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聚乙二醇—干扰素水溶液
    【技术领域】

    本发明涉及一种稳定的聚乙二醇—干扰素α(PEG-IFNα)水溶液制剂，不含表面活性剂和人血提取成分。这种制剂保持了聚乙二醇—干扰素的生物学活性和稳定性。

    背景技术

    干扰素是由细胞分泌的一类诱生性蛋白质，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，是目前公认的最为有效的抗病毒药物之一，在国内外已广泛用于治疗多种病毒性、肿瘤性疾病。但干扰素结构不稳定，长期使用易产生抗体；相对分子质量小，在体内易经肾小球滤过排泄，导致体内循环半衰期短。利用一些无毒且水溶性好的免疫惰性大分子聚合物(如聚乙二醇)对其进行修饰，可以表现出更大的临床效力，其优点主要表现为在体外有较好的物理及热稳定性，抗酶解能力提高，可溶性增加；在体内循环半衰期明显延长，免疫原性下降，生物利用度提高等。

    目前国内外市场销售的干扰素剂型主要是粉针剂，使用时需要加入注射用水，给临床使用带来一些不便，更重要的是粉针剂的制造成本较高，价格昂贵，限制了干扰素的进一步推广。水针剂型取代冻干剂型是生物制品的发展趋势，许多医药公司都积极将细胞因子类蛋白质药物制成水针剂型，如G-CSF、EPO、胰岛素等。对于干扰素，由于水针剂型无需溶解，可以直接使用，相对于冻干剂型，水针剂剂量更容易控制，使用更加方便，而且制造费用明显降低，易于患者接受。研制开发干扰素水针剂型无疑具有重要意义。

    干扰素溶液的生产存在一些问题，主要是由于其有效成分对某些物理和化学因素的敏感性引起的，而且至今尚未得到满意的解决。与其它蛋白质相似，水溶液中的干扰素受到化学降解机理的作用如蛋白酶解、氧化、二硫化物交换、寡聚、脱酰胺作用和β-消去，以及物理机理的作用如聚集、沉淀和吸附等等。因此，通常的干扰素制剂都含有用来抵消这些作用的添加剂。目前，已有干扰素水针剂产品上市，其中含有人血清白蛋白(HSA)作为稳定剂。但是，该产品的生产工艺复杂，同时又存在病毒污染地危险，易形成聚集体而产生抗体。

    中国专利申请CN96100545.9公开了一种干扰素溶液，其中采用吐温20和80作为稳定剂。

    本申请人经过长时间的研究和探讨，出乎意料的发现了在pH6.8-7.5下稳定的聚乙二醇—干扰素水溶液，而该溶液不需要采用表面活性剂和人血清白蛋白(HSA)作为稳定剂。

    【发明内容】

    本发明的一个目的是提供一种稳定的聚乙二醇—干扰素水溶液制剂。

    本发明的其他目的，体现在本文对本发明的详细描述中。

    本发明涉及一种聚乙二醇—干扰素溶液制剂，含有

    (a)一种聚乙二醇—干扰素α溶液；

    (b)一种稳定剂；

    (c)一种调节pH在6.8-7.5的缓冲液；

    (d)一种抑菌剂；

    (e)一种等渗剂。

    本发明中所用的干扰素，可使用任何干扰素α，例如，欧洲专利No.43980中公开的干扰素α(其中称为成熟人白细胞干扰素A，也参见J.Pharm.Biomed，Analysis Vol.7，No.2，233-238(1989)).

    本发明中采用的干扰素α结合到聚合物上，例如聚亚烷基二醇(取代的或未取代的)如聚乙二醇上，形成聚乙二醇—干扰素α(PEG-干扰素α)。可用本技术领域中已知的各种接头完成这种结合，如欧洲专利申请EP-A-0510356和A-0593868中公开的那些接头。聚乙二醇的分子量可在300至45000道尔顿之间变化，一种或多种接头、优选一至三种接头结合到干扰素α上。虽然本发明并不限于特定的聚乙二醇—干扰素α，优选与干扰素α化学结合的聚乙二醇的平均分子量是40000，其中所述的优选的聚乙二醇—干扰素α分子是单一聚乙二醇分子与单一干扰素α分子化学结合的分子。

    用于本发明的优选干扰素α是聚乙二醇—干扰素α2a或聚乙二醇—干扰素α2b。按照本发明，每毫升聚乙二醇—干扰素溶液制剂含有106-108IU、特别是1-18×106(IU)的聚乙二醇—干扰素α。

    按照本发明，制剂中使用的稳定剂为氨基酸，如甘氨酸，和/或葡萄糖，优选甘氨酸和葡萄糖的组合。本发明溶液中稳定剂的含量约为5-50mg/ml，优选约为5-30mg/ml；当稳定剂为甘氨酸和葡萄糖的组合时，甘氨酸和葡萄糖的比例范围约为1.5-2.5∶1，优选1.8-2∶1。

    缓冲液可以是常用的缓冲液，优选的缓冲液是磷酸盐缓冲液，该缓冲液的适宜浓度约为10-20mmol/L，优选浓度为10mmol/L；该聚乙二醇—干扰素溶液的pH为6.8-7.5，优选pH为pH7.0-7.5，更优选pH为pH7.0-7.4，最优选pH为7.2。

    本发明溶液中的抑菌剂为常用抑菌剂，如苯甲醇，含量约为5-20mg/ml，最佳为10mg/ml。等渗剂为常用等渗剂，如氯化钠、甘露糖醇、甘油和氨基酸，氯化钠或甘露糖醇是优选的。达到等渗所需的这些辅助剂的量取决于溶液的组成，并且可用本领域的常规技术确定。

    本发明所述的聚乙二醇—干扰素溶液制剂，不用HSA作为保护剂，主要特点表现为：

    1.用简单的氨基酸类代替复杂的赋形剂，利于更准确地监测产品的质量；2.葡萄糖作为一种还原糖，与溶液中的残留氧一起维持有利于保持聚乙二醇—干扰素活性的氧化—还原电位；3.在pH5-6下干扰素α在玻璃表面上的吸附最大，本发明优选的缓冲液为pH7.0-7.5，具有与血浆pH接近的pH值。

    用下列实施例进一步阐述本发明。

    实施例1

    PEG-IFN溶液：

    组分                                 每毫升的量

    a.PEG-IFNα-2b                       1-18×106IU

    b.磷酸氢二钠                         9.8mg

    c.磷酸二氢钠                         3.8mg

    d.甘氨酸                             15.0mg

    e.葡萄糖                             8.0mg

    f.苯甲醇                             10.0mg

    g.氯化钠                             5.0mg

    h.注射用水                           适量加至1.0ml

    制备方法：

    按处方b-h称料，用无菌无热原注射水溶解，加入处方a半成品溶液使稀释至规定浓度。除菌过滤用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，保存于8±2℃，取样作无菌和热原检查合格后分装于密闭容器中。分装在百级洁净区进行，分装于西林瓶中，单剂量装每瓶1.1ml。分装后成品置2-10℃下暗处保存。

    实施例2

    PEG-IFNα溶液：

    组分                                   每毫升的量

    a.PEG-IFNα-2a                         1-18×106IU

    b.磷酸氢二钠                           9.8mg

    c.磷酸二氢钠                           3.8mg

    d.甘氨酸                               15.0mg

    e.葡萄糖                                   8.0mg

    f.苯甲醇                                   10.0mg

    g.氯化钠                                   5.0mg

    h.注射用水                                 适量加至1.0ml

    制备方法：

    方法同实施例1。

    为比较的目的，按照实施例1中给出的方法制备含3×106IUPEG-IFNα-2a(I/3)、6×106IU PEG-IFNα-2a(I/6)、9×106IU PEG-IFNα-2a(I/9)和18×106PEG-IFNα-2aIU(I/18)的各种PEG-IFNα-2a溶液以及不含葡萄糖的相应溶液(II/3-18)于4和25℃下贮藏于暗处，贮藏18个月后，测定PEG-IFNα-2a的生物学活性。

    表1  葡萄糖对PEG-IFNα-2a溶液稳定性的影响

    溶液                      18个月后PEG-IFNα-2a生物学活性保

                                        留百分比(％)

                                    4℃            25℃

    I/                              86.4           62.5

    I/6                             84.3           60.2

    I/9                             88.6           61.0

    I/18                            88.0           66.5

    II/3                            70.2           30.2

    II/6                            72.1           28.6

    II/9                            74.0           32.8

    II/18                           74.6           36.9

    实施例3

    按照本发明的配方，配制干扰素α溶液：

    溶液A

    组分                                  每毫升的量

    a.IFNα-2a                            1-18×106IU

    b.磷酸氢二钠                          9.8mg

    c.磷酸二氢钠                          3.8mg

    d.甘氨酸                                  15.0mg

    e.葡萄糖                                  8.0mg

    f.苯甲醇                                  10.0mg

    g.氯化钠                                  5.0mg

    h.注射用水                                适量加至1.0ml

    制备方法：

    方法同实施例1。

    溶液A采用3、6、9和18×106IU干扰素α-2a。于4和25℃下贮藏于暗处，贮藏3个月后，测定IFNα-2a的生物学活性，所得结果列于下表2中。

    表2.干扰素α与聚乙二醇结合前后溶液稳定性的比较

    溶液                        3个月后PEG-IFNα-2a生物学活性保留百

                                                 分比(％)

                                         4℃             25℃

    A/3                                  73.2            15.6

    A/6                                  72.3            14.2

    A/9                                  75.6            45.3

    A/18                                 85.6            48.6

    I/3                                  98.3            90.3

    I/6                                  98.9            90.9

    I/9                                  100             95.2

    I/18                                 100             96.8

    从这些数据清楚地看出，干扰素与聚乙二醇结合后，其水溶液的稳定性明显优于单纯的干扰素溶液。

    实施例4

    不含HSA的聚乙二醇—干扰素溶液见中国专利CN1141808A，该专利中使用非离子洗涤剂。本发明的独特之处在于选择甘氨酸和葡萄糖作为稳定剂，(I)最大程度降低对人体的危害；(II)便于最终产品的质量控制；(III)葡萄糖作为一种还原糖，与溶液中的残留氧一起维持有利于保持聚乙二醇—干扰素活性的氧化—还原电位。

    溶液B

    组分                                    每毫升的量

    a.PEG-IFNα-2a                             1-18×106IU

    b.乙酸铵                                   1.0mg

    c.氯化钠                                   5.0mg

    d.苯甲醇                                   10.0mg

    e.吐温80                                   0.05mg

    f.乙酸达pH5.0±0.1                         适量

    g.NaOH 0.1N达pH5.0±0.1                    适量

    h.注射用水                                 达1.0ml

    溶液B相当于上面专利中所述的溶液，采用3、6、9和18×106IU，于4和25℃下贮藏于暗处，贮藏18个月后，测定IFNα-2a的生物学活性，所得结果列于下表3中。

    表3.PEG-IFNα溶液稳定性的比较

    溶液                    3个月后PEG-IFNα-2a生物学活性保留百

                                          分比(％)

                                    4℃             25℃

    B/3                             83.2            60.6

    B/6                             84.3            64.2

    B/9                             87.6            65.3

    B/18                            90.5            68.6

    B/36                            89.7            68.2

    I/3                             86.4            62.5

    I/6                             84.3            60.2

    I/9                             88.6            61.0

    I/18                            88.0            66.5

    I/36                            89.6            67.1

    从上表的数据清楚地看出，本发明与中国专利CN1141808A比较，聚乙二醇-干扰素溶液的稳定性无显著差异，都可达到可接受的贮藏稳定性。