快速粘附法分离富集毛囊干细胞 【技术领域】
本发明涉及干细胞分离方法，具体涉及通过粘附法分离毛囊干细胞的方法
背景技术
成年人的毛囊干细胞属于成体干细胞，数量小，很难分离和纯化。根据毛囊干细胞的形态特点和表面标志，有这样几种分离方法：密度梯度离心，细胞离心淘洗技术(centrifugalelutriation)，流式细胞术(flowcytometry)等。密度梯度离心的方法已使用多年，分离效率中等，而且所需设备简单，但最大的问题是获得的细胞纯度低。尤其当需要长期培养时效果差。流式细胞术分离细胞主要依赖对细胞表面标志进行荧光标记后分选，同时可结合细胞大小等特征参数。目前为止，人们还没发现一种表面标志能专一地标记毛囊干细胞。因此，目前多用两种或两种以上的分子标志。Tani等选用了抗α6整合素抗体和CD71单克隆抗体对小鼠表皮来源的角质细胞进行双标分选，其中8.1±2.0％的细胞高表达α6整合素而低表达CD71，表皮中71.95±14.02％的标记维持细胞，即干细胞均居其中。(Tani H，Morris RJ and Kaur P.Erichment for muirine keratinocyte stem cells based on cell durface phenotype.PNAS.2000；97(20)：10960-10965)流式细胞术分离效率最高，但获得的细胞数量相对较少；所需的实验设备复杂，操作过程多，对细胞造成伤害的机会大，不利于以后地培养应用。而且，目前还没有用流式细胞术分离毛囊细胞的报道。
利用干细胞粘附性强的特点可以对干细胞进行分离纯化。无论是表皮还是毛囊的干细胞都牢固地定位在基底膜上，分裂产生的子代细胞将逐步脱离基底层。因此，细胞悬液中，干细胞与基底膜成分的结合能力最强，粘附也就最快。Jone及Watt将表皮角质形成细胞悬液接种于包被有IV型胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等的培养皿上。结果发现，在IV型胶原上粘附20min后收获的细胞占全部基底层细胞的10％，克隆形成能力增加5.5倍，而且在移植到裸鼠皮下后可以形成具有四层细胞(基底层，棘层，颗粒层和角化层)的表皮。(Jones PHand Watt FM.Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basisof differences in integrin funtion and expression.Cell.1993；73：713-724)通过粘附特性分离出来的细胞符合干细胞的特征，即使纯度还有待提高，但至少能对干细胞起到富集的作用。目前，还没有利用类似方法对毛囊干细胞进行分选的报道。
【发明内容】
本发明的目的是利用毛囊干细胞粘附性强的特点，建立一种简便易行的分离及富集毛囊干细胞的方法。本发明的内容是一种毛囊干细胞分离富集方法，包括从成人头皮毛囊中分离包含毛囊各部分角质细胞在内的多种细胞混合液和通过粘附法从成人头皮毛囊的多种细胞中分离、富集毛囊干细胞。从成人头皮毛囊中分离包含毛囊各部分角质细胞在内的多种细胞混合液的方法包括利用双重消化的方法从缩皮手术中取得的头皮中获得细胞悬液和细胞悬液在特定的培养基中进行培养扩增。粘附法是利用毛囊干细胞粘附能力强的特点，将毛囊细胞混合液接种于事先包被有正常人皮肤来源胶原的培养皿内，经过一定时间的粘附后，干细胞粘附在胶原上而其他细胞则通过清洗祛除，由此获得高浓度的成人毛囊干细胞。利用这种简便易行的毛囊干细胞分离方法可以迅速地获得大量成人毛囊干细胞，有利于干细胞移植和进一步的临床和实验室研究。
【具体实施方式】
毛囊细胞悬液的获得：患者术中取下的额颞部头皮立即置于过滤除菌的DMEM中，4℃保存。4h内于超净工作台内取出头皮，75％酒精擦拭，用D-Hank’s液冲洗，剪成约3mm宽，5mm长的小块，再以D-Hank’s液冲洗。放入胰蛋白酶/胶原酶混合液中，4℃消化过夜。在体视显微镜下，用钟表镊顺毛囊生长方向轻轻拔出完整的毛囊，置胰蛋白酶中，用锋利的剪刀剪碎，37℃消化1h。消化液经200目不锈钢滤网过滤，加入10％血清终止消化。室温下1000rpm离心5min，去除胰蛋白酶。DMEM液洗一次后加入毛囊细胞生长培养液，计数后按5×105/ml接种于25cm2培养瓶中，36.5℃，5％CO2培养箱培养，每2-3d换液，4-6d传代。
皮肤胶原培养支持物制备：取拉皮手术后多余的皮肤，灌注法清除血液至清洁。将皮肤组织剪碎，于NaCl溶液中匀浆，除去非胶原性杂质，以蒸馏水洗涤以除去盐分。用20倍体积0.5mol/L乙酸溶液悬浮，加入胃蛋白酶，搅拌24h。离心20min，取上清，留沉淀再次以胃蛋白酶消化。上清加NaCl至终浓度为5％，搅匀，放置过夜。离心20min，弃上清，留沉淀。沉淀再次溶解于0.5mol/L乙酸溶液中，加NaCl至终浓度5％，搅匀，放置过夜。离心20min，如此重复纯化三次。将胶原提取物进行成纤维处理。胶原溶于0.05mol/L乙酸溶液中，用0.02mol/L PBS透析至中性。
包被培养板及培养瓶：超净台中将人胶原溶液加入24孔板及25cm2培养瓶中，成一薄层。置超净台中使之正常挥发。干燥后用D-Hank’s液洗涤。使用前再用培养液水合。
快速粘附法分离富集毛囊干细胞：7-8代的毛囊细胞(5×105/ml)接种于事先铺好人胶原的24孔板中，37℃5％CO2孵箱中培养，分别于5、10、20、40、60min后吸出培养液，计数后入另一孔中，原孔中另加1ml培养液，继续培养。
根据集落形成能力鉴定干细胞：分选前后的毛囊细胞以102/ml接种于60mm平皿中，培养7d后，以温D-Hank’s液洗2次，5min/次。甲醇固定10min。Gimsa染液与Sorensen缓冲液以1∶9配置后，染色10-15min，流水冲去多余染料，空气干燥。镜下计数形成集落数，计算集落形成率。
毛囊干细胞标志物的检测：24孔板中事先放入高压蒸汽灭菌的盖玻片，以人胶原包被。细胞粘附分选后继续培养1d。温D-Hank’s液洗2次，冷丙酮固定1min，冷PBS洗2次，每次5min。-20℃保存备用。玻片以冷PBS洗2次，每次5min。用PBS稀释的10％正常兔血清封闭，4℃ 30min。吸去血清后，滴加1∶100稀释的山羊抗人Integrinβ1一抗，4℃过夜。冷PBS洗3次，每次5min。滴加1∶100稀释的生物素化兔抗山羊二抗，37℃30min。冷PBS洗3次，每次5min。滴加碳酸氢钠缓冲液(pH8.2)1∶200稀释的DCS，4℃ 1h。冷PBS洗4次，每次5min。用PBS稀释的10％正常山羊血清封闭，4℃ 30min。吸去血清后，滴加1∶50稀释的小鼠抗人Keratin 19一抗，4℃过夜。冷PBS洗3次，每次5min。滴加1∶100稀释的TRITC标记的山羊抗小鼠二抗，4℃ 1h。冷PBS洗3次，每次5min。PPd甘油封片。镜检摄像。阴性对照以正常血清代替一抗。
粘附分离富集实验结果显示，随粘附时间的延长，粘附到胶原上的毛囊上皮细胞数量逐渐增多，上清培养液中细胞数逐渐减少，毛囊干细胞标志物：β1整合素和K19阳性细胞比例逐渐增加，粘附细胞集落形成能力逐渐降低。5.0±0.1×105/ml的毛囊细胞经过粘附20分钟后，未粘附的细胞数量为2.7±0.2×105/ml，而此时K19阳性细胞率由最初的8.4±1.3％增加到21.7±3.2％，集落形成率由8.6±1.4％上升到87.4±3.8％。说明人胶原快速粘附20分钟可有效地分离富集毛囊干细胞。