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三价铁卟啉短肽化合物在抗冠心病药物 制备中的用途
技术领域
本发明提供一种三价铁卟啉及衍生物新的医药用途，进一步讲是在抗冠心病药物制备中的应用，属于生物制药技术领域。
背景技术
本发明所涉及的三价铁卟啉及衍生物包括血红素—短肽、亚血红素—短肽，是以铁卟啉为辅基的微过氧化物酶，包括由细胞色素C(Cyt C)水解而来的八肽(简称：MP-8)、九肽(简称：MP-9)、十一肽(简称：MP-11)。它们均含有共价结合的血红素，并在肽段中含有一个组氨酸残基，人们发现它们是一类很好的过氧化物酶模拟物。它们具有较好的抗氧化活性，而且已经在体外白内障诱导模型中得到了验证，但在抗冠心病药物制备中的应用经检索未见文献公开报道。
发明内容
本发明提供了三价铁卟啉及衍生物在抗冠心病药物制备中的应用。
本发明所说的三价铁卟啉—短肽化合物包括亚血红素(Deuterohemin，用Dh表示)、短肽(用X表示)；亚血红素与短肽间的连接方式是亚血红素上的羧基与肽链上的氨基以酰胺键相连。
上述结构可以是单体，即亚血红素上的两个羧基之一与肽链连接，两种单体形式为同分异构体，结构如A.、B所示；也可以是双体，双体形式为亚血红素上的两个羧基均与肽链连接，结构如C所示。

三价铁卟啉—短肽化合物的结构式如下：
D1.Dh-β-Ala-His；
D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg
D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys
D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys
D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala
D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala
D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala
D8.Dh-β-Ala-Arg-Ala-Arg-Ala
D9.Dh-β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg
D10.Dh-β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala
本发明的化合物具有强心，抗心衰升高血压活性，按照常规的制药技术，可以将其制备成任何一种常规药剂，例如：片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、透皮吸收剂、注射剂等。
做为含有本发明化合物组合药，其组成为含有治疗有效量的本发明化合物，所说的化合物在药物组合物当中可以是单独使用，也可以与其他药物配合使用。
本发明的药物组合物除了含有上述化合物之外，还含有常规的药物赋形剂，例如：粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、调味剂、增溶剂、溶剂、防腐剂等。
以下药理实验证明本发明具有治疗冠心病的药理活性和医疗效果：
实验例1、
三价铁卟啉—短肽化合物对心肌细胞过氧化损伤的保护作用
1.三价铁卟啉—短肽化合物D1～D10保护作用的研究
利用体外培养的心肌细胞观察不同浓度的D1～D10的保护作用，采用的浓度为15μmol·L^-1。
表1DhHP-6浓度对抗心肌细胞损伤的作用

    细胞存活率    活性对照组H₂O₂D1(15μmol·L^-1)D2(15μmol·L^-1)D3(15μmol·L^-1)D4(15μmol·L^-1)D5(15μmol·L^-1)D6(15μmol·L^-1)D7(15μmol·L^-1)D8(15μmol·L^-1)D9(15μmol·L^-1)D10(15μmol·L^-1)    94.3±4.3    49.4±8.1    80±4.1    81±3.2    81±3.1    78.2±2.3    72±4.3    71±2.7    78.5±2.9    80±3.4    76.5±2.7    81±3.9  -  44.0±5.7  83.7±7.4  82.6±3.5  82.7±6.3  81.1±4.1  79.7±2.6  81.5±5.2  79.7±2.8  78.7±5.0  77.5±4.7  86.5±6.3
表2LDH漏出量的测定
    LDH活性(U·L^-1)对照H₂O₂D1(15μmol·L^-1)D2(15μmol·L^-1)D3(15μmol·L^-1)D4(15μmol·L^-1)D5(15μmol·L^-1)D6(15μmol·L^-1)D7(15μmol·L^-1)D8(15μmol·L^-1)D9(15μmol·L^-1)D10(15μmol·L^-1)    63.8±15.2    309.2±17.4    106.9±24.5    98.6±14.6    112.7±26.3    101.1±14.9    109.7±22.6    89.5±15.2    108.5±12.9    107.7±15.9    97.5±14.7    116.5±26.3
结论：三价铁卟啉—短肽化合物D1～D10与空白对照组相比，对心肌细胞的氧化损伤均具有较好的保护作用。
2.三价铁卟啉—短肽化合物D1～D10对Ca²⁺-ATP酶的影响
利用体外培养的心肌细胞H₂O₂损伤模型，观察D1～D10对心肌细胞Ca²⁺-ATP酶变化的影响。
    Ca²⁺-ATP酶(umolPi/mg/hour)对照H₂O₂D1(15μmol·L^-1)D2(15μmol·L^-1)D3(15μmol·L^-1)D4(15μmol·L^-1)D5(15μmol·L^-1)D6(15μmol·L^-1)D7(15μmol·L^-1)D8(15μmol·L^-1)D9(15μmol·L^-1)D10(15μmol·L^-1)    0.7908±0.091    0.4517±0.121    0.6615±0.0545    0.7806±0.0247    0.8026±0.0566    0.6138±0.0643    0.8036±0.0368    0.8955±0.0532    0.908±0.0498    0.796±0.0486    0.975±0.0519    0.635±0.0263
ATP酶是存在于组织及细胞器膜上的一种蛋白酶，在物质运输、能量转换以及信息传递方面具有重要作用，其活力的大小是细胞能量代谢及功能有无损伤的重要标志。测定体外培养心肌细胞Ca²⁺-ATP酶发现，损伤组心肌细胞膜Ca²⁺-ATP酶活性降低，由于细胞膜钙泵和肌浆网泵功能障碍，使胞外Ca²⁺内流失控，而胞内Ca²⁺的排出、贮存障碍，最终造成细胞内钙超载，细胞内游离钙是细胞信号传递途径的成员之一，与细胞凋亡的早期信号有关，研究表明，多种刺激因子作用细胞后，在细胞发生凋亡前都有细胞内游离钙的持续升高，但心肌收缩蛋白对钙有其特有的反应性，有能耐受长时间的钙超载，而此时如果细胞处于低钙环境，则可抑制或延迟细胞凋亡的发生，说明Ca²⁺在细胞凋亡和氧化损伤中具有重要作用。
模型组心肌细胞Ca²⁺-ATP酶的活性明显低于正常对照组，表明损伤引起心肌细胞钠泵和钙泵功能受损，影响心肌细胞离子跨膜转运和内质网功能。三价铁卟啉—短肽化合物D1～D10给药组可提高Ca²⁺-ATP酶的活性，提示三价铁卟啉—短肽化合物D1～D10可保护心肌细胞钙泵功能，减轻损伤程度。
实验例2、
本实验通过大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探讨亚血红素短肽化合物D1～D10抗心肌缺血再灌注损伤的作用，为其开发利用提供科学依据。
1.材料与方法
1.1动物
Wistar大鼠，雄性，体重250～280g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-2002-0001。
1.2药物、试剂
亚血红素短肽化合物D1～D10，吉林大学生命科学学院研制提供，以生理盐水配制所需浓度使用；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、蛋白质(双缩脲法)测定试剂盒，为南京建成生物工程所产品，批号分别为20060618、20060622、20060624。
1.3实验方法
1.3.1实验分组  将雄性Wistar大鼠随机分为组，每组10只。分别为空白组、模型组(心肌缺血再灌注损伤组)、给药组(亚血红素短肽化合物D1～D10)。其中空白对照组、模型组腹腔注射生理盐水20ml/kg，给药组腹腔注射DhHP-601～61020mg/20ml/kg。
1.3.2观察指标及方法  将麻醉好的大鼠固定在大鼠板上，插上电极，自左侧4～5肋间开胸，暴露心脏，剪开心包膜，使心脏跳出，在心脏左心房和肺动脉圆锥间(冠状动脉左前降支处)穿线，立即将心脏放回到胸腔，待心电图稳定点后再用胶管结扎管脉，除空白组仅穿线不结扎外，其余各组均以0号线立即结扎冠脉，开胸时间不超过30s。各组动物结扎30min，然后松解结扎线进行再灌注。再灌注120min后，结扎后心电图会出现心肌缺血图形，表现为S-T段抬高，J点上移，以此图形作为心肌缺血标准。结扎30min后剪去胶管使缺血再通，再通成功后心电图形应表现为缺血图形减轻或恢复正常。再通时间为2h。再灌2h后立即腹主动脉采血(2-3ml)，测血清CPK、LDH、GOT活性。同时取血后剖取大鼠心脏，用生理盐水洗净心腔内积血，去掉心房组织及脂肪，称重，制备心肌匀浆，严格按试剂盒方法操作测SOD活性及MDA含量。实验过程观察心电图S-T段(J点)变化情况。
1.4统计学方法  实验数据以x±s表示，用组间t检验法进行统计分析。
2实验结果
2.1亚血红素短肽化合物D1～D10对心肌缺血-再灌注模型大鼠血清磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)及谷草转氨酶(GOT)活性的影响。
结果见表1。模型组与空白对照组相比，血清CK、LDH及GOT活性均明显增加(P＜0.001)，表明大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建成。亚血红素短肽化合物D1～D10 20mg·kg-1组均能明显降低血清CK、LDH及GOT活性，与模型组比较差异显著(P＜0.001)。
表1亚血红素短肽化合物D1～D10对心肌缺血-再灌注模型大鼠血清磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)及谷草转氨酶(GOT)活性的影响
组别剂量mg·kg^-1CK(U·L^-1)LDH(U·L^-1)GOT(U·L^-1)对照组缺血-再灌注模型组D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10  -  -  20  20  20  20  20  20  20  20  20  20  1029.11±251.642  4165.84±1267.997^***  2609.89±1193.496^**  3499.03±1339.736  3012.12±998.984^*  2978.53±1025.451^*  2768.35±1021.54^**  2976.31±1024.64^**  2697.45±1235.34^**  2794.81±1264.54^*  3132.51      ±  897.24^*  3245.12±945.654^*295.99±107.6891225.97         ±224.695^***650.71          ±131.612^***794.25          ±209.724^***864.21±197.713^**843.12±197.45^**824.65±175.361^**834.56±186.13^**665.12±142.65^**678.94±143.12^**876.48±213.45^**878.58±185.24^**198.35±78.427647.12         ±185.845^***325.82         ±100.959^***420.8±137.268^**435.21±124.277^*415.32±113.54^**408.14         ±101.322^**398.24         ±1131.25^**346.78±121.35^**368.12±122.21^**452.17±141.98^*449.87±134.85^*
与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001
2.2亚血红素短肽化合物D1～D10对心肌缺血-再灌注模型大鼠心肌SOD活性及MDA含量的影响
结果见表2。模型组与空白对照组相比，心肌SOD活性明显下降，MDA含量明显增加(P＜0.001)，表明大鼠心肌缺血再灌注损伤时伴有体内自由基的堆积和抗氧化酶活性的降低。亚血红素短肽化合物D1～D10均能明显降低心肌MDA含量，增加心肌SOD活性(P＜0.01或P＜0.001)。
表2亚血红素短肽化合物D1～D10对心肌缺血-再灌注模型大鼠心肌SOD活性及MDA含量的影响
组别剂量(mg·kg^-1)SOD(U·mg^-1pr)  MDA(nmol·mg^-1pr)对照组缺血-再灌注模型组D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10  -  -  20  20  20  20  20  20  20  20  20  20362.09±62.492^***130.79±78.900236.95±76.651^***262.33±103.062^***223.51±89.85^**211.36±87.65^*209.87±86.97^*208.65±79.78^**216.87±85.124^**203.42±82.451^*203.14±81.021^*212.45±85.341^**  24.69±19.366^*  45.74±22.125  22.04±18.272^**  14.00±11.966^***  24.25±17.85^*  25.89±18.124^*  26.54±18.957^*  29.89±17.254^*  27.75±18.243^*  28.95±17.988^*  21.84±18.854^**  23.85±19.87^*
与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001
2.3亚血红素短肽化合物D1～D10对心肌缺血-再灌注模型大鼠心电图S-T段(J点)变化情况的影响
结果见表3。模型组与空白对照组相比，大鼠心电图S-T段明显抬高，J点上移(P＜0.001)，此图形为心肌缺血图形。表明大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建成。D1～D10 20mg·kg-1组均能使大鼠心电图S-T段抬高，J点上移明显降低(P＜0.001)。表明D1～D10可明显减轻心肌缺血再灌注损伤。
表3亚血红素短肽化合物D1～D10对缺血-再灌注模型大鼠心电图S-T段(J点)变化情况的影响
 组别    剂量(mg·kg^-1)    心电图S-T段抬高值(J点抬    高值) 对照组 缺血-再灌注模型组 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10    -    -    20    20    20    20    20    20    20    20    20    20    0.1001±0.04579    0.4021±0.1928^***    0.1283±0.06919^***    0.1672±0.10368^***    0.1725±011352^***    0.1812±0.12511^**    0.1785±0.11274^***    0.1957±0.1354^**    0.2015±0.14576^*    0.2254±0.15614^*    0.2157±0.15668^*    0.2357±0.16514^*
与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001
3讨论
实验表明，亚血红素短肽化合物D1～D10能明显降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清CK，LDH、GOT活性，对缺血再灌注心肌具有明显保护作用。心肌缺血再灌注损伤时，不仅氧自由基生成增多，而且对自由基的清除能力减低，从而造成心肌组织中产生的自由基大量蓄积，引起心肌组织的严重损伤。亚血红素短肽化合物D1～D10能明显降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清心肌MDA含量，提高心肌SOD活性，提示其可能通过抑制脂质过氧化过程，并同时提高内源性抗氧化酶活性而减轻自由基对心肌的损伤。此外，亚血红素短肽化合物D1～D10能使心肌缺血再灌注损伤大鼠心电图抬高的S-T段(J点上移)明显降低，心电图形表现为缺血图形减轻或恢复正常，表明亚血红素短肽化合物D1～D10可明显减轻心肌缺血再灌注损伤。以上结果对于开发亚血红素短肽化合物D1～D10治疗冠心病(急性心肌梗塞)具有重要意义。
体外测活实验表明，三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物可以在抗坏血酸存在下清除体系中的过氧化氢，具有过氧化物酶的活性；同时三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物在保护心肌线粒体抵抗氧化损伤作用的研究中，进一步在亚细胞水平上验证三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物的抗氧化功能。在更进一步的实验中，利用体外培养的心肌细胞，建立H₂O₂氧化损伤模型，通过台盼蓝染色和MTT比色法评价细胞活力、培养液中LDH含量反应细胞膜的完整性、测定的心肌细胞才Ca²⁺-ATP酶反应细胞钙泵功能、丫啶橙染色判断细胞凋亡的发生、基因表达判断凋亡及衰老的发生。从细胞生理功能、生化代谢以及形态结构改变水平观察三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物抗心肌细胞氧化损伤的作用。
实验结果证明，在大量氧化性物质存在的体系中(H₂O₂100μmol·L^-1)，三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物(15μmol·L^-1)可起到保护心肌细胞的作用。测量的各项宏观指标中，APX模拟酶保护组要明显好于H₂O₂损伤组。基因表达水平的结果表明，三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物起到了抑制细胞凋亡的功效，并且在信号转导方面也起到了一定的积极作用。证明了三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物对心肌细胞抗H₂O₂损伤起到了明显的保护。
综合以上实验结果，三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物在体外测活体系、亚细胞水平、及组织器官水平均具有较好的抗氧化活性，同时又是一类具有过氧化物酶活性的新化合物。并且，产品的纯度较高，毒性小；对过氧化氢的稳定性好；更容易被机体吸收，通过各种膜组织进入机体细胞中，具有很高的生物利用度。因此三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物将会成为有效的治疗冠心病的新的具有酶学活性的化合物。
具体实施方式
实施例1
称取D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg；D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys；D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala；D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala；D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala；D8.Dh-β-Ala-     Arg      -    Ala     -Arg     -Ala     ；     D9.      Dh-   β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg  ；     D10.     Dh-   β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala的其中一种100mg，溶于1000ml 0.9％氯化钠溶液，混合均匀后，分装成0.1mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封，灭菌制成产品。
实施例2
称取D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg；D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys；D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala；D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala；D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala；D8.Dh-β-Ala-     Arg      -    Ala     -Arg      -Ala    ；      D9.    Dh-    β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg  ；     D10.    Dh-    β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala的其中一种100mg，溶于1000ml水中制成水溶液，混合均匀后，分装成0.1mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封，灭菌，冻干制成成品。
实施例3
称取D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg；D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys；D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala；D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala；D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala；D8.Dh-β-Ala-     Arg      -    Ala    -Arg      -Ala     ；      D9.    Dh-    β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg  ；     D10.    Dh-    β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala的其中一种100mg，药用淀粉0.5kg，按公知的胶囊制备技术和装备制成胶囊，每粒10mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊项下要求。
实施例4
称取D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg；D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys；D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala；D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala；D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala；D8.Dh-β-Ala-     Arg      -    Ala     -Arg     -Ala     ；      D9.    Dh-    β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg  ；     D10.    Dh-    β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala的其中一种100mg，微晶纤维素560g，无水乳糖380g，硬脂酸镁200g，氧化硅30g，按公知的制片技术和装备制成片剂，每片10mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下要求。