范围内，酶活性均在95％以上。55℃时最适pH变为7.0，相对37℃下测定的结果，在pH7.0～7.5这一范围以外，酶活性下降较快。无论是37℃还是55℃，pH在4.0以下和10.0以上，均检测不到酶活性。植酸酶在一系列不同pH缓冲液中37℃处理30min后，再在标准条件下测定其酶活性，结果表明(图4)，在pH6～12的范围内，剩余酶活性维持在90％以上，而pH低于6.0时，酶活性迅速下降，到pH3.0以下，已无酶活性，这说明此酶具有很好的耐碱性，但不耐酸。
中性植酸酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
中性植酸酶的最适温度的测定为在Tris-HCl(pH7.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为中性植酸酶在不同温度下处理60min和120min，再在37℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图5)表明，其最适温度为55℃。酶的热稳定性性试验表明(图6)，55℃处理60min和120min后，剩余酶活仅有50％左右，60℃下处理60min后，酶活性丧失了近90％，处理120min后酶活性基本上完全丧失。
中性植酸酶的Km值测定方法如下：
用不同的植酸钠底物浓度，在Tris-HCl(pH7.5)缓冲液体系中，37℃下测定酶活性，计算出其在37℃下的km值。经测定，此植酸酶在37℃下以植酸钠为底物的km之为0.19mmol/L。
中性植酸酶的底物特异性测定如下：
以不同的磷酸化合物作为底物，测定其酶活性。以植酸钠作为底物时的酶活性为100％，其它的磷化合物作为底物时的酶活性见表2，结果表明，以ATP和ADP为底物时酶的相对活性分别为52％和74％，别的5种底物均未有可检测的酶活性，这说明，此酶的底物特异性很强，植酸是它的特异性底物，这也证明了我们分离到的这种酶是植酸酶。
表2 中性植酸酶的底物特异性 底物 植酸钠 ADP ATP AMP 磷酸甘油 磷酸葡萄糖 磷酸硝基酚 1，6-磷酸果糖 相对酶活性/％ 100 74 52 0 0 0 0 0
阳离子对中性植酸酶活性的影响测定方法为：在酶促反应体系中加入不同的阳离子，研究不同阳离子对酶活性的影响。酶反应体系中加入不同浓度的Ca2+，结果表明，反应体系中无Ca2+时，检测不到酶活性，随着Ca2+浓度的提高，植酸酶活性逐步提高，Ca2+浓度达到1mmol/L时，酶活性达到最高值，再增加Ca2+浓度，酶活性无显著变化。这一结果说明来源于枯草芽胞杆菌的这种中性植酸酶的生物学活性依赖Ca2+存在。
Fe2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+等金属离子对酶活性均有不同程度的抑制作用，其中1mmol的Co2+、Cu2+和Zn2+抑制作用较为强烈，其剩余酶活性均在60％以下。
中性植酸酶蛋白的N端氨基酸序列：经氨基酸序列测定，纯化后的植酸酶蛋白的N端氨基酸序列为：Lys-His-Lys-Leu-Ser-Asp-Pro-Tyr-His-Phe-Thr。从这一部分氨基酸序列来看，与目前分离的来源于曲霉、酵母等真菌的植酸酶蛋白的N端氨基酸序列均无同源性，综合其分子量比真菌来源的植酸酶蛋白小得多这一事实，这说明它可能是另一类新的植酸酶。
实验五本实验说明中性植酸酶编码基因nphyA的分离克隆程序
Bacillus sbutilis 983菌株在LB培养基中28℃摇床培养24h，取5mL培养液离心沉淀菌体，沉淀重悬于25mL 1.0mol/L的NaCl中，4℃下剧烈振荡1h，离心后沉淀用25mL预冷的TES缓冲液(0.01mol/L Tris，pH8.0；0.025mol/L EDTA；0.15mol/L NaCl)洗一次，沉淀再悬浮于5mL TE缓冲液(不含NaCl的TES)中，加入0.5mL 2mg/mL的溶菌酶，37℃保温15min，再加入0.6mL的肌氨酰-蛋白酶溶液(10％肌氨酰和5mg/mL的蛋白酶溶于TE中)，37℃保温1h，细胞裂解液用苯酚、苯酚-氯仿、氯仿依次抽提，酒精沉淀DNA后溶于pH8.0的TE中备用。
根据测定的此中性植酸酶N端氨基酸序列合成简并引物，分别与20个随机引物组对PCR扩增中性植酸酶成熟蛋白的编码序列。含有成熟酶编码序列的PCR片段电泳回收后分别克隆到PGEM-T载体上，进行序列分析。根据序列分析的结果，再合成反向PCR引物，分别与随机引物组对后扩增基因5′端信号肽编码序列。
根据此成熟植酸酶N端氨基酸序列Lys-His-Lys-Leu-Ser-Asp-Pro-Tyr-His-Phe-Thr，合成简并引物，考虑到序列中第4和第5个氨基酸是由6个密码子编码的氨基酸，因而合成的引物从第6个，即Asp的密码子开始，设计的简并引物为：P1 5′GA(T/C)CC(A/T/G/C)TA(T/C)CA(T/C)TT(T/C)AC 3′
另一端的引物采用20个随机引物，分别与引物P1组对，以枯草芽孢杆菌总DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性1min、50℃退火45sec、72℃延伸1min；循环30轮后72℃保温10min。其中一组引物扩增到了约1.4kb的PCR片段。根据测定的此蛋白的分子量，推断此酶蛋白氨基酸个数在400个以下，相应的基因长度不超过1.2kb，如果此PCR片段为中性植酸酶编码基因，应该包括完整的结构基因3′端。挑取此1.4kb的PCR片段，将它克隆到pGEM-T载体上，进行序列测定。结果表明，在此片段有一个长1059bp的阅读框架，5′端编码的6个氨基酸与氨基酸序列测定结果相一致，初步判断为我们拟克隆的目的基因。
为了克隆酶蛋白N-端的信号肽编码序列，我们根据上述测定的序列结果，设计合成一段反向PCR引物P2：5′CAAGGCTGTAAACGAC 3′，此引物序列与成熟酶基因的+162-+178序列配对。同样与随机引物组对，进行PCR扩增，得到一约600bp的PCR片段，将它克隆到pGEM-T质粒上，进行序列分析。
综合这两段序列的结果，得到完整的中性植酸酶的结构编码基因nphy(图7)，此基因全长1152个核苷酸，编码383个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则推断，N-端的26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的Ala之后，这一结果与成熟酶的N端氨基酸序列测定结果一致。此中性植酸酶的基因序列与以往大量报道的来源于丝状真菌和植物的植酸酶基因均无同源性，也不含有丝状真菌和植物来源的植酸酶蛋白中均存在的高度保守序列：RHGARYPT。
实验六本实验说明在大肠杆菌中表达中性植酸酶的程序
为了了解此基因是否是中性植酸酶基因，我们将其转入大肠杆菌进行表达研究。
重组质粒的结构见图8.我们将去除了信号肽编码序列的中性植酸酶结构基因以正确的阅读框架克隆到载体pTYB40上紧接起始密码子ATG之后的NdeI位点上，得到重组质粒pTYB41，转化到大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆子进行诱导表达。由于pTYB40上已去除了融合蛋白Intein的编码序列，这样表达的中性植酸酶蛋白不带融合蛋白。
大肠杆菌重组子于5mL LB培养液(含100μg/mL Ap)中37℃培养过夜，按0.1％接种到20mL LB培养液(含100μg/mL Ap)中，37℃、300rpm培养至OD值达到0.6～0.8，加入IPTG终浓度为1mmol/L，30℃下诱导培养3h。
取1mL诱导培养物离心收集菌体，菌体用双蒸水洗2遍后重悬于100μL双蒸水中，加入等体积的2×SDS加样缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH6.8、200mmol/L DTT、4％SDS、0.2％溴酚兰、20％甘油)，100℃煮3分钟，取5μL上12％的聚丙烯酰胺凝胶。在大肠杆菌中表达的中性植酸酶蛋白的SDS-PAGE见图9。结果表明，中性植酸酶在大肠杆菌中得到了高效表达。在约40Kda处有一特异蛋白带，与根据氨基酸序列推导出来的理论分子量相一致，其表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40％左右。
用超声波破碎诱导后的菌体，15000rpm离心去除细胞碎片，上清液用来检测植酸酶活性。表达的中性植酸酶在不同的pH值下进行酶促反应以测定其最适pH。底物植酸钠用不同pH的含1mmol/L CaCl2的0.2mmol/L缓冲液配制(pH1.0、pH2.0为HCl-KCl缓冲液；pH3.0为HCl-甘氨酸；pH4.0、5.0、5.6为HAc-NaAc缓冲液；pH6.0、6.4、6.8为Tris-Maleate缓冲液；pH7.2、7.5、8.0、8.6、9.0为Tris-HCl缓冲液；pH10为甘氨酸-NaOH缓冲液)，37℃和55℃测定酶活性。表达的中性植酸酶的最适温度测定为在Tris-HCl(pH7.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。取包含表达产物的菌体破碎液，稀释后进行酶活性的生物学测定，结果表明，在含空载体的菌株中检测不到植酸酶酶活性，而在阳性克隆子的细胞破碎液中检测到植酸酶活性，酶学性质研究结果表明，在37℃下其酶反应的最适pH值为7.5，55℃下为7.0；最适温度55℃；37℃下以植酸钠为底物的km值为0.2mmol/L。表达的中性植酸酶在pH特性、温度特性等酶学性质与来源于枯草芽孢杆菌的中性植酸酶基本一致，这证明我们克隆到的这一基因是中性植酸酶的编码基因。
实验七
本实验说明这种中性植酸酶NPHYA对鲤鱼的动物饲喂实验的程序。
试验用鲤鱼鱼体重39g左右。试验在水族箱内进行，水族箱容积100升，流动循环水，流量为2.4l/min，曝气，水温25℃～28℃。饲料原料为市售商品原料，预混料自行配制，加入0.5％的Cr2O3作为指示剂。基础饲料中分别加入500U、1000U的NPHYA后制成植酸酶试验饲料，基础饲料中分别加入无机磷和肌醇做为对照。饲料用电动搅肉机压成颗粒，风干备用。
试验为单因子试验，共设6个处理，分别投喂试验饲料和对照饲料。每处理5个重复，共30个试验单元。每个水族箱内放鲤鱼25尾，随机分入各试验单元。
每日手工投喂3次，定期更换部分循环水以保证水质清洁，每日记录水温及鱼的状况。
生产指标为日增重和料肉比，各指标均以重复组为数据单位。分别在第5天、15天、35天以处理为单位收集粪便，测定粪样中磷含量，计算饲料磷、单位增重磷排出量。数据用SAS软件进行Duncan新复极差检验，P≤0.05为差异显著。
试验的饲料配方和试验分组见表3、表4。表3 植酸酶饲喂试验饲料配方(％)
F1 F2 F3 F4 F5 F6鱼粉 14.5 14.5 14.5 14.5 14.5 14.5菜籽粕 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0棉仁粕 13.0 13.0 13.0 13.0 13.0 13.0豆粕 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0面粉 16.5 16.5 16.5 16.5 16.5 16.5磷酸二氢钙 - 0.65 1.3 0.65 - -肌醇 - - - 0.05 - -食盐 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2Cr2O3 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5植物油 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0石粉 1.3 0.65 - 0.6 1.3 1.3NPHYA，U/kg - - - - 500 1000维生素预混料 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1矿物盐预混料 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9合计 100 100 100 100 100 100表4.试验分组组别 处理 鱼平均初重，gF1 基础饲料 39.788F2 基础饲料+磷酸二氢钙0.65％ 38.813F3 基础饲料+磷酸二氢钙1.3％ 38.125F4 基础饲料+磷酸二氢钙0.65％+肌醇500mg/kg 39.245F5 基础饲料+NPHYA 500U 39.286F6 基础饲料+NPHYA 1000U 39.041
鲤鱼生产性能数据见表5。试验结果显示磷的添加效果非常显著，随着磷酸二氢钙添加量的提高，鱼的料肉比降低，同时日增重上升。添加1.3％的磷酸二氢钙时，日增重比负对照基础料提高60％，料肉比降低10.4％。饲料中添加1000U/kg NPHYA可以起到与添加1.3％的磷酸二氢钙相同的营养作用；NPHYA添加量为500U/kg时虽然显示了改善日增重和料肉比的趋势，但差异不显著。
添加1.3％的磷酸二氢钙时饲料的有效磷为0.6％，已经达到鲤鱼饲料中磷的推荐量。而添加1000U/kg NPHYA的生长指标与添加1.3％的磷酸二氢钙相同，说明在本试验条件下添加1000U/kg NPHYA从植酸中降解出的磷已经能够满足鲤鱼正常生长对磷的需要，可以不再额外添加无机磷。
表5.鲤鱼的日增重(g/日/尾)和料肉比(风干样)组别 日增重 料肉比F1 0.15b 3.94aF2 0.20ab 3.06bcF3 0.24a 2.53cF4 0.17b 3.56abF5 0.16b 3.84aF6 0.24a 2.75c同列中肩号有相同字母的值差异不显著。
磷利用率的比较在F1、F4、F5和F6之间进行(表6)。结果显示添加磷酸二氢钙和NPHYA都可以显著提高磷的表观消化率，随着NPHYA添加量由500U/kg上升到1000U/kg，磷表观消化率也从32％上升到34％，与基础料F1组相比，磷表观消化率提高了28.8％和37.3％。降低单位增重的磷排出，每千克增重的磷排出从25g降到17g。添加磷酸二氢钙和500U/kg NPHYA，虽然有降低单位增重的磷排出量的趋势，但统计上不显著；而1000U/kg的NPHYA可显著降低单位增重的磷排出量，与基础料F1组和添加0.65％磷酸二氢钙的F4组相比，单位增重的磷排出量分别降低40％和35％。表6 植酸酶对磷的表观消化率、磷排出的影响(干基)组别 P表观消化率 P排出，g/kg增重F1 24.84b 28.02aF4 35.01a 26.33aF5 32.01a 25.22aF6 34.11a 17.05b同列中肩号有相同字母的值差异不显著。表7 不同阶段的磷表观消化率
P表观消化率，％组别 5d 15d 35dF1 22.5 24.4 27.6F4 33.8 35.6 35.6F5 32.1 31.5 32.5F6 32.4 37.0 32.9
本次试验还发现随着时间的推移，基础料F1组磷表观消化率逐渐提高，而添加植酸酶的F5和F6组磷表观消化率一直比较稳定(表7)。我们推测这种现象是由于F1组的鱼长期摄食缺磷饲料，体内磷供应不足，机体采取适应性调节，提高磷的吸收，降低内源粪磷的排出所致。因此应当对磷的真消化率做进一步的研究。
总体而言，一方面添加中性植酸酶可以显著提高鲤鱼对饲料磷的表观消化率，减少单位增重的磷排出量，可以减轻磷污染。另一方面添加1000U/kg的NPHYA可以满足鲤鱼正常生长对磷的需要，其生长效果与添加1.3％的磷酸二氢钙相同，无需额外添加无机磷。