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1、10申请公布号CN104087558A43申请公布日20141008CN104087558A21申请号201410322954422申请日20140708C12N5/2020060171申请人西藏天虹科技股份有限责任公司地址850000西藏自治区拉萨市经济技术开发区B区拉青路72发明人张春颖74专利代理机构北京远大卓悦知识产权代理事务所普通合伙11369代理人史霞54发明名称一种杂交瘤细胞无血清培养基57摘要本发明公开了一种杂交瘤细胞无血清培养基，通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、微量元素及生物碱、脂肪酸和激素等补充因子，使该培养基能使杂交瘤细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细。
2、胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足杂交瘤细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行杂交瘤细胞的高密度大规模培养。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图1页10申请公布号CN104087558ACN104087558A1/1页21一种杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，包括下列重量份的组分基础培养基1300016000；微量元素组合物1007310100；氨基酸组合物5231275；无菌水9001100；其中所述基础培养基由DMEF和F12培养。
3、基按照08120812的重量比混合而成。2如权利要求1所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种谷氨酰胺1252425059、组氨酸304810598、异亮氨酸534113125、亮氨酸589416723、赖氨酸912519326、甲硫氨酸15266142、苯丙氨酸34128356、脯氨酸17343541、丝氨酸27319515、苏氨酸54169724和色氨酸8275241。3如权利要求2所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述微量元素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种氯化镍000003000031、氯化锡000002000023、。
4、亚硒酸钠00000500005、碳酸氢钠24402451、氯化钠699550703120、氯化钾3128131390、氯化镁29653042、硫酸镁48854921、一水磷酸二氢钠62516253、磷酸氢二钠71037215、硫酸锌04310445、氯化钙1166011732、五水硫酸铜0001400016和七水硫酸铁00620071。4如权利要求3所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基中还包括1114重量份的维生素组合物，所述维生素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种维生素B600102、维生素B12002042、维生素C910、维生素E030031、D泛酸钙0004000。
5、5、叶酸00620081、肌醇083143和生物素04121。5如权利要求4所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基中还包括230560重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种表皮生长因子0025005、血清胺006003、硫代甘油00000100001、乙醇胺350450、羟丙基B环状糊精2353454312、谷胱甘肽045126和卵磷脂125286。6如权利要求5所述的杂交瘤细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基中还包括11002500重量份的糖类物质组合物，所述糖类物质组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种果糖10002000和海藻糖1。
6、00500。权利要求书CN104087558A1/7页3一种杂交瘤细胞无血清培养基技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞无血清培养基。背景技术0002传统的含血清培养基中的血清给生产与科研带来多种不利因素。血清的主要作用在于给细胞提供生长增值所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，但其存在很多缺点具有批间差异、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、尤其不利于疫苗和单克隆抗体等目的产物的分离纯化、容易被病毒和支原体感染；血清昂贵可能发生供应紧张，血清的来源不稳定等问题。0003杂交瘤细胞是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B细胞融合而成的细。
7、胞。杂交瘤细胞是一种能分泌单一独特抗体的无限传代细胞，杂交瘤细胞技术首先由英国的KOHLER和MISTEIN在1975年通过小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合建立的。杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体在诊断、免疫、纯化、疫苗生产、治疗和基础研究等方面有着广泛的应用，已成为生物工程发面的重要产品。单克隆抗体用于体内诊断和治疗之后，对单克隆抗体产品的纯度提出了更高的要求，而杂交瘤细胞培养时使用的血清中的各种蛋白是单克隆抗体纯化的主要障碍。目前，国外已有杂交瘤细胞商业无血清培养基上市，如GIBCO公司的CDHYBRIDOMA培养基、HYBRIDOMASAM培养基、PFHMPROTEINFREE培养基，HYCLO。
8、NE公司的HYQCCMI等等。上述杂交瘤细胞无血清培养基都有各自的优点，但因为价格昂贵不适合大规模生产，同时有些培养基没有针对细胞进行优化，所支持的细胞密度较低，导致生产过程产量不高。发明内容0004本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞无血清培养基，通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、微量元素及表皮生长因子、血清胺等补充因子替代血清蛋白成分，使该培养基能使杂交瘤细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足杂交瘤细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行杂交瘤细胞的高密度大规模培养。0005。
9、本发明的技术方案为0006一种杂交瘤细胞无血清培养基，其中，包括下列重量份的组分0007基础培养基1300016000；0008微量元素组合物1007310100；0009氨基酸组合物5231275；0010无菌水9001100；0011其中所述基础培养基由DMEF和F12培养基按照08120812的重量比混合而成。说明书CN104087558A2/7页40012优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述氨基酸组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种0013谷氨酰胺1252425059、组氨酸304810598、异亮氨酸534113125、亮氨酸589416723、赖氨酸912519326。
10、、甲硫氨酸15266142、苯丙氨酸34128356、脯氨酸17343541、丝氨酸27319515、苏氨酸54169724和色氨酸8275241。0014优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述微量元素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种氯化镍000003000031、氯化锡000002000023、亚硒酸钠00000500005、碳酸氢钠24402451、氯化钠699550703120、氯化钾3128131390、氯化镁29653042、硫酸镁48854921、一水磷酸二氢钠62516253、磷酸氢二钠71037215、硫酸锌04310445、氯化钙1166011732、五水硫酸。
11、铜0001400016和七水硫酸铁00620071。0015优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括1114重量份的维生素组合物，所述维生素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种维生素B600102、维生素B12002042、维生素C910、维生素E030031、D泛酸钙00040005、叶酸00620081、肌醇083143和生物素04121。0016优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括230560重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种表皮生长因子0025005、血清胺006003、硫代甘油000001000。
12、01、乙醇胺350450、羟丙基B环状糊精2353454312、谷胱甘肽045126和卵磷脂125286。0017优选的是，所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括11002500重量份的糖类物质组合物，所述糖类物质组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种果糖10002000和海藻糖100500。0018本发明具有以下有益效果通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、微量元素及表皮生长因子、血清胺等补充因子替代血清蛋白成分，使该培养基能使杂交瘤细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足杂交瘤细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的。
13、诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行杂交瘤细胞的高密度大规模培养。通过对比试验检验，杂交瘤细胞在本发明所述的杂交瘤细胞无血清培养基中的细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基的培养效果相当，并优于国外商品化的杂交瘤细胞无血清培养基。附图说明0019图1为杂交瘤细胞在本发明所述的杂交瘤细胞无血清培养基和HYCLONE公司的HYQPFMAB培养基中生长曲线图。具体实施方式0020下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。0021一种杂交瘤细胞无血清培养基，其中，包括下列重量份的组分0022基础培养基1300016000；说明书CN104087。
14、558A3/7页50023微量元素组合物1007310100；0024氨基酸组合物5231275；0025无菌水9001100；0026其中所述基础培养基由DMEF和F12培养基按照08120812的重量比混合而成。0027所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述氨基酸组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种0028谷氨酰胺1252425059、组氨酸304810598、异亮氨酸534113125、亮氨酸589416723、赖氨酸912519326、甲硫氨酸15266142、苯丙氨酸34128356、脯氨酸17343541、丝氨酸27319515、苏氨酸54169724和色氨酸8275241。00。
15、29所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述微量元素组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种氯化镍000003000031、氯化锡000002000023、亚硒酸钠00000500005、碳酸氢钠24402451、氯化钠699550703120、氯化钾3128131390、氯化镁29653042、硫酸镁48854921、一水磷酸二氢钠62516253、磷酸氢二钠71037215、硫酸锌04310445、氯化钙1166011732、五水硫酸铜0001400016和七水硫酸铁00620071。0030所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括1114重量份的维生素组合物，所述维生素组合物包括以。
16、下重量份的组分中的一种或几种维生素B600102、维生素B12002042、维生素C910、维生素E030031、D泛酸钙00040005、叶酸00620081、肌醇083143和生物素04121。0031所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括230560重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种表皮生长因子0025005、血清胺006003、硫代甘油00000100001、乙醇胺350450、羟丙基B环状糊精2353454312、谷胱甘肽045126和卵磷脂125286。0032所述的杂交瘤细胞无血清培养基中，所述培养基中还包括11002500重。
17、量份的糖类物质组合物，所述糖类物质组合物包括以下重量份的组分中的一种或几种果糖10002000和海藻糖100500。0033所述杂交瘤细胞无血清培养基是在参考现有的文献基础上经过大量实验验证而设计出的培养基配方，通过选择适当的微量元素和氨基酸代替血清蛋白成分，应用PLACKETTBURMAN实验设计，对培养基添加成分进行了评价，采用响应面分析法优化各个组分的最佳使用剂量得到所述的杂交瘤细胞无血清培养基。0034具体实施中，本发明所述的杂交瘤细胞无血清培养基以重量比为11的DMEF和F12的基础培养基，添加以下组分00351表皮生长因子促进多种类型细胞有丝分裂；00362血清胺广泛存在于哺乳细胞。
18、组织中的血管收缩剂，具有促进体外细胞黏附和生长的作用；00373微量元素CU、FE、SE、ZE和MG等微量元素，主要为酶的辅基参与代谢的调节；00384金精三羧基金属螯合剂，具有结合并运输FE2，部分替代转铁蛋白的功能，同时也能通过结合和运输CA2及MG2促进细胞的黏合和伸展；说明书CN104087558A4/7页600395氨基酸蛋白合成的前体和合成其他生物大分子的中间体，是细胞提供的必要营养成分；00406生物素参与羧化、糖原异生和蛋白质合成等生化反应，对体外培养细胞的生长和黏附具有一定的促进作用；00417乙醇胺磷脂和细胞膜合成的前体物质，对细胞生长具有一定的促进作用；00428单糖和双。
19、糖可作为细胞代谢的能源物质，并对细胞具有非特异性保护作用；00439羟丙基B环状糊精储存和运送生物大分子，提高生物活性物质的稳定性和生物利用度；004410维生素细胞组成成分；004511谷胱甘肽具有保护细胞膜免受自由基损伤的作用；004612卵磷脂做为细胞膜的重要组成部分。0047本发明所述的杂交瘤细胞无血清培养基的制备方法十分简单，称取配方量的各组分，加入1000ML无热源超纯水溶解并混匀，室温下搅拌2030MIN，使其溶解。用032UM微孔滤膜过滤除菌，无菌保存。0048本发明可用于杂交瘤细胞传代培养或杂交瘤细胞高密度连续灌注悬浮培养，具有以下优点00491无任何蛋白质添加物，化学成分确。
20、定；00502无需适应而杂交瘤细胞生长旺盛、维持活力时间长，在产物表达方面与血清培养基接近或相当；00513支持细胞长期传代培养；00524所有化学结构已知，有利于产物的分离纯化，提高产品的品质；00535成分均为小分子物质、成本低、易于分离纯化，适合大规模工业化生产。0054实施例10055按照下列配方称取个组分，本发明所有原料均采购SIGMA细胞培养级的原料，并按照相关要求储存。0056组成含量MG/LDMEF/F121115000表皮生长因子0025血清胺006氯化镍000004氯化锡000002亚硒酸钠000005硫代甘油00001说明书CN104087558A5/7页7谷氨酰胺125。
21、24组氨酸3048异亮氨酸53410057亮氨酸5894赖氨酸9125甲硫氨酸1526苯丙氨酸3412脯氨酸1734丝氨酸2731苏氨酸5416色氨酸827果糖1000海藻糖300维生素B6001维生素B12002维生素C10维生素E031D泛酸钙0004叶酸0062肌醇083生物素121碳酸氢钠2440氯化钠699550说明书CN104087558A6/7页8氯化钾31281氯化镁2965硫酸镁4885一水磷酸二氢钠6251磷酸氢二钠7215硫酸锌0445氯化钙11732五水硫酸铜00016七水硫酸铁0062乙醇胺350羟丙基B环状糊精23534谷胱甘肽045卵磷脂12500580059采用。
22、本发明所述杂交瘤细胞无血清培养基通过以下方法进行杂交瘤细胞培养并计数0060将由ATCCA获得的HB58按常规方法无血清悬浮复苏细胞到T25方瓶，细胞长成致密单层后离心、重悬无血清基础培养基传代培养，培养至少3代以上，待细胞至对数生长期后逐级扩增至500ML三角瓶中，当细胞密度4106CELLS/ML，体积40ML。取相同数量细胞，按照细胞密度1106CELLS/ML，体积40ML，离心、重悬接种500ML三角瓶中，每组3个重复对照，含6的CO2的摇床中37、转速为120RPM振荡培养，每天取样计数，按规定流加，待细胞活率低于80，收获细胞液。一次性接种细胞至培养基，培养数天，每天取样计数，并。
23、用台盼蓝染色计算细胞活率。0061与国外公司的同类培养基进行比较如下0062按照上述的方法驯化HB58到HYCLONE公司的HYQPFMAB培养基中，取各自驯化好的细胞株，将HB58细胞每毫升的密度接种至500ML三角瓶中，将所有三角瓶置于含6的CO2的摇床中37，转速为120RPM，每天取样计数，并用台盼蓝染色计算细胞活率。0063如图1所示，处于上方的曲线为本发明所述无血清培养基培养的杂交瘤细胞的生长曲线，处于下方的曲线为HYCLONE公司的HYQPFMAB培养基培养的杂交瘤细胞的生长曲线，整个培养过程持续8天，培养第7天，本发明无血清培养基与HYCLONE公司的HYQPFMAB培养基活细胞密度分别达到2037104CELLS/ML和1894104CELLS/ML，本发明所述无血说明书CN104087558A7/7页9清培养基的培养效果优于国外厂家生产的同类培养基的培养效果。0064尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。说明书CN104087558A1/1页10图1说明书附图CN104087558A10。