肠杆菌Z0206细菌富硒多糖的制备方法及应用.pdf

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1、10申请公布号CN104087630A43申请公布日20141008CN104087630A21申请号201410319712X22申请日20140706C12P19/04200601C08B37/00200601A23L1/29200601A23K1/16200601C12R1/0120060171申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路388号72发明人汪以真徐春兰靳明亮姚国佳74专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司33212代理人金祺54发明名称肠杆菌Z0206细菌富硒多糖的制备方法及应用57摘要本发明公开了一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，包括以下步骤挑取肠杆菌。

2、Z0206耐硒菌株，涂布于含硒的PDA加富培养基上进行驯化；通过测定细菌的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间；将耐硒驯化后的肠杆菌Z0206菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵；得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液；将发酵液中收集上清液，再制备得到富硒粗多糖粉末；将所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍体积的热蒸馏水中，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；取所得的蛋白酶处理液，用草酸调PH值至70等处理后，取上清；向所得的上清液中加入SEVAG试剂，得到脱蛋白富硒多糖；将所得到的脱蛋白富硒多糖配成05的多糖溶液制备获得富硒多糖精品。51INTCL权利要求书2页说明书9页附图1页19中华人民共和。

3、国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书9页附图1页10申请公布号CN104087630ACN104087630A1/2页21一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征包括以下步骤1肠杆菌Z0206耐硒菌株驯化挑取肠杆菌Z0206耐硒菌株，先后涂布于含硒量分别为10、20、30、40以及50G/ML的PDA加富培养基上，进行硒浓度梯度驯化；每个梯度于2832培养2436H；最后从含硒量50G/ML的PDA加富培养基平板上挑取生长良好的菌落于平板上划线分离，纯化后斜面保存；2肠杆菌Z0206富硒研究通过测定细菌的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间；从斜面上挑取驯化好的菌种，PD。

4、A培养基平板活化培养2436H后，接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中；2832振荡培养，每隔1H无菌操作取出1ML培养液，用分光光度计测定580NM下的吸光值；绘制耐硒菌的生长曲线；通过生长曲线确定加硒时间及培养时间；从斜面上挑取已经驯化好的耐硒菌种，接种于含硒量分别为10、15、20、25、30以及35G/ML的PDA加富培养基上，2832培养2448H，选取培养基上菌体颜色略红、生长良好的硒浓度作为最佳硒浓度；3发酵液获取将耐硒驯化后的肠杆菌Z0206菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，2832往复振荡培养，培养时间1819H，得到发酵罐发酵种子液；发酵罐内加入70发酵培养基。

5、，121蒸汽灭菌20MIN后，接种种子液，培养13H时加入无菌亚硒酸钠溶液，使培养基最终含硒量为25G/ML，发酵时间4872H，得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液；4多糖粉末获取将步骤3所得的发酵液于6070浓缩为原体积的1/10,8090水浴115H，5000RPM离心1015MIN，收集上清液，加入35倍体积的预冷95乙醇，静置12H，5000RPM离心1015MIN，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤23次，离心，沉淀真空干燥，得到富硒粗多糖粉末；5蛋白酶处理将步骤4所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍体积的热蒸馏水中，用NA2CO3调PH至7090，加入质量为多糖质量1/401。

6、/20的胰蛋白酶，55水解12H后，用草酸调PH值至5057，加质量为多糖质量1/401/20的木瓜蛋白酶，6570水解23H后，于100水浴加热56MIN，以终止酶反应；6三氯乙酸法脱蛋白取步骤5所得的蛋白酶处理液，用草酸调PH值至70，加入3的三氯乙酸，室温下磁力搅拌1H后，11000RPM离心1015MIN，取上清；7SEVAG法脱蛋白向步骤6所得的上清液中加入1/3体积的SEVAG试剂，充分振荡，混合2030MIN，充分静置分层，4000RPM离心5MIN，重复操作数次至两相界面不再出现蛋白沉淀；然后用35倍体积预冷的95乙醇醇析，所得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤后，沉淀。

7、真空干燥，得到脱蛋白富硒多糖；8脱色将步骤7所得到的脱蛋白富硒多糖配成05的多糖溶液，用氨水调PH至80，在权利要求书CN104087630A2/2页350下滴加20的H2O2，至溶液为淡黄色，保温2H，然后用稀盐酸中和至70；自来水透析23D，蒸馏水透析23D后，加入35倍体积的预冷95乙醇沉淀，4静置12H后，500RPM离心1015MIN，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。2根据权利要求1所述的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征在于所述步骤1、2、3中，PDA加富固体培养基的配方如下马铃薯20，蛋白胨0205，酵母浸膏03，葡萄糖2，琼脂粉16；PDA加富液体培养基的配方如下马铃薯2。

8、0，蛋白胨0205，酵母浸膏03，葡萄糖2；发酵培养基配方为玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201。3根据权利要求2所述的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，摇瓶发酵条件为接种量35环，往复振荡的冲程410CM，振荡频率200250RPM。4根据权利要求2或3所述的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，发酵罐发酵条件为接种量4，PH值75，温度32，通气量025075VVM，机械搅拌转速200300RPM。5根据权利要求4所述的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征在于所述步骤7。

9、中的SEVAG试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为41。6一种肠杆菌Z0206富硒多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健品或添加剂中的应用。权利要求书CN104087630A1/9页4肠杆菌Z0206细菌富硒多糖的制备方法及应用技术领域0001本发明涉及一种耐硒菌株驯化、富硒研究及利用该菌制备富硒多糖的方法和该富硒多糖在提高免疫调节功能和抗氧化功能中的应用，它属于微生物学及生物工程技术领域。背景技术0002硒作为一种重要的微量元素，越来越受到科学界的重视。研究表明，硒具有提高机体免疫力、抗氧化、解毒、抑制肿瘤、预防心血管疾病发生等功能。0003无机硒化合物毒性远高于有机。

10、硒化合物，且生物利用率低。只有将无机硒转化为有机硒，才具有食用和保健价值。0004硒的生物有机化主要是通过动物、植物、微生物转化无机硒生产有机硒。通过生物进行硒的有机化不仅可以为人类提供富含有机硒的食品及保健品，而且又可以为畜牧业生产提供富含有机硒的添加剂，是一个极具有广阔前景的方法。0005部分可以进行硒有机化的微生物分泌的多糖具有免疫增强活性，表现出对宿主免疫的介导和调节作用，通过刺激免疫细胞的成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其他生理因子的反应性。以此为基础，这些多糖表现出与免疫力相关的多种活性功能，如抗肿瘤、降血糖、抗衰老、促进肝脏和骨髓细胞的。

11、蛋白质和核酸的合成、抗炎及抗辐射作用等。0006近年来，我们通过多次筛选、纯化，从肉灵芝陕西上分离得到了一株胞外多糖高产细菌菌株阴沟肠杆菌Z0206。所谓肉灵芝，在民间被称之为“太岁”，据本草纲目记载，肉灵芝为本草上品，它是在我国发现的一种天然珍稀物种，即被我国科学界早已认定的一种原生质生命体，确切定名应为“特大型粘菌复合体”。初步研究表明，菌株阴沟肠杆菌Z0206对硒有较高的耐受能力，在无机硒培养基上生长可以将无机硒转化为有机硒，与其分泌的多糖结合，以分泌的形式到达胞外，具有产量极高的特点，并且这种细菌活性富硒多糖还具有一定的抗氧化和免疫调节活性。这种细菌富硒多糖在生物保健品及添加剂生产和开。

12、发上有较高的实际应用价值。通过细菌的富硒培养，生产细菌富硒多糖作为天然保健生物制剂，符合保健品开发及绿色饲料添加剂的发展要求，具有重要的社会现实意义和生态意义。发明内容0007本发明要解决的技术问题是提供一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法。0008为了解决上述技术问题，本发明提供一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法；包括以下步骤1肠杆菌Z0206耐硒菌株驯化挑取肠杆菌Z0206耐硒菌株，先后涂布于含硒量分别为10、20、30、40以及50G/ML的PDA加富培养基上，进行硒浓度梯度驯化；每个梯度于2832培养2436H；最后从含硒量50G/ML的PDA加富培养基平板上挑取生长良好的菌落于。

13、平板上划线分离，纯化后斜面保存；2肠杆菌Z0206富硒研究通过测定细说明书CN104087630A2/9页5菌的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间；从斜面上挑取驯化好的菌种，PDA培养基平板活化培养2436H后，接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中；2832振荡培养，每隔1H无菌操作取出1ML培养液，用分光光度计测定580NM下的吸光值；绘制耐硒菌的生长曲线；通过生长曲线确定加硒时间及培养时间；从斜面上挑取已经驯化好的耐硒菌种，接种于含硒量分别为10、15、20、25、30以及35G/ML的PDA加富培养基上，2832培养2448H，选取培养基上菌体颜色略红、生长良好的硒浓度作为最佳硒浓度；。

14、3发酵液获取将耐硒驯化后的肠杆菌Z0206菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，2832往复振荡培养，培养时间1819H，得到发酵罐发酵种子液；发酵罐内加入70发酵培养基，121蒸汽灭菌20MIN后，接种种子液，培养13H时加入无菌亚硒酸钠溶液，使培养基最终含硒量为25G/ML，发酵时间4872H，得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液；4多糖粉末获取将步骤3所得的发酵液于6070浓缩为原体积的1/10,8090水浴115H，5000RPM离心1015MIN，收集上清液，加入35倍体积的预冷95乙醇，静置12H，5000RPM离心1015MIN，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗。

15、涤23次，离心，沉淀真空干燥，得到富硒粗多糖粉末；5蛋白酶处理将步骤4所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍体积的热蒸馏水中，用NA2CO3调PH至7090，加入质量为多糖质量1/401/20的胰蛋白酶，55水解12H后，用草酸调PH值至5057，加质量为多糖质量1/401/20的木瓜蛋白酶，6570水解23H后，于100水浴加热56MIN，以终止酶反应；6三氯乙酸法脱蛋白取步骤5所得的蛋白酶处理液，用草酸调PH值至70，加入3的三氯乙酸，室温下磁力搅拌1H后，11000RPM离心1015MIN，取上清；7SEVAG法脱蛋白向步骤6所得的上清液中加入1/3体积的SEVAG试剂，充分振荡，混合2030。

16、MIN，充分静置分层，4000RPM离心5MIN，重复操作数次至两相界面不再出现蛋白沉淀；然后用35倍体积预冷的95乙醇醇析，所得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤后，沉淀真空干燥，得到脱蛋白富硒多糖；8脱色将步骤7所得到的脱蛋白富硒多糖配成05的多糖溶液，用氨水调PH至80，在50下滴加20的H2O2，至溶液为淡黄色，保温2H，然后用稀盐酸中和至70；自来水透析23D，蒸馏水透析23D后，加入35倍体积的预冷95乙醇沉淀，4静置12H后，500RPM离心1015MIN，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。0009作为对本发明的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法的改进所述步骤1、2、3中，P。

17、DA加富固体培养基的配方如下马铃薯20，蛋白胨0205，酵母浸膏03，葡萄糖2，琼脂粉16；PDA加富液体培养基的配方如下马铃薯20，蛋白胨0205，酵母浸膏03，葡萄糖2；发酵培养基配方为玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201。0010作为对本发明的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法的进一步改进所述步骤2中，摇瓶发酵条件为接种量35环，往复振荡的冲程410CM，振荡频率200250RPM。0011作为对本发明的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法的进一步改进所述步骤3中，发酵罐发酵条件为接种量4，PH值75，温度32，通气量0250。

18、75VVM，机械搅拌转速200300RPM。0012作为对本发明的肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法的进一步改进所述步骤7中的SEVAG试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为41。0013一种肠杆菌Z0206富硒多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健说明书CN104087630A3/9页6品或添加剂中的应用。0014本发明所用的肠杆菌Z0206是保藏号为CGMCCNO2279的肠杆菌Z0206。0015本发明的优点如下0016采用苯酚硫酸法、凯式定氮法、荧光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量；测定结果显示阴沟肠杆菌Z0206富硒粗多糖中多糖、蛋白。

19、质和硒含量分别为7123、2634及6816MG/KG；阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为9998、001、3825MG/KG。结果表明，上述提取富硒多糖的生产过程简单，产品纯度较高，富硒量较高。0017本发明制备的肠杆菌Z0206富硒多糖对血清溶血素半数溶血值HC50和抗体形成细胞数目PFC均有显著的调节作用，对H2O2诱导氧化损伤RAW2647细胞内SOD、GSHPX活性和MDA含量也具有显著的调节作用。附图说明0018下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。0019图1是本发明的中Z0206细菌生长曲线示意图。具体实施方式0020以下实施例中所用肠杆菌Z。

20、0206是保藏号为CGMCCNO2279的肠杆菌Z0206。0021实施例1、肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法0022PDA加富培养基配方如下马铃薯20，蛋白胨03，酵母浸膏03，葡萄糖2，琼脂粉16。PDA加富液体培养基配方如下马铃薯20，蛋白胨03，酵母浸膏03，葡萄糖2；发酵培养基配方如下玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403，CACL201。00231肠杆菌Z0206耐硒能力驯化0024挑取耐硒菌株，依次涂布于含硒量为10、20、30、40、50G/ML的PDA加富培养基平板上，进行硒浓度梯度驯化。每个梯度于30培养36H。最后从含硒量5。

21、0G/ML的PDA加富培养基平板上挑取生长良好的菌落于平板上划线分离，纯化后斜面保存。00252肠杆菌Z0206富硒研究0026从斜面上挑取已经驯化好的耐硒菌种，接种于含硒量分别为10、15、20、25、30、35G/ML的PDA加富培养基上，30培养36H，观察菌体颜色变化确定最佳硒浓度。结果显示，随着固体培养基PDA加富培养基中硒浓度的增加，菌体逐渐变红。30、35G/ML时红色较深，25G/ML时略呈红色并且菌生长较好。为避免过多的无机硒转化为单质硒，提高有机硒转化效率，确定25G/ML为最佳硒浓度。0027通过测定耐硒菌株的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间。从斜面上挑取驯化好的耐硒。

22、菌株，PDA培养基平板活化培养12H后，接种于装有100MLPDA培养基的三角瓶中。放置于摇床中30振荡培养，每隔1H在无菌室从中取出1ML培养液，用分光光度计测定580NM下的吸光值；确定耐硒菌的生长曲线。0028参考图1肠杆菌Z0206在4H15H处于对数期，15H24H处于稳定期。对数期菌体代谢旺盛，转化率高，且加硒时间越早对菌体代谢活动抑制越强，从转化率和生产周期考说明书CN104087630A4/9页7虑，选择第13小时为最佳加硒时间，最佳培养时间按为48H。00293肠杆菌Z0206富硒多糖发酵液的制备0030向250ML三角瓶中加入70MLPDA加富液体培养基，121灭菌20MI。

23、N，向培养基中接种5环菌种后放置于摇床中30振荡培养，往复振荡的冲程410CM，振荡频率200RPM，培养18H后得到发酵罐种子液。发酵罐内加入70发酵培养基加入的发酵培养基的体积为发酵罐体积的70，121蒸汽灭菌20MIN，接种种子液，接种量4，发酵条件为PH值75、温度32、通气量为045VVM、机械搅拌转速250RPM，培养13H时加入无菌亚硒酸钠溶液，使培养基最终含硒量为25G/ML，发酵时间48H，得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液。00314肠杆菌Z0206富硒多糖的分离提取0032A富硒粗多糖的提取0033步骤3获得的发酵液用旋转蒸发仪于6070浓缩为原体积的1/10,80。

24、90水浴1H，5000RPM离心15MIN，收集上清液，加入3倍体积的预冷95乙醇使用搅拌器边搅拌边向上清液中加入95乙醇，静置12H，5000RPM离心15MIN，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤2次，离心，沉淀真空干燥，得到富硒粗多糖粉末。0034B蛋白酶处理0035取富硒粗多糖10G溶解于200ML蒸馏水中可稍加热促溶，用NA2CO3调PH值至80，加入胰蛋白酶05G，55水解2H后，用草酸调PH值至55，加木瓜蛋白酶05G，70水解3H后，于100水浴加热5MIN，以终止酶反应。0036C三氯乙酸法脱蛋白0037取200ML蛋白酶处理液，用草酸调PH值至70，加入6G三氯乙酸，室。

25、温下磁力搅拌磁力搅拌器1H后，11000RPM离心10MIN，取上清。0038DSEVAG法脱蛋白0039取上述步骤C所得的上清液，并向该上清液中加入1/3体积的SEVAG试剂氯仿和正丁醇体积比为41，充分振荡，混合25MIN，充分静置分层，4000RPM离心5MIN，重复操作数次至两相界面不再出现蛋白沉淀。然后用3倍体积预冷的95乙醇醇析，所得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤后，沉淀真空干燥，得到脱蛋白富硒多糖。0040E脱色0041将脱蛋白后的富硒多糖配成05的多糖溶液，用氨水调PH值至80，在50下滴加20的H2O2，至溶液为淡黄色，保温2H，然后用稀盐酸中和至70。自来水透析。

26、2D，蒸馏水透析3D后，加入3倍体积预冷的95乙醇沉淀，4静置12H后，500RPM离心10MIN，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。0042实施例2、应用苯酚硫酸法检测肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖含量0043方法如下准确称取标准葡萄糖20MG于500ML容量瓶中，加水至刻度，吸取02ML、04ML、06ML、08ML、10ML、12ML、14ML、16ML、18ML分别加水补至20ML，然后加入60苯酚10ML和浓硫酸50ML，静置10MIN，摇匀，30MIN水浴，20MIN后于490NM测定光密度，以20ML水按同样操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。吸取样品液1。

27、0ML相当于40G左右的富硒多糖，按上述步骤操作，测定光密度，以标准曲线计算多糖含量。说明书CN104087630A5/9页80044实施例3、应用凯氏定氮法测定肠杆菌Z0206富硒多糖中蛋白质含量。0045采用国家标准规定的凯式定氮法GB/T500951985测定肠杆菌Z0206富硒多糖中蛋白质含量。0046实施例4、应用荧光分光光度法的定肠杆菌Z0206富硒多糖中硒含量。0047采用国家标准规定的荧光分光光度法GB1239990测定肠杆菌Z0206富硒多糖中硒含量。0048实施例2、实施例3和实施例4采用苯酚硫酸法、凯式定氮法、荧光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含。

28、量。测定结果显示阴沟肠杆菌Z0206富硒粗多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为7123、2634及6816MG/KG；阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为9998、001、3825MG/KG。结果表明，上述提取富硒多糖的生产过程简单，产品纯度较高，富硒量较高。0049实施例5、肠杆菌Z0206富硒多糖抗氧化活性试验0050将复苏的RAW2647细胞可购于上海细胞生物所接种于含10胎牛血清、100U/ML青霉素和100MG/L链霉素的DMEM培养基可购自HYCLONE公司中，待细胞生长至对数生长期时，将细胞浓度调整成1105个/ML浓度后，接种于96孔培养板，每孔100L，置37。

29、、5CO2的恒温箱中孵育24H待细胞贴壁后,进行药物试验，分为阴性对照加入含10胎牛血清的DMEM培养液、阳性对照含终浓度为200MOL/L的H2O2和不同剂量的给药组，给药组分别加入100L/孔不同浓度的富硒多糖溶液，使其终浓度分别为100、200和400G/ML，各设4个重复孔，置于37、5CO2的恒温箱中孵育24H后，加入终浓度为200MOL/L的H2O2培养12H后，进行相关指标的检测。00511、向上述培养板内加入MTT溶液5MG/ML10L/孔，继续培养4H，培养结束后，取出培养板，小心吸弃孔内培养基，用无血清培养基洗1次，加入100LDMSO可购自美国SANTACRUZ公司，置于。

30、37、5CO2的恒温箱中孵育10MIN，紫色结晶完全溶解后，用酶标仪检测各组细胞的570NM吸光度A值。试验组细胞存活率试验组A值空白组A值/正常对照组A值空白对照组A值100。00522、采用试剂盒测定细胞内SOD、GSHPX和MDA的含量。0053表1所示为肠杆菌Z0206富硒多糖对H2O2诱导氧化损伤RAW2647细胞生长的影响；0054表2所示为肠杆菌Z0206富硒多糖对H2O2诱导氧化损伤RAW2647细胞内SOD、GSHPX活性和MDA含量的影响；0055表10056说明书CN104087630A6/9页90057注同列上标字母不同表示差异显著P0050058与对照组相比，RAW2。

31、647细胞加入终浓度为200M的H2O2培养12小时，细胞的存活率降低5065P005；与200M的H2O2单独作用组相比，用100G/ML、200G/ML和300G/ML的富硒多糖预处理24H，再加入终浓度为200M的H2O2，继续培养12小时，显著细胞存活率分别提高了732P005、525P005和2272P005。0059表200600061注同列上标字母不同表示差异显著P0050062与对照组相比，H2O2单独作用200M，12X小时组RAW2647细胞中SOD和GSHPX活性分别降低了4521P005和5789P005，脂质过氧化物MDA含量提高了14464P005；与H2O2单独作。

32、用组相比，300G/ML的富硒多糖预处理组细胞内的SOD和GSHPX活性分别提高了2895P005和4756P005，MDA含量降低了2822P005。0063实施例5、肠杆菌Z0206富硒多糖的免疫调节功能研究0064取ICR小鼠可够自浙江大学医学院实验动物中心40只雌雄各半，随机分为对照组，环磷酰胺组，环磷酞胺富硒多糖组。、组在第12天腹腔注说明书CN104087630A7/9页10射环磷酞胺50MG/KG体重诱导免疫低下，、组每天灌胃生理盐水04ML，组每天灌胃富硒多糖04ML400MG/KG体重，试验期14D。在试验的第10天，所有的试验鼠腹腔注射02ML10的SRBC进行免疫。于最后。

33、1次给药后12H禁食不禁水，颈椎脱臼处死，取样进行以下指标分析。00651、血清溶血素含量的测定0066分离血清，用生理盐水将血清稀释300倍。取用生理盐水稀释好的血清样品LML加至反应管中，再加入10SRBC05ML，置冰浴中，并于试管中加入LML以生理盐水110稀释的豚鼠血清，随即移至37恒温水浴锅中，保温10MIN。孵育完毕即放入冰浴中以终止反应，以2000RPM离心10MIN。取上清液1ML加3ML都氏试剂，混匀，放置10MIN后，于540NM处，以不加血清的空白管作对照，测各样品的吸光度值OD。取025ML的SRBC用都氏试剂稀释至4ML，摇匀，放置10MIN，以2000RPM离心1。

34、0MIN，取上清液，测吸光度值。溶血素的量以半数溶血值HC50表示，样品半数溶血值HC50样品吸光度值/SRBC半数溶血时的吸光度值稀释倍数。00672、脾细胞抗体生成测定0068试验结束后，将各小组中小鼠的眼眶放血，颈椎脱臼处死后，迅速取脾脏，用生理盐水制成1107CELL/ML的脾细胞悬液。另取试管，每管加入脾细胞悬液空白对照管用生理盐水代替、02SRBC悬液和110稀释的新鲜的豚鼠血清各LML，混匀后置37水浴温育LH，300ORPM离心10MIN，取上清液，在分光光度计上于413NM处测定光密度值A413。00693、T细胞亚群和自然杀伤细胞NK细胞活性测定0070T细胞亚群试验结束后。

35、，取部分血样肝素抗凝后，取两组试管，分为试验管和阴性对照管。每支试验管中均加入FITGCD4、PECD3、PECY6CDS，其阴性对照管中均加入相应的同型对照抗体FITGIGGZB、PEIGG、PECY6IGGZA之后，每份抗凝全血分别加入试验管和阴性对照管各50L，混匀机混匀后，避光保存25MIN，加入流式细胞检测剂2ML，混匀机混匀后，避光保存15MIN后，1500R/MIN离心5MIN，弃上清，加入磷酸盐缓冲液PBSLML，混匀，1500R/MIN离心5MIN，弃上清，反复23次后，加PBS至05ML，混匀，流式细胞仪进行检测，经CELLQUEST软件进行分析，记录结果。0071NK细胞。

36、活性取流式管1支，依次加入NK细胞PE及CD3FITC三色直标单抗各5L及EDTA抗凝血50L混匀置暗处2025孵育15MIN，每管加溶血素2ML，充分混匀，准确放置暗处10MIN，1200R/MIN离心5MIN，倾弃上清液，每管加PBS2ML充分混匀，1200R/MIN离心5MIN，弃上清加少许PBS2ML混匀，上机检测分析。0072试验结果如下表所示0073表1为肠杆菌Z0206多糖对免疫低下小鼠体液免疫的影响；0074表2为肠杆菌Z0206多糖对免疫低下小鼠T细胞亚群和NK细胞活性的影响；0075表10076说明书CN104087630A108/9页110077注同列上标字母不同表示差异。

37、显著P0050078与生理盐水对照组相比，小鼠注射环磷酞胺后，血清溶血素半数溶血值HC50和抗体形成细胞数目PFC分别降低了6231P005和5296P005。与环磷酰胺组相比，小鼠经400MG/KG富硒多糖预防性灌胃在注射环磷酰胺，血清溶血素半数溶血值增加了1538P005，脾细胞抗体形成数目升高了1011P005。0079表200800081注同列上标字母不同表示差异显著P0050082与生理盐水对照组相比，小鼠注射环磷酞胺后，T淋巴细胞亚群紊乱，比例失调，CD4降低3922P005，CD8升高3076P005，CD4/CD8降低5340P005，NK细胞活性下降6937P005。与环磷酰。

38、胺组相比，小鼠经400MG/KG多糖预防性灌胃在注射环磷酰胺，CD4、CD4/CD8和NK细胞活性分别提高了3758P005、50P005和6754P005,同时CD8降低了2011P005。0083对比例1、专利号为2008101213137的专利中，采用的发酵培养基配方如下蔗糖25，酵母浸膏05，蛋白胨05，K2HPO402,KH2PO401以及MGSO4005；而蛋白酶处理步骤中，加入质量为多糖质量0251的胰蛋白酶，以及加质量为多糖质量0251的木瓜蛋白酶后；采用苯酚硫酸法、凯式定氮法、荧光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为6940、2568及6570M。

39、G/KG；阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为9997、003、3556MG/KG。0084本发明中，发酵培养基配方为玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403以及CACL201；而蛋白酶处理步骤中，加入质量为多糖质量255的胰蛋白酶，以及加质量为多糖质量255的木瓜蛋白酶后；采用苯酚硫酸法、凯式定氮法、荧光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒粗多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为7123、2634及6816MG/KG；阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白说明书CN104087630A119/9页12质和硒含量分别为9998、001、。

40、3825MG/KG。0085对比例2、采用的发酵培养基配方如下蔗糖25，酵母浸膏05，蛋白胨05，K2HPO402,KH2PO401以及MGSO4005；而蛋白酶处理步骤中，加入质量为多糖质量255的胰蛋白酶，以及加质量为多糖质量255的木瓜蛋白酶后；采用苯酚硫酸法、凯式定氮法、荧光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为6980、2590及6590MG/KG；阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为9996、002、3589MG/KG。0086本发明中，发酵培养基配方为玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO40。

41、3以及CACL201；而蛋白酶处理步骤中，加入质量为多糖质量255的胰蛋白酶，以及加质量为多糖质量255的木瓜蛋白酶后；采用苯酚硫酸法、凯式定氮法、荧光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒粗多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为7123、2634及6816MG/KG；阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为9998、001、3825MG/KG。0087对比例3、采用的发酵培养基配方如下玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403以及CACL201；而蛋白酶处理步骤中，加入质量为多糖质量0251的胰蛋白酶，以及加质量为多糖质量0251的木瓜蛋白酶后。

42、；采用苯酚硫酸法、凯式定氮法、荧光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为6978、2577及6582MG/KG；阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为9995、0023、3576MG/KG。0088本发明中，发酵培养基配方为玉米淀粉20，豆粕粉16，玉米浆干粉06，K2HPO43H2O03,KH2PO403以及CACL201；而蛋白酶处理步骤中，加入质量为多糖质量255的胰蛋白酶，以及加质量为多糖质量255的木瓜蛋白酶后；采用苯酚硫酸法、凯式定氮法、荧光分光光度法测定肠杆菌Z0206富硒粗多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为7123、2634及6816MG/KG；阴沟肠杆菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白质和硒含量分别为9998、001、3825MG/KG。0089从以上所述的数据中可以看出，本发明经过对发酵培养基以及胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的加入量进行改变后，产品的纯度以及富硒量均有较大的提高。0090最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。说明书CN104087630A121/1页13图1说明书附图CN104087630A13。