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1、10申请公布号CN104162170A43申请公布日20141126CN104162170A21申请号201410319577922申请日20140707A61K48/00200601A61K9/14200601A61K47/36200601A61K47/32200601A61P15/0020060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号72发明人赵梦丹黄荷凤陈凤英郑彩虹应伟雯严晶晶宋瑶真74专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人张法高赵杭丽54发明名称一种具有抗子宫内膜异位症的靶向基因纳米粒及制备57摘要本发明提供一种具有高效抗子宫内膜异位症的基因纳。
2、米粒，该基因纳米粒负载了小分子干扰RNA基因药物，其纳米粒材料由壳寡糖、聚乙烯亚胺和透明质酸组成，其中壳寡糖与聚乙烯亚胺的比例为11，透明质酸占总纳米粒的比例为530，所使用的基因药物含磷摩尔数与纳米粒含氮摩尔数的比例为0116。本发明通过高分子纳米材料、利用受体配体特性，对靶标位于细胞内的基因药物的包封，可增加内异细胞对基因药物的摄取，增加靶标组织的转染效率，增加内异细胞对药物的摄取，有利于减小药物在正常组织或细胞的分布，降低药物的毒副作用，有利于提高该类基因药物的抗子宫内膜异位症疗效，可在制备抗子宫内膜异位症药物中的应用。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表1页附图4页19中华人民。
3、共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表1页附图4页10申请公布号CN104162170ACN104162170A1/1页21一种具有抗子宫内膜异位症的靶向基因纳米粒，该基因纳米粒负载了小分子干扰RNA基因药物，其纳米粒材料由重均分子量为175KDA，脱乙酰度为95的壳寡糖、分子量为800DA的聚乙烯亚胺和分子量为60KDA的透明质酸组成，其中壳寡糖与聚乙烯亚胺的比例为11，透明质酸占总纳米粒的比例为530，所使用的基因药物含磷摩尔数与纳米粒含氮摩尔数的比例为0116。2根据权利要求1所述的一种具有抗子宫内膜异位症的靶向基因纳米粒的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实。
4、现（1）采用高碘酸法聚乙烯亚胺修饰CSO称取壳寡糖12G，高碘酸钠006G，分别溶于180ML和60MLPH45的醋酸缓冲溶液中，反应前两溶液均氮气除去溶解氧，然后将高碘酸钠溶液滴加入壳寡糖溶液中，4冰浴下，400RPM搅拌反应48H，反应结束后，加乙二醇终止反应，将终反应液置透析袋中透析8H，除去杂物，透析液待用，另称取聚乙烯亚胺溶于水中，缓慢加入到透析液中，搅拌反应48H，反应结束后，加硼氢化钠终止反应，然后透析48H，冻干，收集产物得壳寡糖聚乙烯亚胺共聚物；（2）取壳寡糖聚乙烯亚胺共聚物冻干品，加入去离子水分散，制备得到浓度为1MG/ML的共聚物溶液；另取05MG/MLSIRNA溶液，和。
5、上述共聚物溶液缓慢混合，室温静置30MIN，得到不同N/P比的壳寡糖聚乙烯亚胺/SIRNA复合纳米粒，然后将该复合纳米粒与03MG/ML的透明质酸溶液自组装30MIN，温度为30，得壳寡糖聚乙烯亚胺/SIRNAHA复合纳米粒。3根据权利要求1所述一种具有抗子宫内膜异位症的靶向基因纳米粒在制备抗子宫内膜异位症药物中的应用。权利要求书CN104162170A1/5页3一种具有抗子宫内膜异位症的靶向基因纳米粒及制备技术领域0001本发明属制药领域，涉及基因纳米粒的制备和基因纳米粒在抗子宫内膜异位症中的应用。背景技术0002子宫内膜异位症（简称内异症）是生育期女性的一种常见病，且发病率呈上升趋势，其生。
6、殖年龄女性发病率可高达15，其临床特点主要表现为疼痛、包块以及不孕。虽然目前有多种方法治疗内异症，但无论经过何种治疗，其5年内的复发率在40以上，且有1内异症患者恶变为特殊类型卵巢癌的可能性。该病所具有的良性病本质、恶性生物学行为如侵袭、转移、复发等潜能使之成为难治之症。0003目前涉及抗血管形成药物等治疗内异症的研究均在动物模型水平上，主要有血管内皮生成抑制剂TNP470、内皮抑制素、血管抑制素等几种血管形成抑制剂。虽然这些血管形成抑制剂均有不同程度抑制正常增殖期子宫内膜在模型动物体内的种植和生长，但对已建模的动物体异位症病灶的治疗作用尤其是长期治疗作用如何，有待研究。大量研究证实，水通道蛋。
7、白（AQP1）大量表达于不成熟的新生血管内皮细胞，且AQP1的过度表达与血管生成正相关。且目前我们对子宫内膜异位症的研究发现内异症血管内皮细胞中过表达AQP1。那么，针对血管形成的水通道蛋白因子及其关键步骤进行干预，可以达到预防和治疗内异症的目的。0004小分子干扰RNA（SMALLINTERFERINGRNA,SIRNA）是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因静默的过程。由于SIRNA具有高度特异性，可使目的基因稳定静默而不影响正常基因的表达，因此，使用SIRNA干扰技术静默AQP1基因表达，减少或抑制水通道蛋白的表达，把水通道蛋白做为药物靶点，有望成为治疗内异症的新方法。0005那么。
8、，如何促进靶细胞的摄取和表达呢在增加细胞摄取能力方面，阳离子聚合物得到了广泛的应用，如聚乙烯亚胺（PEI），其分子存在许多氨基，具有所谓“质子海绵效应”，在入胞后的内吞和溶酶化过程中发挥缓冲作用，破坏并逃逸溶酶体的降解，实现基因高效表达。由于PEI具有较高的细胞毒性和有限的生物降解程度，我们通过降解天然的阳离子多糖壳聚糖获得壳寡糖（CHITOSANOLIGOSACCHARIDE,CSO），既保留了氨基，又具有较小分子量、较好水溶性和更低的细胞毒性，所以在CSO上适当嫁接PEI，一方面提高转染效率，另一方面降低细胞毒性。此外，为更好地帮助外源性基因转移至特定靶细胞，我们将应用细胞表面特异性受体去。
9、识别相应的配体。研究表明，大多数肿瘤细胞和内异细胞有大量的透明质酸HYALURONICACID,HA受体，所以我们将应用HA包裹CSOPEI/SIRNA，以提高细胞靶向性。发明内容0006本发明的一个目的是提供一种具有高效抗子宫内膜异位症的基因纳米粒，该基因纳米粒负载了小分子干扰RNA基因药物，其纳米粒材料由壳寡糖（重均分子量为175KDA，说明书CN104162170A2/5页4脱乙酰度为95）、聚乙烯亚胺（分子量为800DA）和透明质酸（分子量为60KDA）组成，其中壳寡糖与聚乙烯亚胺的比例为11，透明质酸占总纳米粒的比例为530，所使用的基因药物含磷摩尔数与纳米粒含氮摩尔数的比例（即N/。
10、P比）为0116。0007该载药纳米粒与游离基因药物相比，可显著改善基因药物在细胞水平转染能力和动物水平的抗子宫内膜异位症的效应。0008本发明的另一个目的是提供一种具有高效抗子宫内膜异位症基因纳米粒的制备方法，具体通过以下途径实现（1）采用高碘酸法PEI修饰CSO。称取CSO12G，高碘酸钠006G，分别溶于180ML和60MLPH45的醋酸缓冲溶液中，反应前两溶液均氮气除去溶解氧。然后将高碘酸钠溶液滴加入CSO溶液中，4冰浴下，400RPM搅拌反应48H。反应结束后，加一定量乙二醇终止反应。将终反应液置透析袋中透析8H，除去杂物，透析液待用。另称取适量的PEI溶于水中，缓慢加入到透析液中，。
11、搅拌反应48H。反应结束后，加一定量硼氢化钠终止反应，然后透析48H，冻干，收集产物（CSOPEI共聚物）。0009（2）精密称取一定量的CSOPEI共聚物冻干品，加入适量的去离子水分散，制备得到浓度为1MG/ML的共聚物溶液；另取一定量05MG/MLSIRNA溶液，和上述共聚物溶液按一定比例缓慢混合，室温静置30MIN，得到不同N/P比的CSOPEI/SIRNA复合纳米粒。然后将其复合纳米粒与03MG/ML的透明质酸HYALURONICACID，HA溶液自组装30MIN，温度为30，得CSOPEI/SIRNAHA复合纳米粒。0010本发明的再一个目的是提供所述的一种具有抗子宫内膜异位症的靶向。
12、基因纳米粒在制备抗子宫内膜异位症药物中的应用。本发明利用CSO和PEI的阳离子特性，密接基因药物形成纳米粒，同时利用HA的受体配体特性，靶向内异细胞，以提高基因药物在靶标组织的转染效率，从而达到提高该类药物的抗子宫内膜异位症疗效的目的。0011本发明的有益之处是通过具有高效细胞摄取和细胞质滞留功能的高分子纳米材料，同时利用受体配体特性，对靶标位于细胞内的基因药物的包封，可大大增加内异细胞对基因药物的摄取，增加靶标组织的转染效率。增加内异细胞对药物的摄取，有利于减小药物在正常组织或细胞的分布，降低药物的毒副作用；而基因药物分子靶标部位浓度的增加，有利于提高该类基因药物的抗子宫内膜异位症疗效。附图。
13、说明0012图1为CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径分布图（HA含量23）。0013图2为CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径大小（HA含量23）。0014图3为CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径分布图（HA含量5）。0015图4为CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径大小（HA含量5）。0016图5为CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径分布图（HA含量30）。0017图6为CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径大小（HA含量30）。0018图7为不同N/P的CSOPEI/SIRNAHA纳米粒凝胶阻滞分析。0019图8为不同孵育时间1H（A）、2。
14、HB、8HCCSOPEI/SIRNAHA纳米粒的细胞摄取情况。0020图9为子宫内膜异位症大鼠造模。说明书CN104162170A3/5页50021图10为CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒经尾静脉注射治疗前后子宫内膜异位症模型动物囊肿大小。具体实施方式0022本发明结合附图和实施例做进一步的说明。0023实施例1负载SIRNA抗子宫内膜异位症基因纳米粒的制备（1）负载SIRNA抗子宫内膜异位症基因纳米粒的制备采用高碘酸法PEI修饰CSO。称取CSO12G，高碘酸钠006G，分别溶于180ML和60MLPH45的醋酸缓冲溶液中，反应前两溶液均氮气除去溶解氧。然后将高碘酸钠溶液滴加入CSO溶。
15、液中，4冰浴下，400RPM搅拌反应48H。反应结束后，加一定量乙二醇终止反应。将终反应液置透析袋中透析8H，除去杂物，透析液待用。另称取适量的PEI溶于水中，缓慢加入到透析液中，搅拌反应48H。反应结束后，加一定量硼氢化钠终止反应，然后透析48H，冻干，收集产物（CSOPEI共聚物）。0024精密称取CSOPEI共聚物冻干品，加入适量的去离子水分散，制备得到浓度为1MG/ML的共聚物溶液；另取一定量05MG/MLSIRNA溶液，和上述共聚物溶液按一定比例缓慢混合，室温静置30MIN，得到不同N/P比的CSOPEI/SIRNA复合纳米粒。然后将其复合纳米粒与03MG/ML的HA溶液自组装30M。
16、IN，温度为30，得CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒。所用SIRNA为具有抗子宫内膜异位症的水通道小分子干扰RNA，其序列为顺式3GGUGGGUGGUAAGAGGGAA5；反式3UUCCCUCUUACCACCCACC5。0025（2）采用微粒粒度与表面电位测定仪，分别测定CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径分布（图1）。从图中可以看出，CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径分布均一。当N/P2时（图2），粒径大小在150NM左右，适合细胞内吞。0026实施例2负载SIRNA抗子宫内膜异位症基因纳米粒的制备（1）负载SIRNA抗子宫内膜异位症基因纳米粒的制备采用高碘酸法PEI。
17、修饰CSO。称取CSO12G，高碘酸钠006G，分别溶于180ML和60MLPH45的醋酸缓冲溶液中，反应前两溶液均氮气除去溶解氧。然后将高碘酸钠溶液滴加入CSO溶液中，4冰浴下，400RPM搅拌反应48H。反应结束后，加一定量乙二醇终止反应。将终反应液置透析袋中透析8H，除去杂物，透析液待用。另称取适量的PEI溶于水中，缓慢加入到透析液中，搅拌反应48H。反应结束后，加一定量硼氢化钠终止反应，然后透析48H，冻干，收集产物（CSOPEI共聚物）。0027精密称取CSOPEI共聚物冻干品，加入适量的去离子水分散，制备得到浓度为1MG/ML的共聚物溶液；另取一定量05MG/MLSIRNA溶液，和。
18、上述共聚物溶液按一定比例缓慢混合，室温静置30MIN，得到不同N/P比的CSOPEI/SIRNA复合纳米粒。然后将其复合纳米粒与005MG/ML的HA溶液自组装30MIN，温度为30，得CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒。0028采用微粒粒度与表面电位测定仪，分别测定CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径分布（图3）。从图中可以看出，CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径分布均一。当N/P2时（图4），粒径大小在140NM左右，适合细胞内吞。0029实施例3负载SIRNA抗子宫内膜异位症基因纳米粒的制备说明书CN104162170A4/5页61）负载SIRNA抗子宫内膜异位症基。
19、因纳米粒的制备采用高碘酸法PEI修饰CSO。称取CSO12G，高碘酸钠006G，分别溶于180ML和60MLPH45的醋酸缓冲溶液中，反应前两溶液均氮气除去溶解氧。然后将高碘酸钠溶液滴加入CSO溶液中，4冰浴下，400RPM搅拌反应48H。反应结束后，加一定量乙二醇终止反应。将终反应液置透析袋中透析8H，除去杂物，透析液待用。另称取适量的PEI溶于水中，缓慢加入到透析液中，搅拌反应48H。反应结束后，加一定量硼氢化钠终止反应，然后透析48H，冻干，收集产物（CSOPEI共聚物）。0030精密称取CSOPEI共聚物冻干品，加入适量的去离子水分散，制备得到浓度为1MG/ML的共聚物溶液；另取一定量。
20、05MG/MLSIRNA溶液，和上述共聚物溶液按一定比例缓慢混合，室温静置30MIN，得到不同N/P比的CSOPEI/SIRNA复合纳米粒。然后将其复合纳米粒与042MG/ML的HA溶液自组装30MIN，温度为30，得CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒。0031采用微粒粒度与表面电位测定仪，分别测定CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径分布（图5）。从图中可以看出，CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒的粒径主要分布于100500NM。当N/P2时（图6），粒径大小在198NM左右，适合细胞内吞。0032实施例4负载SIRNA抗子宫内膜异位症基因纳米粒的应用采用08琼脂糖水平凝胶电泳。
21、，上样，同时以MARKER作对照，判定各条带的位置。用溴酚蓝指示SIRNA迁移情况，设置参数120V，30MIN，最后置于紫外透射成像系统观察并拍照（图7），考察纳米粒对基因药物的保护能力。0033通过凝胶阻滞分析，得到嫁接物密接SIRNA能力，随着N/P的升高，出现迁移的SIRNA量逐渐减少，说明共聚物密接SIRNA能力增强；当N/P为2时，SIRNA完全与嫁接物胶束结合。0034实施例5负载SIRNA抗子宫内膜异位症基因纳米粒的应用（1）CSOPEI/SIRNAHA的细胞摄取取MCF7细胞，在含有约10小牛血清的RPMI1640培养液中培养（5CO2，37孵箱）。当细胞达对数生长期时，即可。
22、进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1104个细胞的密度接种于24孔培养板内，孵箱内培养24小时。24孔培养板内细胞贴壁生长后，弃去旧培养液，使用PH74的缓冲溶液PBS润洗2遍后加入100GFITC标记的CSOPEI/SIRNAHA，分别于孵育1、2、8H后弃去细胞培养液，用PBS清洗两次，置于荧光倒置显微镜下观察并记录荧光图像（图8）。0035（2）模型动物的治疗A筛选合格大鼠所有雌性大鼠每日进行阴道细胞涂片检查，选择动情周期45D的大鼠，在第三个动情周期的动情期，将大鼠进行自体移植法手术造模。0036子宫内膜异位症动物模型造模方法参照JONES方法。
23、，手术在无菌条件下，以4的水合氯醛07ML/100G麻醉大鼠，腹部去毛、皮肤消毒后，于尿道口上约1CM处做一长约15CM切口，切取一侧宫角处的一段子宫，长约1CM，迅速将其置于生理盐水中，将子宫内膜与肌层分离，并剪取两块各约5MM5MM的内膜组织块，将内膜层对着腹壁，四角缝固在腹壁上，左右各一，缝合线为无损伤性60棉纶单丝线。关腹前予以青霉素20万单位腹腔注射，最后缝合各层组织，普通级环境饲养。说明书CN104162170A5/5页70037B根据模型观察结果，建立大鼠内异症模型。在病灶生长稳定2周时第二次剖腹观察异位子宫内膜的生长情况。用两脚规测量移植物的体积（长宽高），记录并对已成模大鼠开。
24、始治疗。将成模后大鼠随机分为4组，第一组为药物组，尾静脉注射CSOPEI/SIRNAHA15ML；第二组为游离SIRNA治疗组，尾静脉注射未包裹游离SIRNA基因15ML；第三组为对照组，尾静脉注射生理盐水15ML。用药2周后第三次剖腹观察各组病灶大小，并切取移植物作HE染色，进行形态学观察。0038C建模后2周（图9是动物模型建立图），观察到所有动物移植后的异位子宫内膜生长良好，体积明显增大，呈隆起透亮的小囊状，内部充满积液，表面血管清晰可见，造模成功。0039模型动物经CSOPEI/SIRNAHA基因纳米粒组治疗后，第三次剖腹与第二次剖腹时相比，移植物体积减小（图10）；而游离SIRNA治。
25、疗组移植物体积增大。0040上述应用实例表明，本研究构建的基因纳米粒具有高效抗子宫内膜异位症的作用。说明书CN104162170A1/1页8浙江大学一种具有抗子宫内膜异位症的靶向基因纳米粒及制备2119DNA人工序列小分子干扰RNA顺式序列1GGUGGGUGGUAAGAGGGAA19219DNA人工序列小分子干扰RNA反式序列2UUCCCUCUUACCACCCACC19序列表CN104162170A1/4页9图1图2图3说明书附图CN104162170A2/4页10图4图5图6图7说明书附图CN104162170A103/4页11图8图9说明书附图CN104162170A114/4页12图10说明书附图CN104162170A12。