9－｛2－［双（特戊酰氧基甲氧基）磷酰甲氧基］乙基｝腺嘌呤葡萄糖醛酸盐及其制备方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN200410035577.2	申请日：	2004.08.19
公开号：	CN1603331A	公开日：	2005.04.06
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回\|\|\|实质审查的生效\|\|\|公开
IPC分类号：	C07H15/26; C07F9/6561; A61K31/7064; A61K31/12	主分类号：	C07H15/26; C07F9/6561; A61K31/7064; A61K31/12
申请人：	山东中科泰斗化学有限公司;
发明人：	王法平; 李晓翔
地址：	250100山东省济南市历下区工业南路67号
优先权：
专利代理机构：	山东济南齐鲁科技专利事务所有限公司	代理人：	王井养
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内容摘要

一种新的抗病毒活性化合物9－{2－[双(特戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤葡萄糖醛酸盐化合物，是由9－{2－[双(特戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤和葡萄糖醛酸在有机溶剂中进行成盐反应，并在醇或醚存在下结晶析出9－{2－[双(特戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤葡萄糖醛酸盐白色晶体。制备工艺简单，易于控制，成本低，其收率高达90％以上。实验表明该化合物具有吸湿性小，对光、热、湿度环境等稳定性好。具有显著抗病毒和良好的保肝、护肝双重功效，可作为制备抗肝炎病毒治疗的优选药物。

权利要求书

1、  一种具抗病毒活性的化合物，其特征在于所说的抗病毒活性化合物为核苷酸类似物阿德福韦酸葡萄糖醛酸盐化合物，其结构式为：

化学名为9-{2-[双(戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤葡萄糖醛酸盐；该化合物显示出如下物化特征：
(1)外观：白色晶体；
(2)熔点：93.5-95℃；
(3)元素分析(％)：
         C    H   N    O    P
计算值(％)44.85，6.32，10.06，34.52，4.50
实测值(％)44.83，6.33，10.04，34.55，4.48
(4)分子式：C₂₆H₄₂N₅O₁₅P
(5)DSC：93.8℃有峰为熔点峰；
(6)TG：132.1℃开始分解；
(7)IR(cm^-1)：3336，3213，2916，1755，1692，1611，1482，1420，1281，1258，1142，1055，1025，960，898，852，768，568。

2、  依照权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于包括以下主要步骤：
(1)把阿德福韦酯与葡萄糖醛酸分别溶于一种有机溶剂中，室温搅拌两种溶液，进行成盐反应，阿德福韦酯与葡萄糖醛酸的摩尔比为1-1.2∶1；
(2)在室温和不断搅拌下，把醚溶剂慢慢加入阿德福韦酯与葡萄糖醛酸的混合反应液中，搅拌过夜，有固体析出，经过滤，真空干燥，得到阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的白色晶体，醚溶剂的加入量为反应混合液总量的3-5倍。

3、  依照权利要求2所述的制备方法，其特征在于操作步骤(1)中所说的有机溶剂，它选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氧呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿、甲苯或苯中的一种。

4、  依照权利要求2所述的制备方法，其特征在于操作步骤(2)中所说的醚溶剂它选自乙醚或石油醚。

5、  依照权利要求2所述的制备方法，其特征在于当阿德福韦酯与葡萄糖醛酸的摩尔比为1∶1时，成盐后的反应液，在室温下直接真空浓缩至干，得到阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的白色晶体。

6、  依照权利要求2所述的制备方法，其特征在于以治疗上的有效量用于制备治疗抗肝炎病毒的药物组合物，其中包含有治疗有效量的阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐化合物的活性组分，以及药学上可接受的载体。

说明书

9-{2-[双(特戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤葡萄糖醛酸盐及其制备方法
所属技术领域
本发明涉及医药用杂环化合物领域，更具体地说是关于核苷酸类似物阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐化合物及其制造技术。
背景技术
下列定义适用于整个说明书和权利要求书。
PMEA＝阿德福韦(Adefovir)，化学名为9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤；
AD＝AdefovirDipivoxil，阿德福韦的双新戊酰氧基甲酯；化学名为9-{2-[双(特戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤；
GLU＝葡萄糖醛酸    D-Glucuronicacid；
AD-GLU＝阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐；
AD-F＝阿德福韦酯富马酸盐。
核苷酸类似物阿德福韦酯(AdefovirDipivoxil，简称AD)是母体化合物9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基}腺嘌呤(简称PMEA)的双新戊酰氧基甲酯(化学名为9-{2-[双(特戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤)，它对HIV，HBV等病毒具有较强的抗病毒活性和抗耐药性。用于治疗各种类型的乙型肝类，目前还没有发现对阿德福韦酯耐药性的变株，非常具有临床价值。
葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid，简称GLU)是目前临床常用整合解毒剂药物，它具有多种药理功效。它可降低肝脏淀粉酶活性，抑制糖原分解，使肝糖果原量增加，脂肪贮量减少，并能与肝内及肠内的毒素结合转变为无毒的葡萄糖醛酸结合物而排出体外，故有保肝及解毒作用。但是葡萄糖醛酸在应用抗病毒方面的能力远远不够。
AD和PMEA在下述文献中有叙述：US4724233，US4808716，EP481214，Benzaria等Nucleosides and Nulcleotide(1995)14(3-5)：563-565，Holy等Collect.Czech.Chem.(1989)54：2190-2201和52：2801-2809，Rosenberg等，Collect.Czech.Chem.(1988)53：2753-2777，Starrett等，Antiviral Res.(1992)19：267-273，和J.Med.Chem.(1994)37：1857-1864.AD，仅以无定性形式提供，稳定性差不适合做成给药物形式。
W09904774报道了AD的无水结晶(形态1)，水合形(形态2)，甲醇溶剂形(形态3)，富马酸盐或者复合物(形态4)，半硫酸盐或者复合物，氢溴酸盐或者复合物，硝酸盐或者复合物，甲磺酸盐或者复合物，乙磺酸盐或者复合物，β-萘磺酸盐或者复合物，α-萘磺酸盐或者复合物，(S)-樟脑磺酸盐或者复合物，琥珀酸盐或者复合物，马来酸盐或者复合物，抗坏血酸盐或者复合物，烟酸盐或者复合物。其中适合作药物的形态有AD的无水结晶(形态1)和AD的富马酸盐(形态4)。这些形态，在普通条件下放置，相对来说也不够稳定。其中无水结晶AD，在自然的条件下容易转化为含有结晶水的形态2，AD富马酸盐的形态4，在自然条件下具有一定的吸湿性，从而影响质量。
AD和简单的有机酸、无机酸盐等形式可用来抗病毒治疗乙型病毒肝炎，但无保肝和护肝的作用；葡萄糖醛酸具有显著的保肝作用和一定的抗病毒活性。对于肝炎患者来说，既需要抗病毒治疗，又需要护肝和保肝治疗。
发明内容
本发明目的是提供一种稳定性好，且具有抗病毒活性和保肝护肝双重作用的阿德福韦酯的葡萄糖醛酸盐(简称AD-GLU)的新化合物。
本发明的另一个目的是提供了这种阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的制备方法。
本发明的再一个目的是提供具有抗肝炎病毒活性和保肝护肝作用的药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的AD-GLU化合物的活性成分，以及药学上可接受的载体。
本发明所制备的阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐化合物，其结构式为：

化学名为9-{2-[双(特戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤葡萄糖醛酸盐。该化合物可用于制备抗肝炎病毒治疗的药物，并具有保肝护肝作用。
用元素分析、热重分析、差热分析，红外光谱等方法测定了本发明所制备的阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐化合物的物化特性：阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐为白色晶体，mp94-95℃，分子式为C₂₆H₄₂N₅O₁₅P。
化合物元素分析：由C、H、N、O、P组成(％)：
              C       H     N       O       P
计算值(％)     44.85    6.32    10.06     34.52     4.50
测量值(％)     44.83    6.33    10.04     34.55     4.48
用差热分析(DSC)，如附图2所示，在93.8℃有峰，该峰为熔点峰。
用热重分析(TG)，如附图3所示，在132.1℃开始分解。
该化合物的红外吸收光谱如附图1所示(Cm^-1，KBr)：3336，3213，2916，1755，1692，1611，1482，1420，1281，1258，1142，1055，1025，960，898，852，768，568。
本发明所述的阿德福韦酯葡萄糖醛盐可以由PMEA为起始物料先制成阿德福韦酯。再通过阿德福韦酯与葡萄糖醛酸直接作成盐反应来制备。
PMEA可参照US4724233、EP048241和J.Med.Chem(1994)37：1857-1864等文献资料，和CN200410024276.X专利中所公开的方法进行制备。
阿德福韦酯与葡萄糖醛酸的成盐反应包括以下主要步骤：
(1)把阿德福韦酯与葡萄糖醛酸分别溶于一种有机溶剂中，再在室温下，将阿德福韦酯溶液与葡萄糖醛酸溶液，在搅拌下混合反应成盐。阿德福韦酯与葡萄糖醛酸的摩尔比为1-1.2∶1。其优选比例为1∶1。
这里所说的有机溶剂可以从甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氧呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿、甲苯或苯等有机溶剂中选择。
(2)在室温和不断搅拌下，往阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的反应液中慢慢加入醚溶剂并搅拌过夜，有固体析出，过滤，室温真空干燥，得到阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的白色晶体。其收率达90％以上。这里所说的醚溶剂，它选自乙醚或石油醚，其加入量为反应混合液总量的3-5倍。
在这里也可以不加入醚溶剂，在上述的制备方法中当阿德福韦酯与葡萄糖醛酸的摩尔比控制在1∶1时，成盐后的反应液，可在室温下直接真空浓缩至干，同样可以制得高收率的阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐。
本发明制取的阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐，还可以以治疗上的有效量用于制备治疗抗肝炎病毒的药物组合物，其中包含有治疗有效量AD-GLU化合物的活性组分，以及药学上可以接受的载体。
本发明提供的这种药物组合物中，通常含有成人可接受的阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐为13.5mg/片。服用时，每天一片，一个疗程时间为一年。本发明的药物组合物稳定性好，具有显著的抗病毒活性和良好的保肝护肝的双重功能。
为了证明本发明阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐化合物的稳定性，用本发明的AD-GLU做了稳定性实验，并以W09904774报道的阿德福韦酯富马酸盐为对照。试验样品分别放与40℃、60℃，75％相对湿度，4000LX光照条件下，于10天、30天、60天取样用HPLC内标法测定含量，结果见表1
表1AD-GLU与AD-F稳定性对比

放置条件放置时间(天) 对比物含量(％) AD-GLU AD-F 0 100 100 40℃ 10 99.8 99.7 30 99.6 99.4 60 99.3 99.0 60℃ 10 99.7 99.7 30 99.3 99.2 60 99.0 98.5 4000LX 光照 10 99.9 99.8 30 99.8 99.7 60 99.6 99.4 75％相对湿度 10 99.8 99.7 30 99.5 99.2 60 99.1 98.2

实验结果表明，AD-GLU在上述条件下表现出更好的稳定性。
另外，还做了阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的吸湿性实验，并与阿德福韦酯富马酸盐作了比较。阿德福韦酯富马酸盐是按W09904774报导的方法合成的高纯物作为对照品。各取试验品10克，分别放于75％相对湿度环境中，于10天，30天，60天称重。结果见表3。
表3AD-GLU与AD-F吸湿性比较放置时间(天) 0 10 30 60 AD-GLU W(g) 10.00 10.08 10.10 10.12 形态白色晶体 AD-F W(g) 10.00 10.10 10.20 10.30 形态白色晶体

实验表明，阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐在75％相对湿度环境中放置60天，吸湿性仍然很小，表现出很好的稳定性。
进一步用大白鼠观察了本发明阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐地保肝作用，并与阿德福韦酯及葡萄糖醛酸作了比较。试验选用50只体重为200±20g大白鼠，平均分成五个试验组。第一组为正常对照组，第二组为肝损伤模型组，第三组为本发明药物阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐治疗组，第四组为阿福韦酯治疗对照组，第五组为葡萄糖醛酸治疗对照组。第二组、第三组、第四组、第五组于试验的第一、五天分别于皮下注射纯的四氯化碳(5ml/Kg)，第三组于第一天至第六天皮下注射阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐生理盐水溶液40mg/kg，第四组于第一天至第六天皮下注射阿德福韦酯生理盐水溶液30mg/kg，第五组于第一天至第六天皮下注射葡萄糖醛酸生理盐水溶液35mg/kg，第一组于第一天至第六天注射相同体积的生理盐水，于第七天测定血清谷丙氨酸转氨酶，并取肝脏做病理切片检查，结果见表4。
表4AD-GLU与AD-F保肝作用实验对比组别第一组第二组第三组第四组第五组谷丙氨酸转氨酶(u/l) 272106812656肝脏切片观察结果正常肝细胞变浸、浸润、坏死严重有少量肝细胞变性及坏死肝细胞变性、浸润、坏死严重有少量肝细胞变性及坏死

实验结果表明：
(1)剂量水平为40mg/kg，阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐和35mg/kg的葡萄糖醛酸都能明显抑制谷丙胺酸转氨酶的升高，而阿德福韦酯几乎没有抑制谷丙胺酸转氨酶的升高的作用。
(2)病理切片检查表明，阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐和葡萄糖醛酸对肝细胞变性、浸润、坏死等指标都具有明显的改善作用，而阿德福韦酯几乎没有改善作用。
同时用体抗乙肝病毒实验观察了本发明阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的抗病毒活性，以阿德福韦酯和葡萄糖醛酸为对照品作了比较。实验是将HBV-DNA转染的细胞株，在10％的小牛血清培养液中进行。
将HBV-DNA转染的2.2.15细胞珠在10％的小牛血清培养液中进行培养，分成五个试验组。第一组为自然对照组，第二组为阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的治疗组，第三组为阿德福韦酯治疗对照组，第四组为葡萄糖醛酸治疗对照组。当生长达到70％培养面积(25CM²)时，改用2％的小牛血清培养液培养，并开始分别对第二组给予40.5ug/ml的阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐进行治疗，第三组给予30ug/ml的阿德福韦酯进行治疗，第四组给予35ug/ml的葡萄糖醛酸进行治疗。每两天更换培养液，治疗组都分别补充相同浓度的药物，共培养10天，培养过程中测定两组培养液中HbsAg的含量(ug/ml)，结果见表5。
表5AD-GLU体外抗乙肝病毒活性对比天数/天 0 2 4 6 8 10 对照组 2.0 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 AD-GLU治疗组 2.0 1.4 1.3 1.0 0.9 0.8 AD治疗组 2.0 1.6 1.4 1.3 1.2 1.0 葡萄糖醛酸治疗组 2.0 1.9 1.8 1.7 1.7 1.6

从表中数据可见：
(1)对照组培养液中HbsAg浓度随着时间延长在持续地增加，治疗组在治疗2天后开始下降，这表明治疗组都具有抗HBV病毒作用。
(2)阿德福韦酯和阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐治疗组的培养液中HbsAg浓度变化小，比葡萄糖醛酸大，这表明阿德福韦酯和阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐具有更为显著的抗HBV病毒作用。
总之，本发明的优点是很明显的。本发明研制成功的9-{2-[双(特戊酰氧基甲氧基)磷酰甲氧基]乙基}腺嘌呤葡萄糖醛酸盐为白色晶体，实验证明该化合物具有吸湿性小，对光、热、湿度环境等稳定性好，具有显著抗病毒活性和良好的保肝、护肝双重功效。其制备工艺简单、易于控制，成本低，其收率最高可达99.8％。本发明化合物可作为用于制备抗肝炎病毒治疗的优选药物。
附图说明
附图1为本发明阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的红外图谱。
附图2为本发明阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐的差热分析图谱。
附图3为本发明德福韦酯葡萄糖醛酸盐的热重分析图谱。
具体实施方式
下面再用一些实施例对本发明作进一步说明，给出本发明的一些实施细节，但是并不旨在限定本发明的保护范围。
例1制备阿德福韦酯
将16g1-甲基-2-吡咯烷酮、5gPMEA、6g三乙胺和1.4g特戊酸氯甲酯等物料加入三口瓶中，60℃反应2小时(TLC检测)，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤、浓缩、柱层析(洗脱液：甲醇∶二氯甲烷＝5∶95)，洗脱液浓缩，重结晶，得到2g固体。
例2制备阿德福韦酯。葡萄糖醛酸盐
将10AD、8ml乙醇，室温搅拌至溶解，加入3.84g葡萄糖醛酸+50ml乙醇溶液，搅拌30分钟慢慢加入100ml乙醚，搅拌过夜，有固体析出，过滤，室温真空干燥得到12.8g白色晶体，收率92.41％。Mp94-95℃为阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐。
元素分析(％)(C₂₆H₄₂N₅O₁₅P)
计算值(％)C：44.85％，H：6.32％，N：10.06％，O：34.52％，P：4.50％
实测值(％)C：44.83％，H：6.33％，N：10.04％，O：34.55％，P：4.48％
DSC：93.8℃有峰为熔点峰；
TG：132.1℃开始分解
IR(cm^-1)：3336，3213，2916，1755，1692，1611，1482，1420，
1281，1258，1142，1055，1025，960，898，852，768，568。
例3制备阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐
将10AD、8ml甲醇，室温搅拌至溶解，加入3.84g葡萄糖醛酸+40ml甲醇溶液，搅拌2小时，室温真空浓缩至干得到13.80g白色晶体，收率99.85％，Mp94-95℃为阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐。
例4制备阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐
将10AD、8ml四氢呋喃，室温搅拌至溶解，加入3.84g葡萄糖醛酸+60ml乙醇溶液，有固体析出，继续搅拌过夜，过滤，室温真空干燥得到12.0g白色晶体，收率88.71％，为阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐。
例5制备阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐制剂：
阿德福韦酯葡萄糖醛酸盐         13.5g
乳糖                           27.5g
微晶纤维素                     25g
交联羟甲基纤维素钠             2g
硬脂酸镁                       1g
微分硅胶                       1g
制成1000片                     每片含AD-GLU13.5mg。