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具有更低吸附性和更高水解能力的枯草溶菌素BPN’变异体.pdf

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摘要
申请专利号：

CN95193941.6

 申请日：

1995.03.16
公开号：

CN1151761A

 公开日：

1997.06.11
当前法律状态：

撤回

 有效性：

无权
法律详情：

发明专利申请公布后的视为撤回|||发明专利申请公布后的视为撤回||||||公开
IPC分类号：

C12N15/57; C11D3/386; C12N9/54

 主分类号：

C12N15/57; C11D3/386; C12N9/54
申请人：

普罗格特-甘布尔公司;
发明人：

P·F·博罗德三世; B·L·巴内特; D·N·卢宾; C·K·戈什
地址：

美国俄亥俄州
优先权：

1994.05.02 US 08/237,939; 1994.08.11 US 08/287,461; 1995.03.03 US 08/394,011
专利代理机构：

中国专利代理(香港)有限公司

 代理人：

吴玉和;王景朝
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内容摘要

本发明涉及枯草溶菌素BPN′的变异体，它具有野生型BPN′氨基酸序列的修饰氨基酸序列，该野生型氨基酸序列包括第一环状区、第二环状区、第三环状区、第四环状区和和第五环状区；其中修饰的氨基酸序列在一个或多个环状区中的特定位点，包含与存在于野生型枯草溶菌素BPN′中的不同的氨基酸(即取代)，通过这些氨基酸的作用，BPN′变异体与野生型枯草溶菌素BPN′相比，对不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本发明还涉及编码这样的枯草溶菌素BPN′变异体的基因。本发明还涉及用于清洁多种表面的包含该枯草溶菌素BPN′的组合物。

权利要求书

1： 一种具有野生型氨基酸序列的经修饰的氨基酸序列的BPN’变异体， 该野生型氨基酸序列包含第一环状区、第二环状区、第三环状区、第 四环状区和第五环状区；其特征为修饰氨基酸序列在一个或多个环状 区的一个或多个位点有取代；其中 A.当取代发生在第一环状区时，该取代发生在位点59、60、61、 62、63、65或66中的一个或多个位点；其中 a.当取代发生在位点59时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酸或丝氨酸； b.当取代发生在位点60时，取代氨基酸是谷氨酸； c.当取代发生在位点61时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰 胺、谷氨酸或丝氨酸； d.当取代发生在位点62时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰 胺、谷氨酸或丝氨酸； e.当取代发生在位点63时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸； f.当取代发生在位点65时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；并且 g.当取代发生在位点66时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸； B.当取代发生在第二环状区时，该取代发生在位点95、96、97、 98、99、100、101、102、103、104、105、106或107中 的一个或多个位点；其中 a.当取代发生在位点95时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸； b.当取代发生在位点96时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸； c.当取代发生在位点97时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸； d.当取代发生在位点98时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸 或苏氨酸； e.当取代发生在位点99时，取代氨基酸是谷氨酸； f.当取代发生在位点100时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸； g.当取代发生在位点101时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； h.当取代发生在位点102时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸； i.当取代发生在位点103时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酸或丝氨酸； j.当取代发生在位点104时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬 氨酸； k.当取代发生在位点105时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； l.当取代发生在位点106时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸；并且 m.当取代发生在位点107时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸； C.当取代发生在第三环状区时，该取代发生在位点126、127、 128、129、130、131、132或133中的一个或多个位点；其中 a.当取代发生在位点126时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸； b.当取代发生在位点127时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸； c.当取代发生在位点128时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸； d.当取代发生在位点129时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸； e.当取代发生在位点130时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； f.当取代发生在位点131时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸； g.当取代发生在位点132时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸；并且 h.当取代发生在位点133时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸 或苏氨酸； D.当取代发生在第四环状区时，该取代发生在位点154、155、 156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、 166或167中的一个或多个位点；其中 a.当取代发生在位点154时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸； b.当取代发生在位点155时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰 胺、谷氨酸或丝氨酸； c.当取代发生在位点156时，取代氨基酸是天门冬氨酸； d.当取代发生在位点157时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸； e.当取代发生在位点158时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸； f.当取代发生在位点159时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； g.当取代发生在位点160时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸； h.当取代发生在位点161时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； i.当取代发生在位点162时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； j.当取代发生在位点163时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； k.当取代发生在位点164时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸； l.当取代发生在位点165时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸； m.当取代发生在位点166时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；并且 n.当取代发生在位点167时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬 氨酸； E.当取代发生在第五环状区时，该取代发生在位点187、188、 189、190或191中的一个或多个位点；其中 a.当取代发生在位点187时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸 或苏氨酸； b.当取代发生在位点188时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； c.当取代发生在位点189时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、 天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪 氨酸或缬氨酸； d.当取代发生在位点190时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸；并且 e.当取代发生在位点191时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨 酸； 通过这些取代，与野生型枯草溶菌素BPN＇相比，BPN’变异体对不可溶 底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。
2： 如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第一环 状区。
3： 如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第二环 状区。
4： 如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第三环 状区。
5： 如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第四环 状区。
6： 如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第五环 状区。
7： 如权利要求1-6中的任何一种BPN’变异体，其中野生型氨基酸序列 还包含一个第六环状区，其特征在于修饰的氨基酸序列在第六环状区 也包含一个或多个取代；其中该取代发生在位点199、200、201、 202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、 212、213、214、215、216、217、218、219或220中的一个 或多个位点；其中 a.当取代发生在位点199时，取代199位的氨基酸是半胱氨酸、 丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门 冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； b.当取代发生在位点200时，取代200位的氨基酸是组氨酸、苏 氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天 门冬氨酸或谷氨酸； c.当取代发生在位点201时，取代201位的氨基酸是甘氨酸、谷 氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； d.当取代发生在位点202时，取代202位的氨基酸是脯氨酸、谷 氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； e.当取代发生在位点203时，取代203位的氨基酸是甲硫氨酸、 半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨 酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； f.当取代发生在位点204时，取代204位的氨基酸是天门冬氨酸 或谷氨酸； g.当取代发生在位点205时，取代205位的氨基酸是亮氨酸、缬 氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨 酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或 谷氨酸； h.当取代发生在位点206时，取代206位的氨基酸是脯氨酸、天 门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； i.当取代发生在位点207时，取代207位的氨基酸是天门冬氨酸 或谷氨酸； j.当取代发生在位点208时，取代208位的氨基酸是脯氨酸、甘 氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； k.当取代发生在位点209时，取代209位的氨基酸是异亮氨酸、 缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯 氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸 或谷氨酸； l.当取代发生在位点210时，取代210位的氨基酸是丙氨酸、甘 氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； m.当取代发生在位点211时，取代211位的氨基酸是脯氨酸、甘 氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； n.当取代发生在位点212时，取代212位的氨基酸是谷氨酰胺、 丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； o.当取代发生在位点213时，取代213位的氨基酸是色氨酸、苯 丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半 胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰 胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； p.当取代发生在位点214时，取代214位的氨基酸是苯丙氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、 组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、 丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； q.当取代发生在位点215时，取代215位的氨基酸是苏氨酸、脯 氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； r.当取代发生在位点216时，取代216位的氨基酸是组氨酸、苏 氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天 门冬氨酸或谷氨酸； s.当取代发生在位点217时，取代217位的氨基酸是亮氨酸、异 亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏 氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天 门冬氨酸或谷氨酸； t.当取代发生在位点218时，取代218位的氨基酸是谷氨酰胺、 丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸； u.当取代发生在位点219时，取代219位的氨基酸是脯氨酸、谷 氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；并且 v.当取代发生在位点220时，取代220位的氨基酸是脯氨酸、甘 氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
8： 一种从包含硬表面清洁组合物、碗碟清洁组合物或口腔清洁组合物、 假牙清洁组合物、接触透镜清洁组合物以及织物清洁组合物的组合物 组中筛选出的清洁组合物，其特征在于该清洁组合物包含权利要求 1-7中任何一项要求的BPN’变异体和清洁组合物载体。
9： 如权利要求8中的清洁组合物，其中该清洁组合物是硬表面清洁组合 物。
10： 如权利要求8中的清洁组合物，其中该清洁组合物是织物清洁组合 物。
11： 编码权利要求1-7中任何一项权利要求的BPN’变异体的突变BPN’ 基因。

说明书


具有更低吸附性和更高水解能力的枯草溶菌素BPN’变异体

    【技术领域】

    本发明涉及用于多种清洁组合物的新型的酶变异体(variant)，以及编码这些酶变异体的基因。背景

    酶构成了天然存在的蛋白质的最大一类。每类酶一般说来催化(加速一个反应而自身并没有损耗)一个不同类别的化学反应。一类通称为蛋白酶的酶，因为其水解(通过在被切开的化学键的两侧吸收水分子的H和OH部分而将一个化合物分解成两个或多个更简单的化合物)其它蛋白的能力而为人所知。通过将天然存在地和蛋白质工程化的蛋白酶作为添加剂掺入洗涤清洁剂制备物，可以利用其水解蛋白的能力。衣物上的许多污物是蛋白质类的，许多特定的蛋白酶可以从根本上改善对这类污物的清除。

    遗憾的是，这些蛋白在它们天然的、细菌环境中的功效水平往往不能转移至相对非天然的洗涤环境。具体地说，蛋白酶的特性例如热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性和底物特异性，对于该酶在天然环境之外使用来说并非必须是最优的。

    蛋白酶的氨基酸序列决定了该蛋白酶的特性。蛋白酶氨基酸序列的变化可以在不同程度上改变酶的性质，或者甚至可以使酶失活，这依赖于氨基酸序列中变化的位置、性质和/或重要性。有几种途径已被用来改变野生型蛋白酶的氨基酸序列，以改善它们的特性，其目标是提高这些蛋白酶在洗涤环境中的功效。这些途径包括改变氨基酸序列，以便在完全不同的条件下增强热稳定性和改善氧化稳定性。

    尽管本领域中描述的途径多种多样，对于用作清洁各种表面的蛋白酶的新的有效变异体仍存在着持续的需求。本发明的目标

    本发明的目标之一是提供枯草溶菌素(subtilisin)酶变异体，它与野生型的酶相比水解能力得到了改善。

    本发明的另一个目标是提供包含这些枯草溶菌素酶变异体的清洁组合物。概述

    本发明涉及枯草溶菌素BPN’的变异体，它具有野生型BPN’氨基酸序列的经修饰的氨基酸序列，该野生型氨基酸序列包括一个第一环状区、一个第二环状区、一个第三环状区、一个第四环状区和一个第五环状区；其中经修饰的氨基酸序列在一个或多个环状区中的特定位点，包含与存在于野生型枯草溶菌素BPN’中的不同的氨基酸(即取代)，由此，BPN’变异体与野生型枯草溶菌素BPN’相比，对不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本发明还涉及编码该枯草溶菌素BPN’变异体的基因。本发明还涉及用于清洁多种表面的包含该枯草溶菌素BPN’的组合物。说明I.枯草溶菌素变异体

    本发明涉及枯草溶菌素酶，特别是BPN’，通过使编码该酶的不同核苷酸序列突变来修饰该酶的氨基酸序列。与野生型枯草溶菌素相比，本发明的修饰过的枯草溶菌素酶(以下称作“‘BPN’变异体”)对于不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本发明还涉及编码该BPN’变异体的突变基因。

    本发明的枯草溶菌素酶属于一类通称为蛋白酶的酶类。蛋白酶是使肽键断裂的催化剂。蛋白酶中的一类是丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以通过如下事实辨别：在酶的活性部位有一个必需的丝氨酸残基。

    酶水解可溶性底物的速率随酶浓度而增加，这一发现已经被充分地证明了。于是，对于表面结合的底物，例如在许多清洁应用中所碰到的，水解的速率随表面浓度的增加而增加的结论似乎是合情合理的。这已被证明是事实。(P.F.布鲁德III和D.S.罗奇，LANGMUIR，“枯草溶菌素BPN’：固定化底物上的活性”，第8卷，1325-1329页(1992))。实际上，当酶的表面浓度不同时，对于不可溶底物的反应速率与表面浓度线性相关。(D.N.罗宾和M.D.波尔，“蛋白酶对蛋白-溶液界面水解反应的催化作用”，收录于《(聚合物溶液、混合体和界面》，由I.诺达和D.N.罗宾编著，艾尔斯韦尔，464页(1992))。令人惊异的是，当力图将研究中的原理应用于突变体蛋白酶以便得到更好的清洁效果时，我们并没有发现吸附较多的酶有更好的清洁效果。实际上，我们吃惊地确认事实是相反的：酶对底物的更低的吸附性导致对底物的更多的水解(即更好的清洁效果)。

    但是我们不愿被理论所束缚，当用一种变异体与其它的比较时，我们相信改善的效果来源于如下的事实：吸附性较低的酶也结合得更不紧密，因此该酶在将被清除不可溶蛋白质的底物表面上有更大的移动性。在可比的酶溶液浓度上，这种增加移动性的优点足以超过任何通过向表面释放更高浓度的酶所带来的好处。

    这里描述的突变是为了改变(即降低)酶对表面结合的污物的吸附性而设计的。在BPN’中，一定的氨基酸构成了酶分子的外环。出于讨论的目的，这些环将被称为第一、第二、第三、第四和第五环状区。具体地说，位点59-66构成第一环状区；位点95-107构成第二环状区；位点126-133构成第三环状区；位点154-167构成第四环状区；位点187-191构成第五环状区；位点199-220构成第六环状区(位点编号类似于野生型枯草溶菌素BPN’氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中的位置)。

    我们相信这些环状区在酶分子对表面结合多肽的吸附性中起了极其重要的作用，并且在一个或多个这些环状区上的特异性突变将对吸附性具有显著的影响。但是我们不愿被理论所束缚，相信至少有两个原因使环状区对BPN’分子的吸附性是非常重要的：第一，包含环状区的氨基酸可以与分子所暴露的任何表面紧密接触；第二，环状区与BPN’分子的活性部位和结合区的相似性，使它们在酶对表面结合底物(多肽/蛋白质污物)的催化性吸附方面有一定作用。

    如此处所使用的，“变异体”表示一种酶，它具有与野生型不同的氨基酸序列。

    如此处所使用的，“突变BPN’基因”表示编码BPN’变异体的基因。

    如此处所使用的，“野生型枯草溶菌素BPN”指被SEQ ID NO：1所描述的枯草溶菌素酶。枯草溶菌素BPN’的氨基酸序列被J.A.韦尔斯、E.费拉里、D.J.亨那、D.A.艾斯泰尔和E.Y.陈在《(核酸研究)》第II卷，7911-7925(1983)中进一步描述，在此引入作为参考。

    如此处所使用的，术语“野生型氨基酸序列”包含SEQ ID NO：1，同样也包含在除59-66，95-107，126-133，154-167，187-191和199-220任一个之外的任何位点的氨基酸序列被修饰的SEQ ID NO：1。

    如此处所使用的，“更加亲水的氨基酸”指参考下表中的亲水性，与所提到的氨基酸相比具有更高的亲水性的任何氨基酸。下面的亲水性表(表1)按照亲水性增加量的降序排列氨基酸(见T.P.霍普.和K.R.伍兹.，“从氨基酸序列预测蛋白质抗原决定簇”，美国国家科学院院刊，第78卷，3824-3828页，1981，在此引入作为参考)。

                       表1    氨基酸    亲水性值    Trp    -3.4    Phe    -2.5    Tyr    -2.3    Leu，Ile    -1.8    Val    -1.5    Met    -1.3    Cys    -1.0    Ala，His    -0.5    Thr    -0.4    Pro，Gly    -0.0    Gln，Asn    0.2    Ser    0.3    Arg+，Lys+，Glu-，Asp-    3.0

    表1还表明了哪种氨基酸带有电荷(这一特性是基于大约8-9的pH值)。带有正电荷的氨基酸是精氨酸和赖氨酸，带有负电荷的氨基酸是谷氨酸和天门冬氨酸，其它的氨基酸是中性的。在本发明的优选实施方案中，取代氨基酸是中性的或者是带负电荷的，更优选的是带有负电荷的(即谷氨酸或天门冬氨酸)。

    因此，举例来说，“用中性的或带有负电荷的，与谷氨酰胺亲水性相同或更强的氨基酸取代谷氨酰胺”是指谷氨酰胺将被天门冬酰胺(它与谷氨酰胺有相同的亲水性)，或丝氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸(它们比谷氨酰胺亲水性更强)取代；其中的每一种氨基酸都是中性的或带有负电荷的，并且与谷氨酰胺相比具有更高的亲水性值。类似的，“用中性的或带有负电荷的，与脯氨酸相比亲水性更强的氨基酸取代脯氨酸”是指脯氨酸将被谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸或天门冬氨酸取代。

    在本发明的一个实施方案中，BPN’变异体具有一个野生型氨基酸序列的修饰的氨基酸序列，其中修饰的氨基酸序列包含一个位于第一、第二、第三、第四或第五环状区中一个或多个位置的取代；通过该取代，BPN’变异体与野生型枯草溶菌素BPN’相比，对于不可溶底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。

    在本发明的另一个实施方案中，BPN’变异体还包含一个或多个位于第六环状区的取代。

    在本发明优选的实施方案中，位于一个或多个环状区的一个或多个位点的取代氨基酸参照表1，是中性的或带有负电荷的，并且与野生型氨基酸序列主体位点的氨基酸相比，亲水性相同或更强，优选的是亲水性更强的。A.位于第一环状区的取代

    当取代发生在第一环状区时，该取代发生在位点59、60、61、62、63、65或66中的一个或多个位点。

    当取代发生在位点59时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点60时，取代氨基酸是谷氨酸。

    当取代发生在位点61时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点62时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点63时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点65时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点66时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸。B.位于第二环状区的取代

    当取代发生在第二环状区时，该取代发生在位点95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107中的一个或多个位点。

    当取代发生在位点95时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

    当取代发生在位点96时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。

    当取代发生在位点97时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点98时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

    当取代发生在位点99时，取代氨基酸是谷氨酸。

    当取代发生在位点100时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点101时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点102时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点103时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点104时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。 

    当取代发生在位点105时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点106时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸。

    当取代发生在位点107时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。C.位于第三环状区的取代

    当取代发生在第三环状区时，该取代发生在位点126、127、128、129、130、131、132或133中的一个或多个位点。

    当取代发生在位点126时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。

    当取代发生在位点127时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点128时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点129时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点130时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点131时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点132时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点133时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。D.位于第四环状区的取代

    当取代发生在第四环状区时，该取代发生在位点154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166或167中的一个或多个位点。

    当取代发生在位点154时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点155时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点156时，取代氨基酸是天门冬氨酸。

    当取代发生在位点157时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点158时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点159时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点160时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点161时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点162时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点163时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点164时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点165时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

    当取代发生在位点166时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。

    当取代发生在位点167时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。E.位于第五环状区的取代

    当取代发生在第五环状区时，该取代发生在位点187、188、189、190或191中的一个或多个位点。

    当取代发生在位点187时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

    当取代发生在位点188时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点189时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸。

    当取代发生在位点190时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点191时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。F.位于第六环状区的取代

    当取代发生在第六环状区时，该取代发生在位点199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220中的一个或多个位点。

    当取代发生在位点199时，取代199位的氨基酸是半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点200时，取代200位的氨基酸是组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点201时，取代201位的氨基酸是甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点202时，取代202位的氨基酸是脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点203时，取代203位的氨基酸是甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点204时，取代204位的氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点205时，取代205位的氨基酸是亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点206时，取代206位的氨基酸是脯氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点207时，取代207位的氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点208时，取代208位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点209时，取代209位的氨基酸是异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点210时，取代210位的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点211时，取代211位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点212时，取代212位的氨基酸是谷氨酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点213时，取代213位的氨基酸是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点214时，取代214位的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点215时，取代215位的氨基酸是苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点216时，取代216位的氨基酸是组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点217时，取代217位的氨基酸是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点218时，取代218位的氨基酸是谷氨酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点219时，取代219位的氨基酸是脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。

    当取代发生在位点220时，取代220位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。G.酶变异体的制备实施例1变异的BPN’基因

    包含野生型枯草溶菌素BPN’基因的噬菌体质粒(pSS-5)(C.米钦森和J.A韦尔斯，(1989)，“枯草溶菌素BPN’中二硫键的蛋白质工程”，《生物化学》，第28卷，4807-4815页)被转化至大肠杆菌ung株CJ236内，并且使用VCSM13助手噬菌体生成一个单链的包含尿嘧啶的DNA模板(T.A.库克尔，J.D.罗勃兹和R.A.扎库，“不用表型选择的快速、有效的位点特异性突变”，《(酶学方法》第154卷，367-382页，(1987)；被P.D.约肯伯格、F.惠特尼、J.盖思索德和J.迈可克来所修改，“使用包含尿嘧啶的DNA和噬菌体质粒载体的位点特异性的体外突变”，收录于《特异性突变-一种实施方案》，由M.J.迈克佛森编著，第27-48页，(1991)；二者均在此引入作为参考)。使用采莱和史密斯的单链引物位点特异性的基因突变修饰的方法(M.J.采莱、和M.史密斯，“使用M13衍生载体的寡聚核苷酸特异性突变：在DNA任何片段中产生点突变的有效的和通用的过程”，收录于《核酸研究》第10卷，第6487-6500页，(1982)，在此引入作为参考)生成所有的突变体(基本上如上文中约肯伯格等人所介绍，1991)。寡聚核苷酸的使用应用生物系统公司380B DNA合成仪生成。基因突变反应产物被转化至大肠杆菌株MM294内(美洲型培养收集物大肠杆菌33625)。所有的突变体都通过DNA测序确认，并且分离出的DNA被转化至枯草杆菌表达株BG2036中(M.Y.扬、E.费拉里和D.J.亨那，(1984)，“枯草杆菌核蛋白酶基因的克隆以及使用克隆的基因在体外产生缺陷型突变”，收录于《微生物学杂志》第160卷，15-21页)。对某些突变体，尿嘧啶模板是使用框架终止密码子突变的修饰过的pSS-5来产生，该突变位于氨基酸217位。寡聚核苷酸被设计为在217位恢复正常的阅读框架，并且还编码位于59、60、61、62、63、64、65、66；95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107；126、127、128、129、130、131、132、133；154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167；187、188、189、191、191；199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219和220位的随机取代(在这些密码子上，用来编码三个碱基的所有四种核苷酸的等克分子量的和/或不相等的混合物)。改正框架终止子并能够生成功能性酶的突变被它们消化酪蛋白的能力所鉴别。随机取代由DNA测序所确定。实施例2发酵

    包含枯草溶菌素有益突变的枯草杆菌细胞(BE2036)在1升的LB-葡萄糖培养基培养基中生长至中对数期，然后接种至总体积为10升的BiostatED发酵器中(B.布劳恩生物技术公司，艾伦镇，宾夕法尼亚)。发酵介质包含酵母提取物、淀粉、消泡剂、缓冲液和痕量矿物质(见《发酵：一种实施方案》，B.迈克尼尔和L.M.哈韦编著，1990)。在发酵过程中，培养基的pH值恒定保持在7.0。加入氯霉素用于对突变质粒的抗生素筛选。细胞在37℃生长过夜至A600达到约60，然后收获。实施例3纯化

    发酵培养基经过如下的步骤来获取纯化的酶。培养基通过离心清除枯草杆菌细胞，用一个100K的隔断膜除去细小的微粒而获澄清。之后在一个10K的隔断膜上离心，然后用0.025M的MES缓冲液(2-(N-吗啉)乙烷磺酸)进行流动透析以降低离子强度并将pH值调至5.5。将酶加于阳离子交换层析柱或者亲和吸附层析柱进行进一步纯化，用氯化钠或丙烯乙二醇梯度液从层析柱上将酶洗脱(见R.K.司寇普思，《蛋白质纯化原理和实践》，斯普林格-弗拉格，纽约(1984)，此处作为文献引用)。

    pNA检测法(E.G.德尔玛、C.拉格曼、J.W.布鲁德里克和M.C.乔卡斯，《分析生物化学》第99卷，316-320页，(1979)，此处作为文献引用)被用来测定在梯度洗脱过程中所收集的分部中的活性酶的浓度。该方法测量的是：当酶水解可溶性合成底物——琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-p-肖基苯胺(sAAPF-pNA)时硝基苯胺释放的速率。水解反应所产生的黄颜色的速率用分光光度计在410nm测量，它于活性酶的浓度成比例。另外，在280nm的吸收度测量用于测定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白比率给出了酶的纯度，并且用于鉴别将被合并作为贮存液的分部。

    为了避免在贮存过程中酶的自我分解，在从层析柱上收获的合并分部中加入等重量的丙烯乙二醇。纯化步骤一旦结束，就用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测酶贮液的纯度，并且通过使用II-T型酪氨酸抑制剂的活性位点滴定法测定绝对酶浓度，该抑制剂是从西格玛化学公司购买的火鸡蛋清(圣路易斯，密苏里州)。测量出的转换因子将表明在酶分子不同位点的哪一种变化导致的酶变异体比野生型的酶对可溶性底物pNA具有更高的活性。

    在使用前的准备中，酶贮液要经过Sephadex-G25(法玛西亚公司，匹兹堡，新泽西州)分子大小分离柱洗脱以去除丙烯乙二醇并转换缓冲液。酶贮液中的MES缓冲液被转换成0.1M的包含0.01M CaCl2的Tris缓冲液(三(羟甲基氨基甲烷)，并且pH值用HCl调至8.6。所有的实验都是在恒温25℃时，pH值8.6的Tris缓冲液中进行的。H.酶变异体的特性实施例4模型表面制备

    从CPG公司(法菲尔德，新泽西州)购买的氨丙基控制的多孔玻璃(CPG)被用于共价结合从比切姆公司(托伦斯，加里福尼亚)购买的sAAPF-pNA底物。反应进行于二甲亚砜中，(1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐)(EDC)作为偶联试剂。完成之后(用pNA检测法监控)，除去多余的溶剂，CPG：sAAPF-pNA用二甲亚砜(DMSO)和双蒸水清洗。随后用N2净化的烘箱在70℃左右干燥。反应方案和固定底物的制备如P.F.布鲁德III和D.S.罗奇，“枯草溶菌素BPN’：固定化底物上的活性”，拉格缪，第8卷，1325-1329页，(1992)描述所进行，此处作为文献引用。

    CPG表面将拥有62,000+7,000个pNA分子/μm2。与收到的CPG公司报告的CPG的表面区域的值50.0m2/g相比，保持不变。这表明加入sAAPF-pNA的过程没有损坏多孔结构(平均直径为486A)。实施例5表面水解检测法

    通过使用CPG：sAAPF-pNA，对酶变异体的吸附和结合CPG的多肽的水解可以在一个简单的实验中测量。取少量的酶变异体加入除气的含有CPG：sAAPF-pNA的烧瓶中。烧瓶放于腕状动作摇床上振摇90分钟，在此期间，摇床于不同的时间间隔停止(例如，在吸附水解的早期阶段-如前20分钟，每2分钟-在接近实验结束的阶段每10分钟)。CPG：sAAPF-pNA可以下沉，在澄清液中取样。实验步骤和吸附及水解的计算方法如上述Brodeet al.，1992描述所进行。

    在本实验的过程中，监控所有的酶抗自我分解的稳定性，并且不应显示有可觉察的自我分解损失。因此，酶的吸附可以通过测量溶液的消耗来检测。最初的酶变异体的浓度与在每个独立的时间点测量的浓度之差给出酶变异体被吸附的量。pNA从表面被水解的量通过读取样品在410nm的吸收度的整数部分来测量。pNA的总量是通过计算将取样的量与残留在烧瓶中的量相加得出。该值通过减去没有酶时pNA被Tris缓冲液水解的量来修正。基本水解量占总水解量的比例随酶的效率的不同而在7-29％的范围内变化。实施例6可溶性底物的动力学分析

    可溶性底物sAAPF-pNA的水解的速率通过在DU-70分光光度计上测量410nm处光吸收度随时间的增加值来检测。每次动力学测定，当底物浓度从90-700μM sAAPF-pNA变化时，酶浓度保持不变，在6-10纳摩尔之间。在900秒的时间内，每秒取一个吸收度数据点，并且这些数据被转换成一个LOTUSTM表单(LOTUS开发公司，剑桥，马萨诸塞州)。动力学常数的分析是通过执行标准的兰唯沃·布克分析法进行的，该法将实验初始部分(通常是第一分钟)的数据拟合成线性复原曲线而得出v0值。用v0和s0数据按标准倒数法绘图得出KM和kcat值。I.BPN’变异体举例

    本发明的对表面结合的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力的枯草溶菌素BPN’变异体示例于如下的表2-25。在描述特定突变时，野生型的原始氨基酸列在第一，位点号列在第二，取代氨基酸在第三。

                                 表2

                        第一环状区——单突变变异体

                              Gln59Asn

                              Gln59Asp

                              Gln59Glu

                              Gln59Ser

                              Asp60Glu

                              Asn61Asp

                              Asn61Gln

                              Asn61Glu

                              Asn61Ser

                              Asn62Asp

                              Asn62Gln

                              Asn62Glu

                              Asn62Ser

                              Ser63Asp

                              Ser63Glu

                              Gly65Asn

                              Gly65Asp

                              Gly65Gln

                              Gly65Glu

                              Gly65Pro

                              Gly65Ser

                              Thr66Asn

                              Thr66Asp

                              Thr66Gln

                              Thr66Glu

                              Thr66Gly

                              Thr66Pro

                              Thr66Ser

                                  表3

                        第一环状区——双突变变异体

                            Gln59Ser + Asn62Glu

                            Asp60Glu + Asn61Ser

                            Asn61Glu + Asn62Ser

                            Gln59Ser + Gly65Gln

                            Asn61Gln + Gly65Asn

                            Asn61Ser + Asn62Asp

                            Gln59Glu + Asn61Gln

                            Asp60Glu + Gly65Gln

                            Gln59Asp + Gly65Pro

                            Asn61Asp + Gly65Asn

                            Gln59Ser + Asn62Asp

                            Gln59Asn + Gly65Gln

                            Asn62Asp + Thr66Gly

                            Gln59Asn + Asn62Glu

                            Asn61Ser + Ser63Glu

                            Gln59Ser + Asp60Glu

                            Asp60Glu + Thr66Gln

                            Asn61Glu + Thr66Gly

                            Asp60Glu + Asn62Gln

                            Asn62Gln + Gly65Pro

                            Asn61Ser + Thr66Ser

                            Asp60Glu + Gly65Pro

                            Ser63Glu + Gly65Pro

                            Asp60Glu + Thr66Ser

                            Gln59Ser + Asn61Glu

                            Asn62Asp + Gly65Gln

                            Asn61Gln + Ser63Asp

                            Gln59Asp + Gly65Asn

                            Ser63Asp + Thr66Pro

                            Ser63Glu + Thr66Asn

                            Asn62Glu + Thr66Asn

                            Asn61Asp + Gly65Ser

                            Gly65Pro + Thr66Ser

                            Gln59Ser + Asn62Ser

                            Asp60Glu + Gly65Ser

                            Ser63Asp + Gly65Ser

                            Asn61Gln + Ser63Glu

                            Asn61Asp + Asn62Ser

                            Gln59Glu + Gly65Pro

                            Gln59Ser + Asn61Asp

                            Gln59Asp + Asn62Ser

                            Gln59Asn + Gly65Ser

                            Ser63Glu + Thr66Ser

                            Asn61Ser + Ser63Asp

                            Asn62Ser + Gly65Pro

                表4

        第一环状区——三突变变异体

    Gln59Ser + Ser63Asp + Gly65Pro

    Asn62Gln + Gly65Ser + Thr66Asp

    Gln59Ser + Asp60Glu + Thr66Gln

    Gln59Asn + Ser63Glu + Thr66Pro

    Asn61Ser + Gly65Asn + Thr66Glu

    Ser63Glu + Gly65Ser + Thr66Asn

    Asn62Asp + Gly65Ser + Thr66Gly

    Gln59Ser + Asn62Asp + Thr66Pro

    Gln59Ser + Asp60Glu + Asn61Gln

    Asn61Gln + Ser63Asp + Gly65Ser

    Asn62Glu + Gly65Asn + Thr66Gln

    Asp60Glu + Gly65Asn + Thr66Ser

    Asn62Ser + Ser63Asp + Thr66Gln

    Gln59Asp + Asn62Gln + Gly65Pro

    Asn62Ser + Ser63Glu + Thr66Gly

    Asn61Asp + Asn62Ser + Gly65Asn

    Asp60Glu + Asn61Gln + Asn62Ser

    Asp60Glu + Asn61Gln + Gly65Ser

    Asp60Glu + Gly65Pro + Thr66Asn

    Gln59Ser + Asn61Glu + Asn62Asp

    Asn61Asp + Asn62Asp + Gly65Pro

    Asn61Glu + Asn62Glu + Thr66Gln

    Gln59Asp + Asp60Glu + Thr66Gln

    Gln59Asp + Asp60Glu + Thr66Pro

    Asn62Asp + Ser63Asp + Gly65Asn

    Asn62Glu + Ser63Glu + Gly65Asn

    Asn62Asp + Ser63Glu + Gly65Gln

    Gln59Ser + Asn62Asp + Ser63Glu

    Asn62Glu + Ser63Asp + Gly65Ser

    Asn61Asp + Asn62Asp + Ser63Glu

    Gln59Glu + Asp60Glu + Asn61Glu

    Asp60Glu + Asn62Glu + Ser63Asp

    Asp60Glu + Asn61Glu + Ser63Glu

    Gln59Ser + Asp60Glu + Asn62Glu

               表5

         第一环状区——四突变变异体

    Gln59Ser + Asp60Glu + Gly65Gln + Thr66Gln

    Gln59Ser + Asn62Ser + Ser63Asp + Gly65Gln

    Asp60Glu + Asn62Ser + Gly65Pro + Thr66Gln

    Asn62Gln + Ser63Glu + Gly65Pro + Thr66Gln

    Asn61Gln + Asn62Gln + Ser63Asp + Gly65Pro

    Gln59Asn + Asp60Glu + Asn61Gln + Gly65Asn

    Gln59Glu + Asn62Ser + Gly65Pro + Thr66Ser

    Gln59Asn + Asn61Asp + Asn62Asp + Thr66Asn

    Gln59Asp + Asp60Glu + Asn62Ser + Gly65Ser

    Asn61Gln + Asn62Asp + Ser63Glu + Thr66Gln

    Asp60Glu + Asn61Asp + Asn62Glu + Gly65Ser

    Asn61Asp + Asn62Glu + Ser63Glu + Thr66Ser

    Asn61Asp + Asn62Glu + Ser63Asp + Gly65Ser

    Gln59Glu + Asp60Glu + Asn61Asp + Gly65Ser

    Asp60Glu + Asn62Asp + Ser63Glu + Thr66Pro

    Asp60Glu + Asn62Glu + Ser63Glu + Thr66Asn

    Asp60Glu + Asn62Glu + Ser63Asp + Gly65Ser

    Asp60Glu + Asn61Asp + Ser63Glu + Thr66Asn

    Gln59Ser + Asp60Glu + Asn61Asp + Ser63Asp

    Asp60Glu + Asn61Asp + Ser63Asp + Gly65Pro

    Asp60Glu + Asn61Asp + Ser63Asp + Thr66Gly

    Asp60Glu + Asn61Asp + Ser63Glu + Gly65Asn

    Gln59Ser + Asp60Glu + Asn62Asp + Thr66Gly

    Asp60Glu + Asn62Asp + Gly65Ser + Thr66Pro

    Asp60Glu + Asn61Gln + Asn62Glu + Gly65Ser

    Gln59Ser + Asp60Glu + Asn62Asp + Gly65Gln

    Asp60Glu + Asn61Ser + Asn62Gln + Ser63Glu

    Asp60Glu + Asn61Ser + Ser63Asp + Thr66Pro

    Gln59Ser + Asp60Glu + Asn61Gln + Ser63Glu

    Asp60Glu + Ser63Glu + Gly65Ser + Thr66Asn

    Gln59Asn + Asp60Glu + Ser63Asp + Gly65Gln

    Asp60Glu + Ser63Glu + Gly65Pro + Thr66Ser

           表6    第二环状区——单突变变异体

            Val95Ala

            Val95Asn

            Val95Asp

            Val95Cys

            Val95Gln

            Val95Glu

            Val95Gly

            Val95His

            Val95Met

            Val95Pro

            Val95Ser

            Val95Thr

            Leu96Ala

            Leu96Asn

            Leu96Asp

            Leu96Cys

            Leu96Gln

            Leu96Glu

            Leu96Gly

            Leu96His

            Leu96Ile

    Leu96Met

    Leu96Pro

    Leu96Ser

    Leu96Thr

    Leu96Val

    Gly97Asn

    Gly97Asp

    Gly97Gln

    Gly97Glu

    Gly97Pro

    Gly97Ser

    Ala98Asn

    Ala98Asp

    Ala98Gln

    Ala98Glu

    Ala98Gly

    Ala98His

    Ala98Pro

    Ala98Ser

    Ala98Thr

    Asp99Glu

    Gly100Asn

    Gly100Asp

    Gly100Gln

    Gly100Glu

    Gly100Pro

    Gly100Ser

    Ser101Asp

    Ser101Glu

    Gly102Asn

    Gly102Asp

    Gly102Gln

    Gly102Glu

    Gly102Pro

    Gly102Ser

    Gln103Asn

    Gln103Asp

    Gln103Glu

    Gln103Ser

    Tyr104Ala

    Tyr104Asn

    Tyr104Asp

    Tyr104Cys

    Tyr104Gln

    Tyr104Glu

    Tyr104Gly

    Tyr104His

    Tyr104Ile

    Tyr104Leu

    Tyr104Met

    Tyr104Pro

    Tyr104Ser

    Tyr104Thr

    Tyr104Val

    Ser105Asp

    Ser105Glu

    Trp106Ala

    Trp106Asn

    Trp106Asp

    Trp106Cys

    Trp106Gln

    Trp106Glu

    Trp106Gly

    Trp106His

    Trp106Ile

    Trp106Leu

    Trp106Met

    Trp106Phe

    Trp106Pro

    Trp106Ser

    Trp106Thr

    Trp106Tyr

    Trp106Val

    Ile107Ala

    Ile107Asn

    Ile107Asp

    Ile107Cys

    Ile107Gln

    Ile107Glu

    Ile107Gly

    Ile107His

    Ile107Leu

    Ile107Met

    Ile107Pro

    Ile107Ser

    Ile107Thr

    Ile107Val

                表7

    第二环状区——双突变变异体

    Val 95Gln + Ser101Glu

    Gly 97Ser + Gly100Gln

    Ser105Glu + Trp106Gly

    Asp 99Glu + Gln103Asn

    Ala 98Gln + Trp106Thr

    Gly 97Asp + Ile107Thr

    Gly100Ser + Gly102Gln

    Leu 96Ser + Ser101Glu

    Asp 99Glu + Ile107Ala

    Leu 96Asn + Asp 99Glu

    Gly102Gln + Trp106Asp

    Tyr104Leu + Trp106Glu

    Tyr104Pro + Ile107Asp

    Gly 97Ser + Ser101Asp

    Gly100Pro + Ser101Glu

    Val 95Asn + Ala 98Asp

    Val 95Met + Ilel07Gly

    Asp 99Glu + Trp106Cys

    Gly100Asn + Trp106Thr

    Gln103Ser + Trp106Pro

    Gly102Asp + Gln103Ser

    Gly102Ser + Trp106Gln

    Ser101Asp + Gly102Pro

    Leu 96Cys + Trp106Asp

    Asp 99Glu + Gly102Ser

    Gly102Asp + Trp106Val

    Gly 97Ser + Trp106Phe

    Gln103Asp + Tyr104Thr

    Ala 98His + Gly100Gln

    Ser105Glu + Trp106Leu

    Leu 96His + Tyr104Thr

    Gly 97Pro + Ser101Glu

    Val 95Thr + Trp106Ile

    Gly100Asp + Tyrl04Ile

    Val 95Pro + Gln103Asn

    Gln103Asn + Trp106Ile

    Ala 98His + Gly102Pro

    Trp106Asn + Ile107His

    Val 95Gln + Leu 96Asp

    Gly 97Asp + Ala 98Gln

    Gly100Ser + Ser101Glu

    Val 95Asp + Tyr104Gly

    Tyr104Ala + Ser105Asp

    Gly100Pro + Ser105Glu

    Leu 96Cys + Tyr104Leu

    Val 95Gly + Gly100Ser

    Gly102Gln + Tyr104Ser

    Ala 98Gly + Trp106Phe

    Gly100Asp + Trp106Phe

    Val 95Glu + Ala 98Gln

    Ser101Glu + Tyr104Asn

    Leu 96Val + Ser101Asp

    Gly102Glu + Gln103Asn

    Gly102Glu + Trp106Gly

    Ala 98Gln + Gly100Asp

    Gly100Gln + Gln103Ser

    Gly 97Glu + Tyr104Leu

    Ser101Asp + Gly102Ser

    Ala 98His + Ser101Asp

    Gly 97Asp + Gln103Asn

              表8

    第二环状区——三突变变异体

    Val 95Gln + Leu 96Thr + Ser101Glu

    Ala 98His + Gln103Glu + Trp106Cys

    Ala 98Gln + Ser101Glu + Tyr104Mer

    Ser101Asp + Gln103Ser + Ile107Cys

    Ala 98Pro + Asp 99Glu + Gly102Pro

    Val 95Pro + Gly 97Glu + Gly100Gln

    Ser101Glu + Gly102Pro + Ile107His

    Leu 96Pro + Gly100Pro + Gly102Asn

    Gly100Glu + Gly102Asn + Trp106Tyr

    Ala 98Asn + Gln103Glu + Ile107Ser

    Gly 97Pro + Gly100Asp + Trp106Met

    Gln103Asn + Tyr104Leu + Ser105Asp

    Gly 97Pro + Ala 98Gln + Tyr104Cys

    Ala 98Gly + Gly100Glu + Gln103Ser

    Leu 96Ile + Gly 97Pro + Ser105Asp

    Ala 98Pro + Gly100Pro + Ile107Ala

    Val 95Pro + Gln103Asp + Ile107Met

    Val 95Gln + Ser101Glu + Trp106Phe

    Leu 96Val + Ser101Glu + Ile107Pro

    Leu 96Gly + Gly 97Glu + Trp106Thr

    Gly 97Asp + Tyr104Ser + Trp106His

    Gly 97Ser + Gly100Pro + Tyr104Cys

    Gln103Ser + Ser105Asp + Ile107His

    Ala 98Glu + Tyr104Cys + Trp106Phe

    Val 95Gln + Gly100Pro + Gly102Ser

    Val 95Ala + Gly102Asp + Tyr104Ser

    Val 95Ala + Leu 96Met + Ser105Asp

    Gly102Gln + Trp106Leu + Ile107Gly

    Leu 96Asn + Gly 97Glu + Ile107Pro

    Gly100Pro + Gly102Gln + Gln103Glu

    Gly 97Asp + Ala 98Asn + Trp106Leu

    Ala 98Gln + Gly100Pro + Trp106His

    Leu 96Thr + Gly100Asn + Ser105Glu

    Val 95Ser + Leu 96Asn + Gly 97Pro

    Gly100Gln + Ser105Glu + Trp106Gln

    Gly 97Glu + Tyr104Thr + Trp106Val

    Leu 96Ala + Ala 98Gln + Gly100Glu

    Val 95His + Gly 97Gln + Ser101Glu

    Val 95Pro + Gly102Asn + Gln103Glu

    Gln103Asn + Trp106Ile + Ile107Ala

    Gly 97Ser + Ala 98Glu + Tyr104Gln

    Val 95Glu + Leu 96Ile + Ile107Gln

    Leu 96Gln + Ala 98Ser + Asp 99Glu

    Leu 96Pro + Ser101Glu + Gly102Pro

    Gly 97Asn + Ala 98Pro + Gly100Pro

       Gly 97Asn + Ala 98Glu + Gly100Asn

       Gly102Pro + Trp106Ala + Ile107Pro

       Gly100Ser + Gly102Glu + Trp106Cys

       Leu 96Thr + Gly102Glu + Ile107Val

       Leu 96Cys + Trp106Leu + Ile107Pro

       Leu 96Thr + Ser105Glu + Trp106Tyr

       Leu 96Ala + Gly100Asp + Ser101Asp

       Gly 97Asn + Ser101Glu + Gly102Asp

       Val 95Gln + Ser101Asp + Gly102Asp

       Asp 99Glu + Gly100Asp + Trp106Phe

       Tyr104Glu + Ser105Asp + Ile107Asp

       Leu 96Glu + Ser101Glu + Trp106Val

       Tyr104Met + Ser105Asp + Ile107Asp

       Gly 97Asp + Gly100Asp + Trp106Pro

       Val 95Ala + Gly 97Asp + Asp 99Glu

                    表9

        第二环状区——四突变变异体

    Leu 96Gln + Gly 97Ser + Ser101Glu + Trp106Val

    Val 95Ala + Ala 98Gln + Gly100Asn + Gln103Asp

    Val 95Gln + Tyr104Ile + Trp106Gly + Ile107Pro

    Val 95Met + Leu 96Gly + Gly100Pro + Trp106Gly

    Ala 98Gln + Gly100Pro + Tyr104Thr + Trp106His

    Gly 97Pro + Ala 98His + Gly100Pro + Ile107Asp

    Ala 98Pro + Gly100Glu + Trp106Ser + Ile107Met

    Leu 96Gln + Gly 97Ser + Ser105Asp + Ile107Val

    Ala 98Gly + Ser101Asp + Trpl06Ala + Ile107Gln

    Val 95Ser + Gly 97Ser + Asp 99Glu + Gln103Ser

    Leu 96Thr + Gly 97Ser + Asp 99Glu + Tyr104Asn

    Val 95Thr + Leu 96Gln + Ala 98Pro + Ser105Glu

    Val 95Gly + Gly 97Ser + Tyr104Asn + Trp106Glu

    Leu 96Gln + Gly 97Ser + Tyr104Thr + Ile107Glu

    Val 95Ser + Leu 96Pro + Gly100Gln + Ser101Asp

    Leu 96Met + Gly100Ser + Ser101Asp + Trp106Asn

    Leu 96Ile + Ala 98Ser + Gly100Pro + Gly102Glu

    Val 95Asn + Ala 98Gly + Gln103Ser + Tyr104Val

    Gly 97Asn + Asp 99Glu + Gly102Asn + Trp106His

    Gly 97Ser + Gly102Asp + Gln103Asp + Ile107His

    Val 95Pro + Gly100Glu + Ser101Glu + Tyr104Gly

    Ala 98Pro + Gly100Asp + Ser101Asp + Ile107Cys

    Leu 96Gly + Ser101Asp + Gly102Asp + Ile107Gly

    Val 95His + Tyr104Asp + Ser105Asp + Trp106Ala

    Gly102Pro + Ser105Asp + Trp106Asp + Ile107Thr

    Leu 96Glu + Ala 98Gln + Gly102Asp + Tyr104Pro

    Ala 98Thr + Asp 99Glu + Gly100Glu + Ser101Glu

    Gly 97Ser + Ala 98Glu + Asp 99Glu + Gly100Glu

    Leu 96Asp + Gly 97Glu + Gly100Glu + Ile107Asn

    Leu 96Asn + Gly100Asp + Ser101Asp + Gly102Glu

    Val 95Gly + Ser101Glu + Gly102Asp + Gln103Asp

    Val 95His + Leu 96Glu + Gly100Gln + Ser101Glu

    Leu 96Glu + Gly100Gln + Ser101Asp + Gly102Ser

    Gly 97Asp + Gly100Asp + Gly102Pro + Ile107Gly

    Gly 97Glu + Asp 99Glu + Gly100Pro + Tyr104Ser

    Leu 96Ile + Gly 97Gln + Gln103Glu + Ser105Glu

    Gln103Asp + Ser105Asp + Trp106Asn + Ile107His

    Val 95Pro + Ala 98Pro + Gln103Glu + Ser105Asp

    Val 95His + Asp 99Glu + Ser101Glu + Gly102ProLeu 96Asn + Asp 99Glu + Gly100Asn + Ser101Glu

    Ala 98Asp + Asp 99Glu + Ser101Asp + Ile107Pro

    Leu 96Thr + Gly 97Glu + Gly100Glu + Gly102Asp

    Val 95Glu + Gly102Asp + Tyr104Ser + Ile107Glu

    Leu 96Gly + Gly102Asp + Gln103Asp + Ser105Glu

    Gly102Glu + Gln103Glu + Ser105Glu + Trp106Cys

    Asp 99Glu + Ser101Glu + Gly102Glu + Gln103Asn

    Asp 99Glu + Ser101Glu + Gly102Glu + Trp106Gly

    Gly102Glu + Gln103Asn + Tyr104Asp + Ile107Thr

    Val 95His + Leu 96Val + Gln103Glu + Ile107Glu

    Gly 97Ser + Gly102Ser + Gln103Glu + Ile107Glu

    Val 95Glu + Leu 96Asp + Gln103Asp + Ile107Asn

    Val 95Thr + Gly102Glu + Trp106Tyr + Ile107Asp

    Val 95Glu + Gly 97Glu + Ala 98Gly + Gly100Asp

    Leu 96Ala + Gly 97Pro + Ala 98Asp + Ser101Asp

    Val 95Asp + Leu 96Asp + Tyr104Glu + Ile107Ser

    Val 95Pro + Gly102Glu + Tyr104Pro + Ser105Asp

    Leu 96Asn + Gly102Asp + Gln103Asn + Ser105Glu

    Leu 96Asn + Gly102Asp + Tyr104Ala + Ser105Glu

    Leu 96Ser + Gly 97Gln + Gly102Glu + Ser105Asp

    Leu 96Thr + Asp 99Glu + Gly102Asp + Ile107Gly

                    表10

         第三环状区——单突变变异体

                  Leu126Ala

                  Leu126Asn

                  Leu126Asp

                  Leu126Cys

                  Leu126Gln

                  Leu126Glu

                  Leu126Gly

                  Leu126His

                  Leu126Ile

                  Leu126Met

                  Leu126Pro

                  Leu126Ser

                  Leu126Thr

                  Leu126Val

                  Gly127Asn

                  Gly127Asp

                  Gly127Gln

     Gly127Glu

     Gly127Pro

     Gly127Ser

     Gly128Asn

     Gly128Asp

     Gly128Gln

     Gly128Glu

     Gly128Pro

     Gly128Ser

     Pro129Asn

     Pro129Asp

     Pro129Gln

     Pro129Glu

     Pro129Gly

     Pro129Ser

     Serl30Asp

     Ser130Glu

     Gly131Asn

     Gly131Asp

     Gly131Gln

     Gly131Glu

     Gly131Pro

     Gly131Ser

     Ser132Asp

     Ser132Glu

     Ala133Asn

     Ala133Asp

     Ala133Gln

     Ala133Glu

     Ala133Gly

     Ala133His

     Ala133Pro

     Ala133Ser

     Ala133Thr

        表11第三环状区——双突变变异体

    Leu126Gln + Ser130GluGly131Gln + Ala133Asn

    Pro129Asp + Gly131Gln

    Gly128Ser + Ser130Glu

    Leu126Pro + Ala133Gly

    Gly127Asp + Ala133Gly

    Leu126Asp + Pro129Gln

    Gly131Asn + Ala133Gln

    Gly127Pro + Gly131Glu

    Gly128Asn + Gly131Asp

    Pro129Gln + Ser130Glu

    Gly128Pro + Ser130Asp

    Gly128Gln + Pro129Ser

    Gly128Asn + Pro129Gly

    Leu126Val + Ser130Asp

    Leu126Val + Pro129Ser

    Leu126Cys + Pro129Glu

    Gly127Asp + Ala133Thr

    Gly128Pro + Pro129Glu

    Gly127Ser + Gly131Asp

    Leu126His + Pro129Asp

    Gly131Pro + Ala133Glu

    Gly127Ser + Gly128Ser

    Pro129Asn + Gly131Glu

    Leu126Val + Pro129Asp

    Pro129Gly + Ala133Asp

    Leu126Val + Ser130Glu

    Pro129Glu + Ala133Pro

    Pro129Gly + Ser130Asp

    Leu126His + Gly128Glu

    Gly128Asn + Ser132Glu

    Gly127Pro + Ser132Asp

    Gly127Gln + Pro129Gln

    Gly128Pro + Pro129Asp

    Gly128Asn + Ser130Glu

    Leu126Cys + Pro129Asn

    Pro129Asn + Ser132Glu

    Leu126Ser + Ser132Asp

    Gly128Glu + Gly131Ser

    Pro129Asn + Ser130Asp

    Leu126Ser + Ser132Glu

    Pro129Gln + Gly131Pro

    Gly127Asp + Gly128Gln

    Gly128Gln + Pro129Glu

    Gly127Pro + Pro129Gly

    Pro129Gln + Ala133Gln

    Leu126Val + Gly128Asp

    Gly128Ser + Ser132Glu

    Leu126Asn + Pro129Gly

    Leu126Ile + Ala133Gly

    Gly128Ser + Gly131Gln

    Gly127Ser + Ser130Asp

    Leu126Cys + Ser132Asp

    Gly127Pro + Ser130Glu

    Leu126His + Ala133Asp

    Gly131Ser + Ala133Glu

    Gly131Pro + Ala133Gln

    Gly131Asp + Ala133Ser

    Leu126Asp + Ala133Asn

    Leu126Glu + Pro129Gln

              表12

    第三环状区——三突变变异体

    Leu126His + Pro129Glu + Ala133Asn

    Leu126Asp + Gly128Ser + Gly131Gln

    Pro129Asn + Gly131Ser + Ser132Glu

    Gly128Pro + Pro129Asn + Ser130Glu

    Gly128Gln + Ser130Glu + Ala133Ser

    Gly131Gln + Ser132Glu + Ala133Gln

    Gly128Asp + Gly131Ser + Ala133Asn

    Gly131Ser + Ser132Asp + Ala133Pro

    Pro129Ser + Glyl31Gln + Ala133Glu

    Gly128Asn + Ser130Glu + Gly131Gln

    Leu126Gly + Gly127Gln + Gly131Pro

    Leu126Pro + Gly127Glu + Gly128Pro

    Leu126Ser + Pro129Ser + Ser132Asp

    Gly128Ser + Ser132Glu + Ala133Asn

    Leu126Val + Ser132Glu + Ala133Gln

    Pro129Gly + Ser130Glu + Gly131Pro

    Leu126Thr + Gly127Pro + Ala133Asn

    Leu126His + Ser130Asp + Ala133Pro

    Leu126Cys + Gly127Ser + Pro129Ser

    Leu126Gly + Ser132Asp + Ala133Ser

    Gly128Gln + Pro129Gln + Gly131Asn

    Gly128Asp + Gly131Asn + Ala133His

    Leu126Cys + Ser130Glu + Ala133Gly

    Gly127Ser + Ser130Asp + Ala133Gly

    Leu126His + Pro129Asn + Ser130Asp

    Leu126Asn + Gly131Asp + Ala133Gln

    Leu126Met + Gly128Asn + Ser132Asp

    Leu126Glu + Gly127Gln + Ala133His

    Leu126Met + Ser132Asp + Ala133His

    Ser130Glu + Gly131Gln + Ala133Gln

    Gly127Pro + Gly128Ser + Ala133Ser

    Leu126Ala + Pro129Gly + Ser132Glu

    Gly131Asn + Ser132Asp + Ala133Asn

    Leu126Val + Gly131Asp + Ala133Ser

    Leu126Ser + Gly127Asn + Ala133Gln

    Pro129Gln + Ser130Glu + Ala133His

    Leu126Met + Gly127Ser + Ser130Asp

    Leu126Cys + Pro129Asn + Gly131Asp

    Pro129Ser + Ser130Asp + Ala133Asn

    Leu126Ser + Pro129Gly + Ser132Glu

    Gly127Ser + Pro129Gln + Ser132Asp

    Gly127Pro + Gly128Asn + Pro129Gln

    Leu126His + Ser132Asp + Ala133Asn

    Gly128Pro + Pro129Glu + Ala133Thr

    Pro129Ser + Glyl31Glu + Ala133Pro

    Leu126His + Gly128Pro + Pro129Gln

     Leu126Met + Gly127Asp + Gly128Asp

     Gly128Pro + Gly131Glu + Ser132Asp

     Gly131Asp + Ser132Glu + Ala133Pro

     Gly128Glu + Pro129Glu + Ala133Asn

     Pro129Ser + Ser132Glu + Ala133Glu

     Leu126Asn + Ser130Glu + Gly131Asp

     Pro129Asn + Ser130Glu + Gly131Asp

     Leu126His + Ser130Glu + Gly131Glu

     Pro129Glu + Ser130Asp + Gly131Asn

     Gly127Ser + Pro129Asp + Ser130Asp

     Ser130Asp + Gly131Asp + Ser132Asp

     Gly128Asp + Ser130Glu + Gly131Asn

     Leu126Met + Gly128Glu + Ser130Asp

     Gly128Asp + Pro129Asn + Ser130Glu

                   表13

        第三环状区——四突变变异体

    Leu126Ser + Pro129Asn + Ser130Asp + Ala133His

    Leu126Met + Pro129Ser + Ser132Glu + Ala133Asn

    Gly127Ser + Gly131Gln + Ser132Glu + Ala133Gln

    Leu126Asn + Gly127Pro + Gly128Glu + Pro129Gly

    Leu126Asn + Pro129Gly + Gly131Asp + Ala133Gly

    Leu126Gly + Pro129Gly + Ser132Glu + Ala133Pro

    Leu126Gly + Gly127Asp + Pro129Gly + Gly131Pro

    Gly127Asn + Pro129Gln + Gly131Asp + Ala133Gly

    Leu126Pro + Gly127Ser + Gly128Gln + Ser130Glu

    Leu126Ala + Gly127Gln + Pro129Asn + Ser130Glu

    Leu126Asn + Gly127Ser + Ser130Glu + Ala133Thr

    Gly128Gln + Pro129Gln + Ser130Asp + Gly131Ser

    Leu126His + Gly128Ser + Gly131Ser + Ser132Asp

    Leu126Gln + Pro129Ser + Ser130Asp + Ala133His

    Leu126Val + Gly128Pro + Pro129Asn + Ala133Asp

    Leu126Val + Pro129Gly + Ser130Glu + Ala133Thr

    Leu126Thr + Gly127Pro + Ser132Glu + Ala133Thr

    Gly128Asp + Pro129Gly + Gly131Pro + Ala133Ser

    Leu126Asn + Gly128Glu + Pro129Gln + Gly131Pro

    Leu126Pro + Gly127Pro + Pro129Ser + Ser130Asp

    Gly127Pro + Gly128Gln + Gly131Glu + Ser132Glu

    Leu126Ile + Gly127Gln + Gly131Asp + Ser132Glu

    Leu126Val + Gly131Asp + Ser132Asp + Ala133Pro

    Gly128Asp + Pro129Asp + Gly131Asn + Ala133Pro

    Pro129Asn + Gly131Ser + Ser132Asp + Ala133Asp

    Leu126Gln + Gly131Pro + Ser132Asp + Ala133Asp

    Gly127Pro + Ser130Glu + Gly131Glu + Ala133His

    Leu126Gln + Pro129Gln + Ser130Asp + Gly131Glu

    Gly127Ser + Ser130Asp + Gly131Glu + Ala133Gln

    Leu126Ser + Gly127Pro + Pro129Glu + Ser130Glu

    Ser130Glu + Gly131Glu + Ser132Glu + Ala133Ser

    Gly127Gln + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132Asp

    Gly128Gln + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132Asp

    Gly127Asn + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132Asp

    Gly127Ser + Pro129Asp + Ser130Glu + Gly131Glu

    Gly127Asn + Pro129Asp + Ser130Asp + Gly131Asp

    Gly128Asn + Pro129Glu + Ser130Glu + Gly131Asp

    Leu126Ser + Gly128Asp + Ser130Glu + Ala133Pro

    Gly127Asn + Gly128Asp + Ser130Glu + Ala133Pro

    Gly128Glu + Ser130Glu + Gly131Pro + Ala133His

    Leu126Val + Ser130Asp + Ser132Asp + Ala133Asn

    Pro129Ser + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133Gly

    Leu126His + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133His

    Leu126Ala + Ser130Glu + Ser132Glu + Ala133Asn

    Gly127Pro + Gly128Gln + Ser130Asp + Ser132Glu

    Leu126Ser + Ser130Asp + Gly131Pro + Ser132Asp

    Ser130Glu + Gly131Pro + Ser132Glu + Ala133Ser

    Gly128Gln + Ser130Asp + Gly131Ser + Ser132Glu

    Leu126Ala + Pro129Asn + Ser130Asp + Ser132Glu

    Gly127Gln + Gly128Pro + Pro129Glu + Gly131Asp

    Gly128Gln + Pro129Asp + Gly131Glu + Ala133Asn

    Leu126Asn + Pro129Glu + Gly131Asp + Ala133Ser

    Leu126Met + Pro129Glu + Gly131Glu + Ala133Thr

    Gly127Asp + Gly128Gln + Pro129Asp + Ala133Gln

    Leu126His + Pro129Gly + Gly131Glu + Ala133Glu

    Gly128Glu + Pro129Gly + Gly131Asp + Ala133Asn

    Pro129Gly + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133Glu

    Leu126Gln + Ser130Glu + Ser132Glu + Ala133Glu

    Leu126Gly + Pro129Asp + Ser130Glu + Ser132Glu

    Pro129Asp + Ser130Glu + Gly131Ser + Ser132Asp

                 表14

     第四环状区——单突变变异体

             Gly154Asn

             Gly154Asp

             Gly154Gln

             Gly154Glu

             Gly154Pro

             Gly154Ser

             Asn155Asp

             Asn155Gln

             Asn155Glu

             Asn155Ser

             Glu156Asp

             Gly157Asn

             Gly157Asp

             Gly157Gln

             Gly157Glu

             Gly157Pro

             Gly157Ser

             Thr158Asn

    Thr158Asp

    Thr158Gln

    Thr158Glu

    Thr158Gly

    Thr158Pro

    Thr158Ser

    Ser159Asp

    Ser159Glu

    Gly160Asn

    Gly160Asp

    Gly160Gln

    Gly160Glu

    Gly160Pro

    Gly160Ser

    Ser161Asp

    Ser161Glu

    Ser162Asp

    Ser162Glu

    Ser163Asp

    Ser163Glu

    Thr164Asn

    Thr164Asp

    Thr164Gln

    Thr164Glu

    Thr164Gly

    Thr164Pro

    Thr164Ser

    Val165Ala

    Val165Asn

    Val165Asp

    Val165Cys

    Val165Gln

    Val165Glu

    Val165Gly

    Val165His

    Val165Met

    Val165Pro

    Val165Ser

    Val165Thr

    Gly166Asn

    G1y166Asp

    Gly166Gln

    Gly166Glu

    Gly166Pro

    Gly166Ser

    Tyr167Ala

    Tyr167Asn

    Tyr167Asp

    Tyr167Cys

    Tyr167Gln

     Tyr167Glu

     Tyr167Gly

     Tyr167His

     Tyr167Ile

     Tyr167Leu

     Tyr167Met

     Tyr167Pro

     Tyr167Ser

     Tyr167Thr

     Tyr167Val

        表15第四环状区——双突变变异体

    Asn155Ser + Glu156Asp

    Gly154Ser + Tyr167Gln

    Gly154Glu + Va1165Ala

    Asn155Glu + Thr164Pro

    Gly157Pro + Ser159Asp

    Gly154Ser + Ser161Asp

    Ser161Glu + Val165Pro

    Gly154Gln + Ser161Glu

    Asn155Asp + Thr158Pro

    Thr164Asn + Gly166Gln

    Asn155Glu + Tyr167His

    Glu156Asp + Thr158Gly

    Gly154Pro + Gly157Glu

    Asn155Ser + Tyr167Asp

    Thr158Pro + Gly166Asp

    Thr164Gln + Tyr167Glu

    Gly157Gln + Thr158Glu

    Thr158Asn + Ser162Asp

    Gly154Asn + Tyr167Glu

    Gly157Gln + Ser161Asp

    Thr164Asp + Tyr167Ala

    Gly160Asp + Val165His

    Gly154Glu + Gly157Ser

    Glu156Asp + Tyr167Ile

    Asn155Ser + Thr158Asp

    Gly157Gln + Thr164Pro

    Thr164Ser + Tyr167Ile

    Ser159Glu + Tyr167Thr

    Thr164Glu + Val165Gln

    Thr158Gly + Gly160Ser

    Ser161Asp + Gly166Pro

    Gly154Glu + Gly166Ser

    Gly160Asp + Val165Asn

    Ser162Glu + Val165Gln

    Gly157Asn + Ser159Glu

    Ser161Asp + Val165Asn

    Asn155Asp + Val165Pro

    Glu156Asp + Gly166Ser

    Gly154Pro + Ser159Asp

    Gly154Ser + Tyr167Cys

    Gly160Pro + Thr164Asp

    Ser161Glu + Val165Gly

    Ser162Glu + Tyr167Asn

    Gly154Asn + Gly166Glu

    Ser161Glu + Tyr167Ala

    Gly160Gln + Val165Pro

    Gly154Glu + Val165Gly

    Gly160Ser + Ser163Asp

    Gly157Glu + Thr158Asn

    Gly160Asp + Val165Pro

    Glyl60Asn + Ser162Asp

    Thr164Gln + Gly166Gln

    Asn155Ser + Thr158Gln

    Ser161Glu + Tyr167Gly

    Ser162Asp + Gly166Ser

    Gly154Glu + Thr158Gly

    Gly1545er + Thr158Ser

    Gly157Asp + Gly160Pro

    Ser163Glu + Val165His

    Gly154Pro + Gly166Asp

        表16第四环状区——三突变变异体

    Gly154Gln + Asn155Ser + Glu156Asp

    Gly154Ser + Gly160Asp + Tyr167Gln

    Asn155Glu + Gly157Ser + Thr164Pro

    Gly157Asn + Ser159Asp + Gly160Ser

    Glu156Asp + Gly160Ser + Val165Thr

    Gly160Pro + Ser162Glu + Thr164Asn

    Gly154Ser + Glu156Asp + Thr158Gln

    Gly160Asn + Ser162Glu + Gly166Ser

    Gly160Ser + Val165Gly + Gly166Gln

    Thr158Gln + Ser162Asp + Tyr167Val

    Gly157Gln + Ser162Glu + Tyr167Leu

    Ser162Glu + Thr164Gln + Val165Cys

    Gly157Ser + Val165Met + Gly166Glu

    Gly154Ser + Glu156Asp + Gly166Pro

    Thr158Ser + Ser161Asp + Thr164Gly

    Glu156Asp + Gly157Ser + Gly160Asn

    Gly154Gln + Asn155Asp + Gly166Ser

    Ser163Glu + Val165Thr + Tyr167Pro

    Gly157Asp + Thr158Gln + Val165Ser

    Gly157Asn + Ser159Asp + Gly166Ser

    Gly160Gln + Ser163Glu + Val165Met

    Gly154Asn + Asn155Asp + Gly157Pro

     Glu156Asp + Thr158Asn + Val165Cys

     Thr158Asn + Gly160Glu + Thr164Pro

     Gly154Asn + Gly157Pro + Thr158Gln

     Asn155Glu + Gly157Ser + Thr158Gln

     Thr158Glu + Gly160Ser + Tyr167Val

     Asn155Gln + Glu156Asp + Thr164Ser

     Asn155Ser + Ser162Glu + Val165Met

     Gly154Gln + Thr158Gly + Gly166Asp

     Ser163Glu + Val165Ala + Gly166Asn

     Asn155Ser + Gly160Glu + Thr164Gln

     Gly157Asp + Thr164Ser + Gly166Pro

     Ser163Asp + Thr164Glu + Tyr167Met

     Ser163Asp + Thr164Asp + Val165Met

     Glu156Asp + Gly157Asp + Thr164Gln

     Gly157Gln + Gly166Asp + Tyr167Glu

     Ser161Asp + Ser162Glu + Tyr167His

     Gly154Asn + Ser159Glu + Ser162Glu

     Ser159Asp + Ser162Glu + Val165Cys

     Ser159Glu + Gly160Ser + Ser161Asp

     Thr158Asp + Ser161Glu + Ser162Glu

     Ser161Glu + Ser163Asp + Thr164Ser

     Ser161Glu + Ser163Glu + Val165His

     Asn155Glu + Glu156Asp + Thr158Glu

     Gly157Glu + Thr164Glu + Val165Gly

     Ser161Asp + Ser163Glu + Thr164Glu

     Gly157Glu + Thr158Gln + Ser159Glu

     Gly157Glu + Ser159Asp + Tyr167Cys

     Gly157Asp + Ser163Glu + Thr164Glu

     Ser159Glu + Ser163Asp + Thr164Gly

     Ser159Asp + Ser163Asp + Thr164Asn

     Thr158Asp + Ser161Asp + Ser163Glu

     Thr158Glu + Ser162Asp + Thr164Asn

     Thr158Glu + Ser162Asp + Val165Thr

     Gly157Ser + Thr158Asp + Ser162Glu

     Thr158Asp + Ser163Glu + Thr164Asn

     Thr158Glu + Ser163Asp + Tyr167Gly

     Glu156Asp + Gly166Glu + Tyr167Ile

     Asn155Glu + Gly157Pro + Thr164Asp

                  表17

        第四环状区——四突变变异体

    Ser159Glu + Thr164Ser + Val165Thr + Gly166Pro

    Asn155Ser + Gly157Pro + Val165Ser + Gly166Glu

    Gly157Asn + Val165Pro + Gly166Glu + Tyr167Val

    Thr158Ser + Glyl60Gln + Val165His + Gly166Asp

    Gly154Ser + Gly157Pro + Ser163Glu + Thr164Ser

    Gly157Gln + Gly160Asp + Thr164Ser + Val165Asn

    Gly157Asn + Gly160Asp + Val165Cys + Tyr167Leu

    Glu156Asp + Thr158Ser + Val165Asn + Gly166Pro

    Glu156Asp + Thr158Pro + Thr164Gln + Val165Pro

    Asn155Gln + Glu156Asp + Thr164Gly + Val165Thr

    Thr158Gly + Gly160Ser + Ser163Asp + Tyr167Asn

    Ser159Asp + Gly160Gln + Gly166Ser + Tyr167Pro

    Gly154Pro + Thr164Gln + Val165Gly + Gly166Asp

    Gly154Asn + Gly160Pro + Ser161Glu + Gly166Pro

    Asn155Ser + Gly157Asn + Thr164Gln + Tyr167Asp

    Gly157Asn + Thr158Asn + Ser163Glu + Val165Gln

    Gly160Glu + Ser161Asp + Val165Met + Tyr167Pro

    Asn155Glu + Glu156Asp + Thr158Gln + Gly166Pro

    Asn155Asp + Glu156Asp + Val165Asn + Gly166Asn

    Asn155Asp + Glu156Asp + Gly160Ser + Thr164Asn

    Gly154Ser + Thr158Gln + Ser162Glu + Ser163Glu

    Gly154Asn + Asn155Gln + Ser163Glu + Thr164Glu

    Glu156Asp + Gly157Glu + Gly160Gln + Thr164Gly

    Glu156Asp + Gly157Glu + Thr1585er + Val165Cys

    Gly154Pro + Gly157Pro + Thr158Asp + Ser159Asp

    Gly154Ser + Gly157Asn + Thr158Glu + Ser159Glu

    Gly157Pro + Gly160Pro + Gly166Asp + Tyr167Glu

    Gly154Asn + Ser161Glu + Ser162Glu + Tyr167Asn

    Gly154Asp + Asn155Asp + Thr164Gln + Gly166Asn

    Gly154Gln + Ser159Glu + Gly160Glu + Ser161Asp

    Thr158Ser + Ser159Asp + Gly160Asp + Ser161Asp

    Asn155Ser + Glu156Asp + Gly157Asp + Thr158Glu

    Gly157Asn + Ser159Asp + Ser161Glu + Ser162Glu

    Gly154Asn + Glu156Asp + Gly157Glu + Thr164Glu

    Gly157Gln + Gly160Asp + Ser162Asp + Val165Thr

    Gly160Glu + Ser162Asp + Thr164Asn + Gly166Gln

    Gly154Asp + Asn155Ser + Glu156Asp + Thr164Ser

    Gly154Asp + Glu156Asp + Gly157Glu + Thr158Gly

    Gly154Gln + Gly157Pro + Ser159Asp + Ser161Asp

    Ser159Glu + Ser161Asp + Gly166Ser + Tyr167His

    Ser159Asp + Ser161Asp + Gly166Pro + Tyr167Ser

    Glu156Asp + Thr158Glu + Val165Ala + Gly166Gln

    Glu156Asp + Thr158Asp + Gly166Pro + Tyr167Ala

    Asn155Gln + Thr158Asp + Thr164Asp + Tyr167Val

    Ser163Glu + Thr164Asp + Val165Met + Gly166Glu

    Ser161Asp + Ser163Asp + Val165Thr + Tyr167His

    Ser161Asp + Ser163Glu + Thr164Gln + Gly166Asn

    Gly157Pro + Ser159Glu + Ser161Asp + Ser163Glu

    Gly154Pro + Glu156Asp + Ser163Asp + Thr164Glu

    Asn155Asp + Glu156Asp + Thr158Asp + Thr164Asn

    Glu156Asp + Ser159Asp + Thr164Asp + Val165Ala

    Thr158Gln + Ser159Asp + Ser163Glu + Va1165Cys

    Gly154Gln + Ser159Asp + Ser163Asp + Gly166Pro

    Asn155Ser + Gly160Asp + Ser162Glu + Thr164Asp

    Gly154Gln + Gly160Asp + Ser162Glu + Thr164Glu

    Glu156Asp + Gly160Pro + Va1165Pro + Gly166Glu

    Gly160Glu + Ser163Asp + Thr164Gly + Tyr167Leu

    Gly160Glu + Ser163Glu + Thr164Pro + Gly166Gln

    Asn155Asp + Thr158Pro + Ser163Glu + Thr164Asp

    Asn155Ser + Glu156Asp + Ser163Asp + Gly166Glu

                 表18

     第五环状区——单突变变异体

             Ala187Asn

             Ala187Asp

             Ala187Gln

             Ala187Glu

             Ala187Gly

             Ala187His

             Ala187Pro

             Ala187Ser

             Ala187Thr

             Ser188Asp

             Ser188Glu

             Phe189Ala

             Phe189Asn

             Phe189Asp

             Phe189Cys

             Phe189Gln

             Phe189Glu

             Phe189Gly

             Phe189His

             Phe189Ile

             Phe189Leu

             Phe189Met

             Phe189Pro

             Phe189Ser

             Phe189Thr

             Phe189Tyr

             Phe189Val

             Ser190Asp

             Ser190Glu    

             Ser191Asp

             Ser191Glu

               表19

     第五环状区——双突变变异体

       Ala187Asp + Pne189Gln

       Ala187Ser + Ser188Asp

       Ser188Glu + Phe189Pro

       Ala187Asp + Phe189His

       Ala187Asn + Ser191Glu

       Ala187Gln + Ser191Asp

       Ala187Glu + Phe189Pro

       Ala187Pro + Phe189Asp

    Ser188Asp + Phe189Cys

    Phe189His + Ser191Asp

    Ser188Glu + Phe189Ala

    Ala187His + Ser188Asp

    Ala187Asn + Ser188Glu

    Ser188Glu + Phe189Gln

    Ala187Asp + Phe189Ser

    Ser188Asp + Phe189Val

    Ala187Gln + Ser188Glu

    Ala187Ser + Ser188Glu

    Ala187Pro + Ser191Asp

    Ser188Glu + Phe189Val

    Phe189Ser + Ser191Glu

    Ala187Gly + Ser191Glu

    Ala187Asn + Ser191Asp

    Ala187Thr + Ser191Asp

    Ala187His + Ser188Glu

    Ser188Glu + Phe189Gly

    Ala187Ser + Phe189Ile

    Ser188Glu + Phe189Met

    Phe189Asn + Ser191Asp

    Ala187Gln + Phe189Tyr

    Ala187Gln + Ser191Glu

    Ala187Ser + Phe189Ala

    Phe189Val + Ser191Asp

    Ser188Glu + Phe189Leu

    Ala187Pro + Ser188Glu

    Phe189Asn + Ser191Glu

    Phe189Ile + Ser191Asp

    Ala187Glu + Phe189Met

    Ala187His + Ser191Glu

    Ser188Asp + Phe189Tyr

    Ala187Gly + Phe189Val

    Ser188Asp + Phe189Gln

    Ala187Gly + Phe189Tyr

    Ala187Gln + Phe189Asp

    Phe189Tyr + Ser191Glu

    Ala187Ser + Ser191Asp

    Ala187Thr + Ser188Glu

    Ala187Asn + Ser188Asp

    Ala187Gly + Ser188Asp

    Ala187Gly + Phe189Cys

    Phe189Cys + Ser191Glu

    Ala187Asp + Phe189Gly

    Ser188Asp + Phe189Leu

    Ser188Asp + Phe189Gly

    Ala187Asn + Phe189Asp

    Ala187Pro + Ser191Glu

    Phe189Met + Ser191Asp

    Ala187Thr + Ser188Asp

     Phe189Ala + Ser191Glu

     Phe189Leu + Ser191Glu

              表20

    第五环状区——三突变变异体

    Ala187Pro + Phe189Cys + Ser191Glu

    Ala187Thr + Phe189Tyr + Ser191Glu

    Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189Ser

    Ala187Gln + Phe189Asn + Ser191Glu

    Ala187Gln + Ser188Asp + Phe189His

    Ala187Gln + Ser188Glu + Phe189His

    Ala187Gly + Ser188Asp + Phe189Met

    Ala187Gly + Ser188Asp + Phe189Cys

    Ala187Pro + Phe189His + Ser191Glu

    Ala187Pro + Phe189Gln + Ser191Glu

    Ala187Asn + Ser188Asp + Phe189Asn

    Ala187Gly + Ser188Glu + Phe189Ser

    Ala187Gln + Phe189Met + Ser191Asp

    Ala187Gly + Ser188Asp + Phe189Pro

    Ala187Thr + Phe189His + Ser191Asp

    Ala187Asn + Ser188Glu + Phe189Cys

    Ala187Gln + Phe189Val + Ser191Glu

    Ala187Pro + Phe189Met + Ser191Glu

    Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189His

    Ala187Ser + Phe189Gln + Ser191Asp

    Ala187Gln + Ser188Asp + Phe189Pro

    Ala187Gly + Ser188Asp + Phe189Gly

    Ala187His + Phe189Gln + Ser191Glu

    Ala187Thr + Ser188Glu + Phe189Ile

    Ala187Pro + Phe189Gly + Ser191Glu

    Ala187Thr + Phe189Met + Ser191Glu

    Ala187Gly + Phe189Thr + Ser191Glu

    Ala187Gln + Phe189Leu + Ser191Glu

    Ala187Thr + Phe189Thr + Ser191Asp

    Ala187Gln + Ser188Asp + Phe189Met

    Ala187Pro + Phe189Ser + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Val

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Ser

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Met

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Gln

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Cys

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Tyr

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Tyr

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Gly

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Leu

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Ser

    Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Gly

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Pro

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189His

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Thr

     Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Ile

     Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Asn

     Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189Glu

     Ala187Gly + Ser188Asp + Phe189Glu

     Ala187Gly + Ser188Glu + Phe189Asp

     Ala187Pro + Ser188Glu + Phe189Asp

     Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Glu

     Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Asp

     Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Asp

     Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Glu

     Ala187Gly + Phe189Glu + Ser191Asp

     Ala187Gly + Phe189Glu + Ser191Glu

     Ala187Thr + Phe189Glu + Ser191Glu

     Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191Glu

     Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191Asp

                  表21

         第五环状区——四突变变异体

    Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191Asp

    Ala187Pro + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191Glu

    Ala187His + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191Glu

    Ala187Gly + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser19lGlu

    Ala187His + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191Asp

    Ala187Thr + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser191Glu

    Ala187Asn + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191Glu

    Ala187Pro + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191Glu

    Ala187Pro + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser191Asp

    Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191Glu

    Ala187His + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191Asp

    Ala187Thr + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191Asp

    Ala187Asn + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191Glu

    Ala187Gln + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191Glu

    Ala187Gly + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191Glu

    Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Gly + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Met + Ser191Asp

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Leu + Ser191Asp

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Thr + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Leu + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Tyr + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Gln + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191Glu

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Gln + Ser191Glu

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Pro + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Ser + Serl91Glu

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191Asp

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Leu + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191Asp

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189His + Ser191Glu

    Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189His + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191Asp

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Gly + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Cys + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Asn + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Thr + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191Asp

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Ala + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191Glu

    Ala187Glu + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Asn + Ser191Asp

    Ala187Asp + Ser188Asp + Phe189Cys + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191Asp

    Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189Ser + Serl9lGlu

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Tyr + Ser191Glu

    Ala187Asp + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191Asp

    Ala187Gly + Ser188Glu + Phe189Thr + Ser191Asp

    Ala187His + Ser188Asp + Phe189Met + Ser191Glu

    Ala187Thr + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191Asp

    Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189Met + Ser191Asp

    Ala187Ser + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191Asp

    Ala187Thr + Ser188Asp + Phe189Tyr + Ser191Glu

    Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191Asp

    Ala187Asn + Ser188Glu + Phe189Gly + Ser191Asp

    Ala187Gln + Ser188Asp + Phe189Asn + Ser191Glu

    Ala187Asn + Ser188Asp + Phe189His + Ser191Glu

    Ala187Gly + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191Glu

    Ala187His + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191Asp

                    表22

              多环双突变变异体

            Leu 96Gly + Ser204Glu

            Gln 59Ser + Asn 62Ser

            Val 95Gln + Asn218Asp

            Tyr104Cys + Lys213Glu

            Gly127Gln + Ala216Pro

            Ser188Glu + Gly215Asn

            Gly 97Gln + Ile107Ala

            Gln206Asp + Tyr217Thr

            Asp 60Glu + Gln206Asn

            Thr158Asp + Gln206Ser

            Pro210Gln + Gly21SAsn

            Tyr104Glu + Ile107Leu

            Tyr167Pro + Gly211Glu

            Ile107Leu + Ala187Asp

            Gly 97Glu + Thr164Pro

            Thr 66Pro + Val203Cys

            Ala133Gly + Tyr217Ser

    Ser105Glu + Phe189Val

    Tyr167Asp + Ala187Thr

    Ser161Glu + Ala216Thr

    Ser 63Asp + Gln103Ser

    Leu 96Gln + Pro129Glu

    Ala 98Gly + Tyr214Glu

    Leu 96Asn + Asn212Ser

    Ser 63Asp + Phe189Leu

    Thr158Gln + Lys213Glu

    Leu126Gln + Gly160Asp

    Ser159Asp + Tyr217Gln

    Ser101Asp + Va1203Ala

    Gly100Asn + Gly215Glu

    Gln 59Asp + Gly131Gln

    Gly157Glu + Leu209Pro

    Trp106Pro + Tyr217Ile

    Ala216Ser + Gly219Asp

    Thr 66Gln + Leu126Asn

    Gly102Gln + Gly219Asp

    Asn212Ser + Lys213Asp

    Gln206Ser + Lys213Glu

    Tyr104Glu + Asn155Gln

    Val 95Asp + Leu126Ser

    Tyr104Asp + Gly166Gln

    Thr 66Pro + Ser204Glu

    Asn 61Glu + Phe189Pro

    Asp 60Glu + Tyr167Ala

    Pro129Gln + Gln206Asp

    Gly160Asp + Ala216Asn

    Ser161Glu + Gly166Asn

    Leu 96Pro + Gly100Asp

    Trp106Asn + Va1203Asn

    Ser101Asp + Gly127Ser

    Ala133Gln + Val203Asp

    Ser101Asp + Gly202Ser

    Ile107Ala + Gly160Asn

    Ala133Thr + Tyr214Ile

    Phe189Ser + Ser204Asp

    Gly 97Asp + Trp106Phe

    Gln 59Asn + Glu156Asp

    Pro201Ser + Lys213Glu

    Ser162Glu + Gly202Gln

    Gly 65Ser + Gln206Asp

    Lys213Asp + Ala216Pro

    Va1203Ala + Lys213Asp

    Ala216Thr + Tyr217Pro

    Gly131Asn + Asn218Glu

    Tyr104Glu + Gly131Pro

    Gly127Ser + Thr158Asp

    Trp106Gly + Ser132Asp

    Asn 62Ser + Ala187Ser

    Ser163Asp + Phe189Ser

    Pro201Gln + Gly215Glu

    Gly100Gln + Tyr217Thr

    Ser130Glu + Gly154Asn

    Asp 60Glu + Tyr214Thr

    Asn155Glu + Tyr217Gln

    Ala 98G1n + Gly102Asn

    Pro201Asn + Gly219Asp

    Thr 66Ser + Gly127Gln

    Leu126Glu + Ala216Thr

    Asn 61Ser + Asn155Glu

    Thr 66Ser + Gly157Asp

    Pro129Ser + Thr164Gln

    Ala216Asp + Tyr217Val

    Ser130Glu + Tyr217Leu

    Asn 62Asp + Tyr214Leu

    Val 95Ser + Phe189Val

    Gly100Pro + Ser159Asp

    Asn155Gln + Ser204Glu

    Pro129Asp + Val203Ser

    Ser101Glu + Thr158Asn

    Ala187Pro + Asn218Asp

    Val 95Gly + Serl61Asp

    Gly202Pro + Ala216Gln

    Gly 97Ser + Gly215Asp

    Tyr167Asp + Gln206Ser

    Thr 66Ser + Asn212Glu

    Ala216Thr + Tyr217Gln

    Ala200Asn + Tyr217Ala

    Asp 60Glu + Va1203Pro

    Val 95Thr + Tyr217Met

    Va1203Asn + Lys213Glu

    Gly102Asp + Va1203Gly

    Ser130Asp + Ala133Thr

    Tyr104Ala + Gly166Ser

    Leu 96Met + Tyr217Asp

    Ser101Asp + Gly102Pro

    Ser101Asp + Thr220Pro

    Val 95Asn + Ala216Pro

    Tyr104Asn + Pro129Asp

    Gly202Asn + Gln206Asp

    Gln 59G1u + Ile107Cys

    Thr 66Glu + Tyr104Pro

    Val 95Met + Asp 99Glu

    Ser204Glu + Gly211Pro

    Pro210Glu + Gly219Ser

    Leu126Pro + Ser204Glu

    Pro129Asp + Ala200His

    Ile107Gly + Gly215Pro

    Thr 66Glu + Gln206Asn

    Asn155Asp + Leu209His

    Gly211Asp + Tyr217Val

    Ala216Asp + Thr220Gln

    Thr158Gly + Ser204Asp

    Gly100Glu + Ile107Ser

    Ala 98Ser + Gly154Asn

    Gln103Asn + Ala216Glu

    Gly154Gln + Pro210Gln

    Leu126Pro + Ala216His

    Ala216His + Tyr217Leu

    Gly154Glu + Tyr217Ser

    Gly 97Ser + Tyr167Thr

    Trp106Ile + Ala216Gly

    Gly102Ser + Phe189Gly

    Gly154Glu + Gly219Asn

    Lys213Glu + Ala216Pro

    Asn 62Asp + Leu126Ser

    Thr 66Gly + Gln206Glu

    Gly157Pro + Val203Cys

    Gln 59Asp + Tyr214Ser

    Leu 96Met + Gly100Ser

    Ala 98Gly + Lys213Asp

    Asn 62Gln + Leu 96Asp

    Gly127Asn + Gln206Glu

    Gly160Pro + Gly219Asn

    Leu 96Thr + Tyr217Ala

    Trp106Phe + Tyr217Thr

    Gly131Pro + Lys213Glu

    Gly 65Gln + Asp 99Glu

    Gly127Asn + Gly128Gln

    Ala133Asn + Gly154Asn

    Ser204Glu + Gly215Ser

    Glu156Asp + Pro210Ser

    Asp 60Glu + Gln206Ser

    Asn 61Gln + Ala216Asn

    Pro210Asn + Asn212Asp

    Ala133Asp + Val203Asn

    Gly219Ser + Thr220Gly

    Ser191Asp + Val203Thr

    Gly160Glu + Ala216Thr

    Ser162Glu + Ala216Gln

    Ala 98Gln + Tyr217Asn

    Val 95Asp + Gln206Asn

    Tyr104Ser + Ser204Asp

    Gly100Pro + Phe189Gln

    Gly 97Asp + Tyr217His

    Gln206Ser + Gly211Asn

    Ala187Asn + Ser188Asp

    Ala 98Gly + Asp 99Glu

    Thr164Asn + Phe189Cys

    Val203Gln + Gln206Ser

    Trp106Cys + Gly157Ser

    Thr158Ser + Gly160SerSer188Asp + Tyr217Gly

    Gly157Asn + Phe189Met

    Ser188Asp + Ala216Asn

    Gly128Asn + Gly166Ser

    Leu126Asn + Ala216Ser

    Gly127Asp + Gln206Asn

    Gln 59Glu + Leu 96His

    Ser132Asp + Tyr217Ala

    Gly166Ser + Gly219Glu

    Ser163Glu + Val203Met

    Ala 98His + Tyr217Met

    Ala 98Pro + Ser130Asp

    Gly160Asn + Ser204Glu

    Gln206Asn + Gly215Asp

    Gln103Ser + Ser130Asp

    Ala133Gly + Thr220Gly

    Ser132Glu + Ala216Gln

    Asn 61Gln + Ile107His

    Leu126Ala + Gly131Glu

    Gln206Asp + Thr220Gly

    Gln206Glu + Tyr217Cys

    Gly157Ser + Pro210Asp

    Gly166Glu + Tyr214Gln

    Ser188Glu + Ala216His

    Thr 66Glu + Gly166Gln

    Gly102Pro + Gly166Glu

    Val 95Gln + Tyr104Ile

    Ser191Glu + Gly219Ser

    Asp 99Glu + Asn218Gln

    Gly100Asn + Ser105Glu

    Gly166Pro + Pro210Asn

    Gln 59Asn + Thr164Ser

    Leu126His + Tyr214Ala

    Thr 66Pro + Lys213Asp

    Trp106His + Gly211Ser

    Tyr167Leu + Ser204Glu

    Val 95Thr + Ala133Gly

    Ile107Ser + Gln206Glu

    Phe189Tyr + Lys213Asp

    Gly 65Asn + Asn218Asp

    Tyr167Val + Lys213Glu

    Gly 97Gln + Ser132Glu

    Asp 99Glu + Gly102Pro

    Leu126Cys + Ala216Asp

    Leu126Cys + Gly127Ser

    Ser191Asp + Ala216Asn

    Gly100Gln + Gly154Asp

    Asn 61Asp + Gly211Ser

    Ser161Asp + Phe189Leu

    Ile205Gln + Ala216Glu

    Asn 62Gln + Tyr217Leu

    Ile107Met + Ser161Asp

    Leu126Ile + Tyr217Ser

    Ala 98His + Ser162Asp

    ASh 61Asp + Gly128Ser

    Asn155Glu + Gly215Gln

    Asn155Gln + Ser204Asp

    Asn155Glu + Thr220Gln

    Lys213Asp + Tyr217His

    Gly127Pro + Ser204Glu

    Ser204Asp + Tyr217Ala

    Glu156Asp + Val203Gly

    Gly127Glu + Ala133His

    Gly100Asn + Gly131Ser

    Gly211Gln + Lys213Asp

    Ala187Asp + Phe189Leu

    Ala216Glu + Tyr217Cys

    Ser204Asp + Ala216Thr

    Gly131Ser + Thr158Asp

    Gly100Asn + Gln206Asn

    Ser105Asp + Gly131Gln

    Ser204Asp + Tyr214Val

    Tyr214Met + Tyr217Ile

    Ser 63Glu + Thr164Asn

    Ile107Cys + Ala216Pro

    Trp106Gly + Gln206Asp

    Gly102Asp + Thr164Pro

    Asp 99Glu + Ala216Gln

    Lys213Glu + Ala216Gln

    Ala133Ser + Pro210Glu

    Asp 60Glu + Tyr104Asn

    Asn 62Gln + Ile107Cys

    Tyr167Ala + Gly211Asp

    Glu156Asp + Tyr217Ile

    Gly131Pro + Leu209Pro

    Lys213Glu + Asn218Gln

    Gly160Ser + Val203Glu

    Asn155Ser + Tyr167Ala

    Asp 60Glu + Phe189Gly

    Thr164Gln + Gly219Ser

    Ser162Asp + Gln206Asn

    Gly100Glu + Tyr104Asn

    Gly160Pro + Gln206Ser

    Thr 66Gly + Ala216Gly

    Tyr104Ile + Gly215Pro

    Pro201Gln + Ala216Thr

    Gln103Glu + Ala133Asn

    Ser163Glu + Phe189His

    Gly127Ser + Tyr217Ser

    Gln206Asn + Leu209His

    Pro210Glu + Ala216Gln

    Asn 62Ser + Gln206Asn

    Ser161Glu + Gly219Asn

    Val203Gly + Asn212Glu

    Ala 98Glu + Leu126Met

    Val165Gln + Ser204Asp

    Gly154Ser + Ala216His

    Pro201Gly + Gly211Glu

    Ser161Asp + Gly219Gln

    Asn155Glu + Thr220Asn

    Leu 96Glu + Ile107Leu

    Thr158Ser + Gly215Ser

    Ser 63Glu + Pro129Ser

    Val 95Asn + Ser163Glu

    Gly102Asn + Leu126Glu

    Thr 66Gly + Ala216Pro

    Gly157Ser + Thr158Glu

    Ala 98Asp + Ala187Ser

    Asp 99Glu + Thr164Gln

    Thr 66Ser + Ser105Glu

    Gln103Asp + Gly154Pro

    Thr 66Glu + Tyr217His

    Gly127Gln + Ser204Glu

    Phe189Ile + Tyr217Thr

    Ala133Gln + Lys213Asp

    Ser130Asp + Tyr217Thr

    Leu126Ile + Asn212Ser

    Gly154Asn + Gln206Asp

    Thr 66Pro + Glu156Asp

    Gln103Asn + Lys213Asp

    Phe189Met + Gln206Asp

    Leu126Asn + Gly154Gln

    Pro210Gly + Gly215Glu

    Leu126Val + Ala216Pro

    Gln206Ser + Tyr217His

    Leu 96Asn + Lys213Asp

    Leu126Pro + Ala216Ser

    Val203His + Gly211Asp

    Tyr167Ala + Tyr217Asp

    Trp106Asn + Gln206Asn

    Gly127Ser + Ser161Glu

    Lys213Glu + Gly219Asn

    Val 95Thr + Thr208Gly

    Thr158Gly + Ser204Glu

    Gly 97Pro + Trp106Tyr

    Phe189Ile + Val203His

     Leu 96Gln + Lys213Glu

     Gln206Glu + Ala216Thr

     Gly154Ser + Asn155Glu

     Ser132Asp + Tyr214Asn

     Pro129Gln + Ala133Pro

     Ala 98Asn + Gly127Asp

     Gly211Gln + Asn218Asp

     Trpl06Cys + Ser163Asp

     Leu 96His + Ala216Gly

     Gly 97Ash + Ser204Asp

     Ash 61Ser + Gly157Asp

     Pro210Asn + Tyr217His

     Asp 60Glu + Tyrl04Ala

     Thr164Asn + Ala200Gly

     Tyr214Val + Ala216Asp

     Leu126His + Ala216Ser

     Gly128Gln + Asn212Asp

     Ser162Glu + Gln206Ser

     Gln206Glu + Ala216Ser

     Thr164Pro + Thr220Asp

     Val203Ser + Gly219Asp

     Gln206Asn + Gly219Asp

     Ser 63Asp + Ile107Gln

     Gly102Gln + Val203Ala

     Ser101Glu + Val165Gln

     Gln 59Ser + Gly166Glu

     Ser101Glu + Tyr217Ser

     Gly131Asn + Ala187Glu

     Gly102Ser + Tyr214Gly

     Thr158Ser + Thr220Glu

     Asp 99Glu + Gly215Gln

     Val 95Gly + Thr220Asp

     Ala200Ser + Tyr214Val

     Ser188Glu + Ala216Asn

     Tyr214His + Ala216Asp

     Thr158Glu + Phe189Asn

     Asn155Gln + Ser191Asp

     Thr 66Ser + Leu126Ser

     Thr 66Gly + Gln206Asp

     Ser105Asp + Tyr214Thr

     Gly102Pro + Thr164Gln

     Trp106Gly + Pro210Gly

     Asn155Asp + Thr220Gln

            表23

      多环三突变变异体

    Gln 59Ser + Leu 96Gly + Ser204Glu

    Asn 62Ser + Val 95Gln + Asn218Asp

    Tyr104Cys + Gly127Gln + Lys213Glu

    Ser188Glu + Gly215Asn + Ala216Pro

    Gly 97Gln + Ilel07Ala + Gly157Glu

    Ser162Glu + Pro210Gln + Gly215Asn

    Thr 66Pro + Val203Cys + Tyr217Ser

    Ser105Glu + Ala133Gly + Phe189Val

    Leu 96Asn + Asn212Ser + Tyr214Glu

    Gln 59Asp + Gly131Gln + Leu209Pro

    Trp106Pro + Gly157Glu + Tyr217Ile

    Thr 66Gln + Leu126Asn + Ser188Glu

    Asn212Ser + Lys213Asp + Gly219Gln

    Val 95Asp + Leu1265er + Asn155Gln

    Ash 61Glu + Thr 66Pro + Phe189Pro

    Gly160Asp + Gly166Asn + Ala216Asn

    Trp106Asn + Gly127Ser + Val203Asn

    Ser101Asp + Ile107Ala + Gly202Ser

    Ala133Thr + Phe189Ser + Tyr214Ile

    Gln 59Asn + Gly 97Asp + Trp106Phe

    Gly157Pro + Pro210Gly + Ala216Glu

    Gly160Ser + Asn212Ser + Tyr217Thr

    Asn 62Gln + Gln206Asn + Ala216Ser

    Pro129Ser + Gly215Glu + Tyr217Pro

    Ala 98Asn + Tyr217His + Thr220Gly

    Val203Gly + Gly211Glu + Ala216Asn

    Gly127Glu + Tyr214Asn + Ala216His

    Trp106Pro + Ala133Pro + Gln206Asp

    Val 95Ser + Gly128Glu + Tyr217Cys

    Ser159Asp + Gly166Gln + Gly219Gln

    Leu 96Val + Glu156Asp + Gly157Pro

    Ala133Gly + Thr208Pro + Tyr214Pro

    Trpl06Asn + Gly128Pro + Val203Met

    Gly 65Ser + Gly102Asn + Ala187His

    Ala200Gln + Gln206Glu + Tyr217His

    Gln103Ser + Glu156Asp + Ala216Ser

    Gln 59Asn + Ala216Thr + Gly219Pro

    Gly102Ser + Pro210Asp + Tyr217Ile

    Gly100Glu + Ile107Ser + Thr158Gly

    Ala 98Glu + Gly154Gln + Pro210Gln

    Gln103Glu + Leu126Pro + Ala216His

    Lys213Glu + Ala216His + Tyr217Leu

    Gly154Glu + Tyr167Thr + Tyr217Ser

    Gly 97Ser + Trp106Ile + Ala216Gly

    Gly102Ser + Phe189Gly + Gly219Asn

    Gly157Pro + Gly160Asp + Val203Cys

    Leu 96Met + Ala 98Gly + Gly100Ser

    Gly127Asn + Gly160Pro + Gln206Glu

    Leu 96Thr + Tyr217Ala + Gly219Asn

    Trp106Phe + Lys213Glu + Tyr217Thr

    Gly102Glu + Gly127Asn + Gly128Gln

    Ala133Asn + Gly154Asn + Ser161Asp

    Asn 61Gln + Gln206Ser + Ala216Asn

    Ser204Asp + Gly219Ser + Thr220Gly

    Ala 98Gln + Ser159Glu + Tyr217Asn

    Gly 97Asp + Gly100Pro + Phe189Gln

    Gln206Ser + Gly211Asn + Tyr217His

    Ala 98Gly + Ala187Asn + Ser188Asp

    Asp 99Glu + Thr164Asn + Phe189Cys

    Trp106Cys + Gly157Ser + Gln206Ser

    Gly157Asn + Ser188Asp + Tyr217Gly

    Gly166Ser + Ser188Asp + Ala216Asn

    Leu126Asn + Gly128Asn + Ala216Ser

    Leu 96His + Ser132Asp + Tyr217Ala

    Ala 98His + Lys213Glu + Tyr217Met

    Ala 98Pro + Ser130Asp + Gly160Asn

    Ser130Asp + Ala133Gly + Thr220Gly

    Asn 61Gln + Ile107His + Asn218Glu

    Gln206Glu + Tyr217Cys + Thr220Gly

    Gly157Ser + Pro210Asp + Tyr214Gln

    Val 95Gln + Gly102Pro + Gly166Glu

    Tyr104Ile + Ser191Glu + Gly219Ser

    Asp 99Glu + Gly100Asn + Asn218Gln

    Gly131Glu + Gly166Pro + Pro210Asn

    Leu126His + Thr164Ser + Tyr214Ala

    Thr 66Pro + Gly211Ser + Lys213Asp

    Trp106His + Tyr167Leu + Ser204Glu

    Val 95Thr + Ala133Gly + Gln206Glu

    Gly 97Gln + Gly102Pro + Ser132Glu

    Leu126Cys + Ser191Asp + Ala216Asn

    Gly100Gln + Gly154Asp + Gly211Ser

    Asn 62Gln + Ala216Glu + Tyr217Leu

    Leu126Ile + Ser161Asp + Tyr217Ser

    Pro129Glu + Asn155Gln + Thr158Gln

    Gly127Glu + Ala133His + Val203Gly

    Gly131Ser + Gly211Gln + Lys213Asp

    Gly131Ser + Thr158Asp + Ala216Thr

    Gly100Asn + Ser105Asp + Gln206Asn

    Gly 97Glu + Gly160Gln + Thri64Asn

    Ile107Cys + Lys213Asp + Ala216Pro

    Trp106Gly + Gln206Asp + Ala216His

    Ala133Ser + Lys213Glu + Ala216Gln

    Asn 62Gln + Ile107Cys + Thr164Asp

    Gly131Pro + Leu209Pro + Tyr217Ile

    Asn155Ser + Tyr167Ala + Phe189Gly

    Asp 60Glu + Thr164Gln + Gly219Ser

    Gly160Pro + Ser204Glu + Gln206Ser

    Thr 66Gly + Gly100Asp + Ala216Gly

    Tyr104Ile + Gly215Pro + Ala216Thr

    Gly127Ser + Lys213Asp + Tyr217Ser

    Ser188Glu + Gln206Asn + Leu209His

    Asn 62Ser + Gln206Asn + Pro210Glu

    Ala 98Glu + Leu126Met + Val203Gly

    Gly154Ser + Ser161Glu + Ala216His

    Pro201Gly + Gly211Glu + Ala216Thr

    Ser161Asp + Gly219Gln + Thr220Asn

    Asn 62Glu + Thr158Ser + Gly215Ser

    Gly102Asn + Leu126Glu + Ala216Pro

    Gly127Gln + Ser204Glu + Tyr217Thr

    Ala133Gln + Phe189Ile + Lys213Asp

    Ser130Asp + Asn212Ser + Tyr217Thr

    Leu126Ile + Gly154Asn + Gln206Asp

    Thr 66Pro + Gln103Asn + Lys213Asp

    Leu126Asn + Gly154Gln + Pro210Gly

    Leu126Val + Gly215Glu + Ala216Pro

    Gln206Ser + Lys213Asp + Tyr217His

    Leu 96Asn + Leu126Pro + Ala216Ser

    Ser 63Asp + Trp106Asn + Gln206Asn

    Gly127Ser + Ser161Glu + Gly219Asn

    Val 95Thr + Thr208Gly + Lys213Glu

    Gly 97Pro + Trpl06Tyr + Asn218Glu

    Leu 96Gln + Phe189Ile + Val203His

    Ser132Asp + Ala133Pro + Tyr214Asn

    Ala 98Asn + Gly127Asp + Gly211Gln

    Leu 96His + Gly 97Asn + Ala216Gly

    Pro210Asn + Gly215Glu + Tyr217His

    Asp 60Glu + Trp106Tyr + Pro129Gln

    Gly157Asn + Phe189Val + Asn218Asp

    Gly100Asp + Thr164Asn + Ala200Gly

    Leu126His + Gln206Asp + Ala216Ser

    Ser 63Asp + Ile107Gln + Val203Ala

    Ser101Glu + Gly102Gln + Val165Gln

    Asp 99Glu + Thr158Ser + Gly215Gln

    Ala200Ser + Ser204Glu + Tyr214Val

    Asn155Gln + Thr158Glu + Phe189Asn

    Thr 66Gly + Ser105Asp + Tyr214Thr

    Gly102Pro + Thr164Gln + Pro210Gly

    Trp106Gly + Asn155Asp + Thr220Gln

    Thr158Gly + Ala187Gln + Ser204Glu

    Gly154Gln + Tyr167Cys + Ser204Glu

    Asp 60Glu + Ala 98His + Gly102Pro

    Gly131Ser + Ile205Val + Ala216Asp

    Gly128Gln + Val165Cys + Gly211Gln

    Gly 97Asn + Ile107Gln + Gly166Gln

    Gly160Asp + Gly166Pro + Tyr214Ile

    Gln 59Asp + Gly154Ser + Asn218Gln

    Gly154Ser + Val165His + Ser204Glu

    Ser 63Glu + Pro129Ser + Tyr217Gly

    Gly157Pro + Thr158Ser + Lys213Glu

    Thr164Glu + Gly215Ser + Ala216Asn

    Thr 66Pro + Asp 99Glu + Tyr217Cys

    Trp106Met + Ala187Ser + Tyr217Ile

    Ile107Thr + Glu156Asp + Tyr217Cys

    Leu126Pro + Gly131Asn + Tyr217Leu

    Tyr167His + Gly219Pro + Thr220Glu

    Val 95Pro + Trp106Ile + Tyr217Gly

    Val 95His + Gln206Asn + Lys213Glu

    Val 95Ala + Ala187Ser + Tyr217Glu

    Asp 60Glu + Asn 62Gln + Tyr167Ile

    Gly160Asn + Ala187Gly + Gln206Ser

    Gly102Gln + Trp106His + Ser163Glu

    Asn 62Gln + Ser188Glu + Pro210Gln

    Gly100Pro + Gly202Gln + Ala216Ser

    Ser105Glu + Ile107Thr + Gly131Pro

    Thr 66Gly + Gly131Asp + Phe189Ser

    Gln103Asn + Ala187Ser + Ser204Glu

    Asp 60Glu + Thr164Pro + Ala216Ser

    Gln 59Glu + Asn212Ser + Tyr217Ser

    Asn 61Glu + Gly166Gln + Gly215Pro

    Asn 62Gln + Gly160Gln + Gly219Ser

    Ser105Glu + Tyr167Ala + Tyr217Ser

    Gly100Ser + Asn155Ser + Tyr217Asn

    Gly 97Pro + Leu126Ala + Gly157Gln

    Gly100Ser + Gly131Gln + Phe189Glu

    Ser132Asp + Ala187Pro + Gln206Asn

    Gln 59Asp + Gln206Asn + Tyr217Ile

    Gln103Asn + Ile107Asn + Ala133Ser

    Gly128Gln + Pro129Asn + Ala216Asp

    Thr 66Glu + Trp106Ala + Ala187Ser

    Asp 60Glu + Gly 65Asn + Tyr214Ser

    Ser132Asp + Gly157Asn + Ala216Ser

    Asn 62Asp + Ile205Thr + Gln206Ser

    Gln 59Asn + Gly 65Pro + Val 95Asp

    Val 95Ser + Gly102Ser + Lys213Asp

    Ala216Pro + Tyr217Pro + Asn218Ser

    Ser 63Asp + Gly127Ser + Thr220Asn

    Gly 97Asn + Gly154Gln + Ala216Asn

    Ala 98His + Trp106Val + Ala216Gln

    Gly102Asn + Ile107Gln + Ser162Asp

    Ile107Val + Lys213Glu + Ala216Ser

    Tyr104Leu + Gln206Glu + Thr220Asn

    Pro201Asn + Pro210Asn + Gly211Gln

    Gly166Asn + Ile205Asn + Ala216Thr

    Ala 98Ser + Gln206Ser + Gly215Ser

    Ala133His + Ser188Asp + Tyr217Gly

    Ala 98Glu + Gly131Pro + Gly157Pro

    Leu 96Ile + Ser188Asp + Val203His

    Tyr167Thr + Gln206Ser + Tyr217His

    Leu 96Gln + Ser161Glu + Ala216Thr

    Gly127Glu + Thr158Pro + Pro201Gly

    Gly160Ser + Lys213Glu + Ala216Ser

    Tyr104Ser + Leu126His + Tyr214His

    Asn 62Ser + Gly160Glu + Ala216His

    Leu 96Cys + Thr164Ser + Ser204Asp

    Gly131Gln + Phe189Ile + Val203Asp

    Asp 60Glu + Gly 65Gln + Thr 66Asn

    Gly102Glu + Gly128Ser + Ala216Gln

    Asn 62Gln + Val 95Gly + Gln206Asn

    Gly 97Pro + Gly154Asp + Asn218Gln

    Thr 66Pro + Leu 96Val + Ala216Pro

    Gly 97Asn + Asn155Glu + Tyr214Val

    Tyr104Ala + Tyr167Glu + Ala216Pro

    Gly157Asn + Asn218Glu + Thr220Gly

    Ala133His + Thr164Gln + Gly166Ser

    Leu126Gln + Ser159Glu + Glyl60Asp

    Asn 61Asp + Asn 62Asp + Gly128Ser

    Thr 66Pro + Gly100Glu + Ser101Glu

    Ser204Glu + Ile205Gln + Ala216Glu

    Ser204Asp + Ala216Glu + Tyr217Cys

    Ser204Asp + Ala216Asp + Thr220Gln

    Gln103Asn + Ser204Glu + Ala216Glu

    Gly202Gln + Ser204Glu + Asn218Asp

    Ser204Glu + Gln206Asp + Ala216Asp

    Ser204Asp + Gln206Glu + Ala216Asp

    Tyr167Ala + Ser204Asp + Tyr217Asp

    Gly211Asp + Lys213Glu + Ala216Thr

    Gly211Asp + Lys213Glu + Tyr217Pro

    Tyr167Val + Gly211Asp + Lys213Glu

    Asp 60Glu + Asn 62Asp + Tyr217Leu

    Gly160Glu + Ser162Glu + Ala216Thr

    Ser204Glu + Gln206Asp + Tyr217Leu

    Ser204Glu + Gln206Glu + Ala216Thr

    Ile107Cys + Ser204Glu + Gln206Glu

    Ser204Glu + Gln206Glu + Gly215Asn

    Serl61Asp + Ser163Asp + Ala216His

    Thr164Pro + Gln206Glu + Tyr217Asp

    Asp 60Glu + Gln206Asn + Pro210Asp

    Asp 60Glu + Tyr104Asn + Pro210Glu

    Ala187Glu + Val203Glu + Asn218Glu

    Ser130Glu + Gly166Glu + Phe189Tyr

    Thr158Asp + Ser162Glu + Gln206Ser

    Gly154Asp + Va1203Ser + Gly219Asp

    Ser188Glu + Ser191Asp + Ala216Asn

    Asp 60Glu + Gly 97Glu + Asp 99Glu

    Thr164Pro + Ser204Glu + Gly219Glu

    Asp 99Glu + Gly102Asp + Ala216Gln

    Ser204Glu + Gln206Asn + Gly215Asp

    Ser204Asp + Gln206Asp + Tyr214Asp

    Thr 66Asp + Gly211Glu + Lys213Asp

    Ser101Glu + Leu126Glu + Tyr214His

    Asn 61Glu + Leu 96Glu + Ile107Leu

    Asp 60Glu + Leu 96Glu + Gly166Pro

    Ser101Glu + Gly127Glu + Ala187Gln

    Ser 63Glu + Gly131Asn + Lys213Glu

    Ser 63Asp + Phe189Leu + Lys213Glu

    Ser105Glu + Ser132Glu + Tyr167Gly

    Ser204Asp + Ala216Glu + Thr220Glu

    Ser204Glu + Lys213Asp + Gly215Asp

    Asp 99Glu + Ser101Asp + Tyr104Asp

    Ser 63Asp + Pro210Glu + Tyr217Glu

    Thr158Gln + Gln206Asp + Lys213Asp

    Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216His

    Gly157Asp + Tyr214Gly + Thr220Asp

    Ser 63Glu + Gly100Ser + Tyr217Asp

    Gly100Glu + Gln103Asp + Gln206Asn

    Gly154Glu + Ser163Asp + Va1203Met

    Val 95Gly + Lys213Asp + Ala216Glu

    Gln 59Asn + Leu126Glu + Pro129Glu

    Ser204Glu + Gln206Asp + Lys213Glu

    Ala187Asp + Ser204Glu + Gln206Glu

    Ser 63Glu + Ser204Glu + Ala216Asp

    Asn 61Asp + Sar 63Asp + Ala216Glu

    Pro129Glu + Asn155Glu + Ser163Asp

    Ser 63Asp + Ile107Leu + Asn212Asp

    Gln206Asp + Pro210Asp + Asn212Asp

    Glu156Asp + Ser163Glu + Gly219Asp

    Ile107Glu + Gly131Ser + Ser132Asp

    Gly100Asn + Gly211Asp + Gly215Glu

    Gln103Asp + Gly127Glu + Ala216Gln

    Ser130Asp + Gly131Asp + Lys213Glu

    Gly100Asp + Serl01Glu + Ser163Asp

    Pro129Asp + Ser130Asp + Tyr217Glu

    Va1203Asp + Ser204Glu + Lys213Glu

    Ser132Asp + Ala216Glu + Tyr217Glu

    Ser101Glu + Ala187Glu + Ser188Glu

    Ala 98Asp + Asp 99Glu + Ser204Asp

    Ser204Asp + Gln206Asp + Asn212Asp

    Gln103Asp + Glu156Asp + Ser191Glu

    Ser132Asp + Ser204Glu + Ala216Asp

    Ala 98Glu + Ser204Glu + Ala216Glu

    Ser204Asp + Lys213Asp + Asn218Glu

    Ser204Glu + Gly211Asp + Tyr217Asp

    Ser162Asp + Gly166Asp + Asn212Ser

    Gly128Glu + Gly166Glu + Gln206Glu

    Asp 60Glu + ASn 62Glu + Ser204Asp

    Asp 99Glu + Serl01Asp + Gly154Glu

    Glnl03Ser + Gln206Glu + Gly219Asp

    Phe189Asp + Pro210Asp + Lys213Glu

    Asn 61Asp + Ser101Glu + Gly128Asp

    Thr 66Glu + Gly166Gln + Ala216Glu

    Ser101Glu + Ser204Glu + Gln206Asp

    Gly157Glu + Ser204Glu + Gln206Glu

    Asp 99Glu + Ser204Asp + Gln206Glu

    Gly 97Glu + Ser204Glu + Gln206Asp

    Ser101Asp + Gly102Ser + Ser105Asp

    Ser161Glu + Ser163Asp + Gln206Asp

    Ser130Asp + Ser132Glu + Asn212Glu

    Ser130Glu + Ser132Glu + Gly160Asp

    Pro129Glu + Gly131Glu + Gly215Glu

    Asn 62Gln + Thr158Asp + Gly166Glu

    Ser132Glu + Gln206Glu + Tyr217Asp

    Asp 60Glu + Phe189His + Asn212Glu

    Gly131Glu + Lys213Asp + Gly215Glu

    Ser159Glu + Ser163Glu + Ser204Glu

    Thr158Glu + Ser162Asp + Gly219Asp

    Tyr104Glu + Ser132Glu + Asn212Asp

    Asp 99Glu + Glu156Asp + Ser159Glu

    Ser 63Glu + Ser188Asp + Ser191Asp

    Ser188Asp + Ser191Glu + Ala216Asp

    Gln 59Glu + Ser188Asp + Ser191Asp

    Ser204Glu + Lys213Glu + Gly219Glu

    Asp 60Glu + Ser204Asp + Gly219Asp

    Leu126Asp + Gly166Asp + Ser204Asp

    Thr164Glu + Ser188Glu + Gln206Ser

    Asp 60Glu + Gln206Glu + Lys213Asp

    Ser105Asp + Leu126Glu + Thr220Asp

    Asp 99Glu + Glu156Asp + Ser188Asp

    Gln 59Glu + Asn 62Asp + Ala187Glu

    Gly166Glu + Val203Asp + Gln206Glu

    Asn155Glu + Ala187Glu + Lys213Asp

    Thr 66Asp + Ser204Glu + Lys213Asp

    Ser 63Asp + Ser188Glu + Asn218Glu

    Ser 63Asp + Ser105Asp + Lys213Asp

    Ser105Asp + Ser132Glu + Gln206Glu

    Ser 63Asp + Gly 97Asp + Asn155Asp

    Ser 63Glu + Ser101Asp + Ser105Asp

    Thr164Glu + Gln206Glu + Lys213Glu

    Leu126Glu + Gln206Asp + Lys213Asp

    Gly131Glu + Gin206Asp + Lys213Asp

    Ser 63Asp + Trp106Asp + Tyr217Glu

    Gly160Glu + Lys213Glu + Ala216Glu

    Ala133Glu + Lys213Asp + Ala216Asp

    Ser 63Glu + Gln206Asp + Gly215Gln

    Lys213Asp + Ala216Asn + Tyr217Glu

    Ser130Asp + Ala187Asp + Ser204Glu

    Asp 99Glu + Ser188Glu + Asn218Asp

    Asn 61Asp + Ser188Glu + Asn218Glu

    Gly102Asp + Ser204Glu + Thr220Glu

    Gly127Asp + Ser191Glu + Lys213Asp

    Thr 66Glu + Gly 97Glu + Tyr217Cys

    Gly154Asp + Ala187Glu + Gly215Asp

    Gly102Asp + Gly154Glu + Ser188Glu

    Gln103Asp + Ser132Asp + Gln206Glu

     Tyr167His + Ser191Glu + Asn218Asp

     Asp 60Glu + Glu156Asp + Gly160Glu

     Gln103Glu + Gly154Glu + Asn218Asp

     Asp 60Glu + Asn155Glu + Ser159Asp

     Gln103Glu + Ser161Glu + Ser191Asp

     Ala 98Asp + Ser132Asp + Gly166Glu

     Ser188Asp + Ser204Asp + Tyr214Val

                  表24

            多环四突变变异体

    Gln 59Ser + Asn 62Ser + Leu 96Gly + Ser204Glu

    Gly127Gln + Ser188Glu + Gly215Asn + Ala216Pro

    Asn 62Gln + Ile107Ala + Gln206Asp + Tyr217Thr

    Asn 61Ser + Leu 96His + Gly157Pro + Ala216Gly

    Leu 96Gln + Gly127Gln + Glu156Asp + Thr220Asn

    Thr158Glu + Gly202Ser + Gln206Ser + Thr220Ser

    Gly 97Asn + Serl05Asp + Gly215Ser + Ala216Ser

    Leu126Thr + Gly211Gln + Lys213Asp + Ala216Ser

    Gly100Asp + Trp106Asn + Gly127Ser + Val203Asn

    Ile107Ala + Gly160Asn + Gly166Asp + Gly202Ser

    Ala133Thr + Phe189Ser + Tyr214Ile + Ala216Glu

    Asn 62Ser + Ser163Asp + Phe189Ser + Pro201Gln

    Ala 98Gln + Gly102Asn + Pro201Asn + Gly219Asp

    Thr 66Ser + Leu126Glu + Gly127Gln + Ala216Thr

    Pro129Ser + Thr164Gln + Ala216Asp + Tyr217Val

    Gly128Gln + Thr158Gln + Gln206Asn + Asn212Asp

    Gly157Ser + Gln206Glu + Tyr217Cys + Thr220Gly

    Val 95Gln + Tyr104Ile + Ser191Glu + Gly219Ser

    Gln 59Asn + Gly 97Asn + Gly154Pro + Asn218Ser

    Pro129Gly + Thr158Asn + Gln206Asn + Gly211Pro

    Ala 98His + Trp106His + Gln206Asn + Lys213Asp

    Leu126Ile + Ser204Glu + Gln206Asn + Tyr217Thr

    Gln 59Glu + Asn 62Gln + Phe189Leu + Val203Ala

    Pro129Gln + Gly154Pro + Ala187Thr + Lys213Glu

    Ser 63Glu + Thr164Asn + Gln206Ser + Pro210Asn

    Leu 96Met + Gln103Asn + Ala133Ser + Ser204Glu

    Trp106Ala + Gly154Pro + Ala187Asn + Gly219Pro

    Asn 62Glu + Gly102Pro + Gly160Asn + Asn218Ser

    Thr 66Gly + Gly100Asp + Tyr104Ile + Ala216Gly

    Gly102Asp + Pro201Gln + Gly215Pro + Ala216Thr

    Leu126Met + Val203Gly + Asn212Glu + Gly219Asn

    Leu 96Glu + Ile107Leu + Thr158Ser + Gly215Ser

    Ser130Asp + Ala133Gln + Asn212Ser + Tyr217Thr

    Thr 66Gly + Gly100Ser + Leu126Gly + Ala216Glu

    Gln103Asp + Tyr104Ile + Gly128Gln + Tyr217Cys

    Leu126Pro + Ser204Asp + Gln206Asn + Thr208Asn

    Pro129Ser + Gly157Asn + Thr164Glu + Ala200Ser

    Gly128Gln + Val165Cys + Gly211Gln + Lys213Glu

    Gly160Asp + Gly166Pro + Gly211Ser + Tyr214Ile

    Gln103Ser + Gly166Asn + Tyr214Ile + Gly215Pro

    Asn 61Asp + Tyr104Ser + Leu126His + Tyr214His

    Gly 65Gln + Gly131Gln + Phe189Ile + Va1203Asp

    Asn 62Gln + Thr 66Asp + Val 95Gly + Gln206Asn

    Thr 66Pro + Gly 97Pro + Gly154Asp + Ala216Pro

    Val 95Pro + Tyr104Gly + Gly127Ser + Gly215Asp

    Asp 99Glu + Trp106Ala + Pro201Gln + Ala216Gly

    Asn 61Gln + Val 95Asp + Gly102Asn + Ala187Asn

    Ile107Gln + Va1203Ser + Ser204Asp + Gly215Ser

    Val 95Thr + Gly202Gln + Ser204Asp + Ala216Asn

    Thr158Pro + Va1203Gly + Lys213Glu + Tyr217Ser

    Trp106Pro + Asn155Asp + Gln206Ser + Tyr214Ala

    Gly102Asn + Gly157Ser + Tyr167Ala + Ala216Asn

    Gly160Asn + Va1203Thr + Pro210Glu + Asn218Gln

    Ile107Ser + Gly128Asn + Asn155Glu + Ala216Gly

    Gln103Asn + Pro129Gly + Gly166Gln + Thr220Gly

    Asn 61Ser + Ser 63Asp + Thr 66Gly + Gly154Ser

    Tyr104Gly + Pro129Ser + Gln206Ser + Gly219Ser

    Gly102Pro + Gly131Asp + Asn155Ser + Tyr217His

    Asn 61Ser + Val 95Gln + Ser204Asp + Ala216Gln

    Thr158Asn + Ala187Gly + Tyr217Ala + Gly219Asp

    Gly 65Gln + Gly 97Pro + Ser130Glu + Pro210Asn

    Gly128Asn + Ser159Glu + Pro201Ser + Tyr217Val

    Leu126Asn + Asn155Gln + Gly202Gln + Asn212Ser

    Thr 66Ser + Tyr104Val + Gly154Glu + Gly215Asn

    Gly102Asn + Gly128Gln + Ser161Glu + Tyr217Met

    Ser132Glu + Thr158Gln + Thr164Asn + Gln206Asn

    Asn 62Glu + Leu 96Ile + Gly211Ser + Gly219Ser

    Thr208Pro + Pro210Gly + Ala216Thr + Tyr217Met

    Gly100Gln + Gly160Asn + Pro201Gly + Asn212Asp

    Tyr104Asp + Gly154Pro + Ala187Asn + Val203Ser

    Leu 96Gln + Leu126Thr + Ser162Glu + Tyr217Val

    Gly128Asn + Ala187Pro + Pro201Gly + Ser204Glu

    Gln103Ser + Gly157Glu + Thr158Gln + Ala216Gln

    Leu126Ser + Thr164Glu + Val203Pro + Gly211Gln

    Thr164Gly + Va1203Met + Ala216Asp + Tyr217Gln

    Ser159Asp + Val203Asn + Ile205Asn + Pro210Ser

    Gly 65Asn + Gln206Asp + Ala216Gly + Tyr217His

    Gln103Asn + Ile107Cys + Thr164Asp + Val203Thr

    Gly128Glu + Asn155Gln + Thr158Ser + Gly160Ser

    Ala 98His + Ser162Glu + Gln206Asn + Tyr217Gly

    Gly128Ser + Thr164Asn + Ser204Glu + Tyr217Gly

    Gly127Gln + Gly157Ser + Ser159Asp + Tyr217Val

    Gly157Asn + Gln206Asn + Tyr217Val + Gly219Pro

    Thr 66Ser + Ala133Thr + Ser163Asp + Thr208Gln

    Leu 96Thr + Glyl31Asp + Gln206Asn + Ala216Gly

    Ash 61Ser + Ser132Glu + Gly211Ser + Asn218Gln

    Gly100Ser + Tyrl04Ala + Ser204Asp + Gly211Gln

    Leu 96His + Ala 98Glu + Pro129Gln + Ala133Asn

    Asn 62Glu + Gly128Gln + Ala187Asn + Gly215Ser

    Leu 96Ile + Gly157Ser + Val203Ala + Ala216Ser

    ASn 61Gln + Val 95Thr + Gly160Asp + Ala216His

    Leu 96Cys + Gly128Pro + Ser191Glu + Thr208Asn

    Trp106Ala + Gly131Gln + Val203Ala + Tyr214Gln

    Asn 61Ser + Ala216Gln + Tyr217Leu + Gly219Asn

    Tyr104Gly + Ser105Glu + Thr158Ser + Leu209Thr

    Ala133Ser + Phe189Thr + Asn212Glu + Tyr217Thr

    Tyr104Ser + Thr158Gly + Thr164Glu + Ala216Pro

    Gln 59Asn + Thr 66Asn + Thr164Gly + Ala187Pro

    Ile107His + Gly157Ser + Lys213Glu + Tyr217Asn

    Gly127Ser + Gln206Asp + Gly215Gln + Tyr217Leu

    Leu126Gly + Gly131Glu + Tyr167Met + Thr220Gln

    Thr158Gln + Lys213Glu + Gly215Ser + Tyr217Gly

    Asn 61Gln + Leu126Gly + Thr164Ser + Asn218Asp

    Asn 62Asp + Pro129Gly + Gln206Ser + Ala216His

    Asp 60Glu + Val 95Gln + Leu126Pro + Val203Thr

    Gln103Glu + Ilel07Val + Phe189Asn + Ala216Thr

    Ile107Thr + Pro129Gln + Lys213Glu + Tyr217Thr

    Tyr104His + Gly154Gln + Gly157Asp + Tyr217Ser

    Gln 59Asn + Trp106Cys + Ala200Thr + Ala216Gln

    Thr 66Gln + Gly 97Ser + Gly127Pro + Tyr217Asp

    Gly100Asn + Ser204Asp + Pro210Ser + Tyr214Gly

    Asn 62Ser + Ile107Gly + Leu126Cys + Thr220Gly

    Leu126His + Gly154Asp + Asn218Gln + Thr220Asn

    Ser101Glu + Gly157Gln + Tyr214Pro + Ala216His

    Asn 62Gln + Ser162Glu + Val203Ser + Ala216Thr

    Tyr104Gln + Trp106Gly + Leu126Asp + Asn212Gln

    Gln 59Ser + Val 95Pro + Gly202Asn + Tyr217Ser

    Leu 96Pro + Gly160Asp + Ser161Glu + Gly166Asn

    Ser159Glu + Gly160Asp + Tyr167Gly + Phe189Val

    Asn212Glu + Lys213Glu + Ala216Ser + Tyr217Gln

    Thr158Asp + Ser159Asp + Gly215Asn + Ala216Thr

    Ala 98Asp + Asp 99Glu + Thr164Gln + Ala187Ser

    Gly 97Pro + Gly131Pro + Gly154Asp + Asn155Asp

    Gly102Ser + Trp106Gln + Gly157Glu + Phe189Asp

    Gly100Gln + Ser204Glu + Tyr214Ile + Ala216Glu

    Val 95Pro + Ser204Glu + Ala216Gly + Asn218Glu

    Ser204Glu + Ile205Gln + Pro210Gly + Asn218Asp

    Gly 97Ser + Gly154Asn + Gln206Asp + Gly215Asp

    Gly 97Asp + Ala 98Gln + Asp 99Glu + Gly154Ser

    Thr158Gln + Val165Met + Gly211Glu + Lys213Glu

    Gly160Glu + Ser162Asp + Tyr167Ile + Gly219Ser

    Asn 61Ser + Thr 66Ser + Asn155Glu + Gly157Asp

    Thr158Asp + Ser159Asp + Thr164Asp + Gly211Asn

    Val 95Asp + Gly102Glu + Ala187Pro + Tyr217Pro

    Asn 62Glu + Gly100Asp + Thr208Asn + Tyr217His

    Ser204Asp + Gln206Glu + Gly211Gln + Ala216His

    Gly154Asn + Ser204Glu + Gln206Asp + Tyr217Thr

    Thr 66Gln + Ser130Glu + Ser132Asp + Thr158Pro

    Asp 60Glu + Gly 65Asn + Thr 66Glu + Tyr214Ser

    Asp 60Glu + Gln206Ser + Pro210Glu + Gly219Ser

    Thr158Asp + Ser163Glu + Ser191Glu + Ile205Gly

    Ser204Asp + Gly215Gln + Ala216Glu + Gly219Asp

    Thr158Asp + Ala187Asp + Phe189Glu + Tyr217Met

    Gly128Gln + Pro129Asn + Val203Asp + Ala216Asp

    Gly 97Asn + Ile107Gln + Ser204Glu + Gly219Glu

    Trp106Asn + Gly157Gln + Ser204Asp + Gly219Asp

    Gly127Asp + Gly128Asn + Ser130Asp + Gly219Gln

    Val 95Ser + Pro129Gly + Asn155Glu + Ser188Glu

    Asn155Asp + Ser188Asp + Phe189Asn + Ala216Gly

    Trp106Phe + Ser204Asp + Gln206Asp + Tyr214Asp

    Asn 62Asp + Gly 97Gln + Pro210Asp + Gly211Glu

    Val 95Asp + Tyr104Asp + Leu126Ser + Asn155Gln

    Gly100Asn + Gln206Asp + Lys213Glu + Ala216Asp

    Gln206Asp + Lys213Asp + Ala216Glu + Tyr217Asn

    Gly102Gln + Asn155Glu + Val203Glu + Asn218Asp

    Gln 59Glu + Thr 66Glu + Gly102Pro + Gly166Gln

    Leu126Cys + Gly157Asp + Ser163Asp + Ala216His

    Thr 66Asp + Gln206Asp + Ala216Asp + Gly219Pro

    Asn 62Asp + Ser 63Glu + Gly131Asn + Lys213Glu

    Leu126Asn + Pro129Asn + Ser191Asp + Gly219Glu

    Thr 66Asp + Gly100Asn + Gly127Ser + Lys213Glu

    Ile107Val + Phe189Asp + Val203Glu + Ala216Gln

    Ser 63Asp + Val 95Ser + Lys213Asp + Ala216Ser

    Ile107His + Val203Cys + Tyr214Glu + Tyr217Asp

    Asn 62Ser + Ser105Asp + Trp106Gly + Ser132Asp

    Ser 63Glu + Leu 96Cys + Pro210Glu + Ala216Glu

    Ala187Gly + Gly215Asp + Tyr217Thr + Asn218Glu

    Gly160Ser + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Ser

    Gly131Pro + Phe189Leu + Gln206Glu + Lys213Glu

    Pro129Asn + Ala133Gln + Gln206Glu + Lys213Glu

    Ala 98His + Gly154Glu + Ser163Asp + Tyr217Met

    Va1203His + Gln206Glu + Gly211Glu + Lys213Asp

    Leu126Ala + Ser204Glu + Gln206Asp + Lys213Glu

    Ile107Leu + Gly157Glu + Va1203His + Gly219Glu

    Ala 98Glu + Gly102Asp + Ser105Glu + Leu209Thr

    Thr 66Gln + Lys213Glu + Ala216Glu + Asn218Glu

    Ser204Glu + Gln206Asn + Pro210Glu + Gly215Asp

    Gly127Asp + Ser132Asp + Gly154Asp + Va1165Gln

    Ser 63Glu + Val203His + Asn212Glu + Tyr217Leu

    Gln206Glu + Lys213Glu + Tyr217Ala + Asn218Glu

    Gln206Asp + Lys213Glu + Ala216Asn + Asn218Asp

    Gly157Pro + Ser188Glu + Ser204Glu + Ala216Asp

    Gln 59Glu + Thr 66Asp + Gly100Gln + Gly215Glu

    Trp106Ser + Ala187Asp + Gln206Glu + Tyr217Asp

    Ser159Glu + Asn212Gln + Gly215Asp + Ala216Glu

    Gly160Asp + Ser161Asp + Gln206Asp + Tyr214Asn

    Thr 66Glu + Tyr167Gln + Gln206Glu + Gly211Pro

    Pro129Asn + Ser163Glu + Tyr217Glu + Asn218Glu

    Asn155Glu + Glu156Asp + Ser204Glu + Tyr214Thr

    Gln 59Asp + Ser162Asp + Ser163Glu + Ala216Thr

    Leu126Pro + Ser162Glu + Ser163Glu + Tyr217Glu

    Gly100Glu + Val203Cys + Asn212Asp + Lys213Glu

    Ser105Glu + Ala187Ser + Val203Glu + Ser204Asp

    Gln103Asp + Ser163Glu + Thr164Glu + Pro201Gln

    Val 95Gln + Glu156Asp + Gly157Asp + Lys213Glu

    Ser162Glu + Thr164Gln + Ala216Asp + Tyr217Glu

    Asp 99Glu + Gly100Glu + Ser159Glu + Ala216Thr

    Ala 98Glu + Asp 99Glu + Trp106Gly + Gly154Asp

    Asn 62Glu + Ser 63Glu + Pro129Ser + Asn155Asp

    Asn 61Glu + Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Cys

    Thr 66Pro + Gln103Asp + Glu156Asp + Ser191Asp

    Asp 60Glu + Ser204Asp + Ala216Asp + Tyr217Ile

    Ser105Asp + Ser204Asp + Gln206Ser + Ala216Glu

    Thr158Asn + Ser162Asp + Ser204Asp + Asn218Asp

    Gln 59Asp + Gly157Ser + Ser204Asp + Asn218Asp

    Gly 97Ser + Gly128Glu + Gln206Glu + Gly215Asp

    Trpl06Asp + Val203Cys + Ser204Glu + Tyr217Glu

    Ser105Glu + Ala187Thr + Ser204Glu + Tyr217Glu

    Gly 97Asn + Asn155Glu + Ser163Glu + Tyr214Val

    Val 95Asp + Trp106Glu + Ala187Pro + Val203Asp

    Gln103Asp + Trp106Glu + Gly128Asn + Ser162Asp

    Gly128Glu + Ser130Asp + Ser188Glu + Ala216Gln

    Gln103Asp + Ser105Glu + Gly154Glu + Ala216Thr

    Ser159Glu + Gly211Glu + Lys213Asp + Tyr217Gly

    Gln 59Asn + Ser188Asp + Gly211Glu + Lys213Glu

    Ile107Glu + Gly211Glu + Lys213Asp + Tyr217Gln

    Ser159Asp + Ser162Glu + Pro210Glu + Ala216Asn

    Asp 60Glu + Asn 62Asp + Ser191Asp + Tyr217Leu

    Asp 60Glu + Ser 63Asp + Ile107Asn + Phe189Glu

    Leu 96Cys + Gly166Asp + Pro210Asp + Lys213Asp

    Val 95Glu + Ala 98Asn + Gly102Glu + Ser162Glu

    Ser 63Asp + Tyr167His + Ala216Glu + Gly219Glu

    Tyr104Asp + Thr158Asp + Ser191Glu + Asn218Ser

    Gly154Pro + Ser159Glu + Ser204Asp + Gln206Asp

    Gly102Glu + Ser204Asp + Gln206Glu + Tyr217His

    Asn155Gln + Ser163Asp + Ser204Glu + Gln206Glu

    Gly131Asp + Thr158Gln + Ser204Asp + Gln206Asp

    Tyr167Asp + Ser204Glu + Gln206Glu + Tyr217Asn

    Gly 97Asp + Ala133Gly + Ser204Asp + Gln206Asp

    Gly127Asp + Ser204Glu + Gln206Glu + Tyr214Asn

    Gly102Glu + Gly127Gln + Asn155Asp + Thr220Asp

    Gly 97Glu + Ser130Glu + Tyr167Asp + Tyr217Val

    Asn 62Glu + Ala187Gly + Pro210Asp + Ala216Glu

    Ser101Asp + Ser105Asp + Ala216His + Tyr217His

    Ser130Asp + Ser132Glu + Asn212Glu + Ala216Gln

    Ser130Glu + Ser132Glu + Gly160Asp + Thr220Gly

    Gly100Glu + Tyr104Thr + Ser130Asp + Ser132Asp

    Gln 59Ser + Gly160Asp + Gln206Glu + Tyr217Asp

    Gly127Asp + Pro129Glu + Ser188Asp + Gln206Asn

    Ser159Asp + Thr164Glu + Phe189His + Lys213Glu

    Asn 61Asp + Gly 97Asp + Ser159Glu + Thr220Ser

    Ser159Glu + Ser163Glu + Ser204Glu + Tyr217Ser

    Thr158Asp + Ser162Glu + Ala187Pro + Ala216Glu

    Leu 96Val + Thr158Glu + Ser162Asp + Gly219Asp

    Asp 99Glu + Thr158Asp + Ser162Asp + Va1203Met

    Val 95Asp + Gly131Asn + Ser163Asp + Ser191Glu

    Asn 61Glu + Asp 99Glu + Ser204Asp + Tyr217Gly

    Asn 62Asp + Gly166Ser + Ser204Asp + Gly215Glu

    Gly102Asp + Ser105Asp + Tyr167Ala + Gly211Glu

    Ser188Asp + Ser191Glu + Ala216Gly + Tyr217Glu

    Asp 60Glu + Gly 97Asp + Trp106Asn + Ser159Glu

    Thr 66Asp + Leu 96Glu + Phe189Gly + Gly215Asp

    Asn 62Glu + Thr 66Asp + Tyr104Pro + Gly166Asp

    Asn 61Ser + Ala 98Asp + Asn155Asp + Ser188Glu

    Gly100Glu + Tyr104Glu + Ser130Glu + Asn155Gln

    Asp 60Glu + Leu126Asn + Gln206Glu + Lys213Asp

    Ala 98Glu + Gly154Pro + Glu156Asp + Ser188Glu

    Gly128Gln + Ala133Glu + Ala187Glu + Ser191Asp

    Ser101Glu + Gly154Asn + Gly211Glu + Tyr214Glu

    Ser132Asp + Asn155Asp + Thr158Glu + Ala216Thr

    Asn 61Glu + Asn155Asp + Ala187Asp + Asn212Gln

    Gln103Glu + Gly160Asn + Gln206Glu + Asn218Glu

    Gln 59Glu + Gly100Glu + Thr164Pro + Gly211Asp

    Ser 63Glu + Ser101Asp + Gly131Ser + Val203Pro

    Gln 59Asp + Thr 66Asp + Tyr104Val + Ala133Asp

    Ser 63Glu + Ser101Glu + Ala133His + Ala216Glu

    Asp 60Glu + Val 95Ala + Lys213Glu + Tyr217Ala

    Trp106Met + Ser191Glu + Lys213Glu + Gly219Glu

    Ser 63Asp + Gly160Asp + Lys213Asp + Ala216His

    Gly102Asp + Gly157Asn + Ser162Glu + Ser191Glu

    Gln 59Ser + Ser105Asp + Ser162Asp + Ser191Asp

    Gly127Pro + Ser162Glu + Ser191Glu + Asn212Asp

    Ser 63Asp + Ser105Asp + Ser132Asp + Ala216His

    Thr 66Gln + Gly128Glu + Glu156Asp + Ala216Asp

    Gly128Asp + Gly157Asn + Pro210Gln + Thr220Glu

    Glu156Asp + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Asn

    Asp 99Glu + Gly157Pro + Gln206Asp + Lys213Glu

    Ser163Asp + Gln206Asp + Lys213Glu + Tyr217Ala

    Gly154Glu + Ser163Glu + Pro210Gln + Tyr217Asp

    Gly154Asp + Gly157Asn + Ser163Asp + Ser204Glu

    Gly154Ser + Gly157Asp + Lys213Glu + Ala216Glu

    Gly157Ser + Thr158Glu + Lys213Asp + Ala216Asp

    Ser101Glu + Gly154Pro + Lys213Asp + Ala216Glu

    Gly100Asp + Lys213Glu + Ala216Asp + Tyr217Leu

    Asn 62Ser + Thr158Glu + Ser204Asp + Thr220Asp

    Thr 66Asn + Ile107Val + Lys213Asp + Tyr217Asp

    Gly157Asn + Pro201Gln + Lys213Glu + Tyr217Asp

    Gly127Glu + Thr158Pro + Ala187Asp + Ser204Glu

    Asp 99Glu + Ala133Gly + Ser188Glu + Thr220Glu

    Asp 60Glu + Ser188Glu + Gln206Ser + Asn218Glu

    Gln 59Asp + Leu 96Glu + Gly131Gln + Ser132Asp

    Ser101Glu + Pro129Asp + Thr158Asn + Val203Ser

    Ser 63Glu + Ser163Asp + Ala216Asp + Tyr217Gln

    Gly102Gln + Gly160Glu + Ser191Glu + Lys213Glu

    Val 95Glu + Asp 99Glu + Gly215Glu + Asn218Gln

    Ser105Glu + Ala133Glu + Val203Glu + Asn218Gln

    Gln103Asp + Ser132Glu + Ser162Glu + Gln206Ser

    Asp 60Glu + Ser101Asp + Thr164Gly + Lys213Asp

    Gln 59Asp + Asp 99Glu + Gln103Asn + Ala187Pro

    Asp 60Glu + Ser159Asp + Tyr167Leu + Ser188Asp

    Asn 62Glu + Ser163Glu + Gly211Glu + Ala216His

    Asn 62Glu + Ser132Asp + Pro210Gly + Gly211Glu

    Gly102Asn + Ser162Asp + Gln206Asp + Gly219Asp

    Ser188Asp + Ser204Asp + Tyr217Leu + Thr220Gln

    Ser 63Glu + Gly166Gln + Ala216Thr + Asn218Glu

    Glnl03Glu + Gly131Glu + Tyr217Thr + Thr220Glu

    Asp 60Glu + Phe189His + Asn212Glu + Ala216AspAsn155Gln + Gly215Glu + Tyr217Pro + Gly219Asp

    Gly102Asn + Leu126Glu + Ser130Glu + Lys213Asp

    Ala 98Asp + Gly166Glu + Pro210Asp + Tyr214Gln

    Asn 62Glu + Asn155Ser + Lys213Asp + Tyr217Leu

    Asp 60Glu + Ser105Glu + Lys213Glu + Thr220Gln

    Asp 60Glu + Gln206Ser + Lys213Asp + Asn218Asp

    Ser 63Glu + Gly 97Gln + Gln103Asp + Gln206Asp

    Ser 63Glu + Val 95Ala + Ser130Asp + Gln206Asp

    Ser 63Asp + Ile107Met + Ser191Asp + Gln206Asp

    Pro129Asn + Ser130Asp + Lys213Glu + Tyr217Glu

    Pro129Asn + Ser191Glu + Lys213Asp + Tyr217Glu

    Gly 97Gln + Gly102Asp + Pro129Glu + Phe189Gln

    Gln 59Asn + Ser162Glu + Phe189Asp + Ser204Asp

    Gly127Pro + Gly128Glu + Phe189Glu + Ser204Asp

    Leu 96Pro + Ser105Asp + Ser130Glu + Ala133Gly

    Tyr167His + Ser191Glu + Asn212Glu + Asn218Asp

    Asn 61Glu + Thr158Gln + Lys213Asp + Tyr217Asn

    Gln 59Asp + Gly157Asp + Gln206Ser + Asn218Asp

    Gly154Ser + Ser163Glu + Ser188Glu + Ser204Asp

    Leu 96Asn + Ser130Asp + Ser188Asp + Ser204Glu

    Ile107Asp + Ser188Asp + Ser204Asp + Gln206Asn

    Gln206Glu + Ala216Gly + Tyr217Leu + Thr220Asp

    Gly102Glu + Leu126Cys + Ser130Glu + Tyr214Asp

    Asn 62Glu + Gly160Asp + Lys213Glu + Ala216Gly

    Ser101Asp + Trp106Met + Gly154Asp + Ser162Asp

    Asp 60Glu + Gly102Glu + Gln206Asn + Ala216Asp

    Glu156Asp + Gln206Ser + Pro210Asp + Tyr217Asp

    Pro129Glu + Ser159Asp + Gln206Glu + Tyr217Pro

    Pro129Asp + Ser159Glu + Lys213Asp + Tyr217His

    Ser105Glu + Trp106Leu + Gly127Glu + Ser163Glu

    Ser101Asp + Ala133Gln + Ser191Asp + Va1203Asp

    Ser 63Glu + Ser130Asp + Tyr217Gln + Gly219Asp

     Gly131Asp + Ser163Asp + Gly166Asn + Ser204Asp

     Ile107Asp + Gln206Ser + Asn212Glu + Ala216Asp

     Leu126Gly + Ser130Asp + Gly154Asn + Asn218Asp

     Gln 59Asp + Ser105Asp + Gly166Gln + Ser204Asp

     Asn 61Asp + Ser105Glu + Ala187Gln + Ala216Gly

     Ser105Asp + Phe189Ile + Lys213Glu+ Gly219Gln

     Ser 63Glu + Gly131Gln + Ser204Glu + Gly219Asn

     Gly157Pro + Thr164Glu + Gln206Asn + Lys213Asp

     Leu 96Ile + Ser101Asp + Gln206Glu + Tyr214Ala

     Thr 66Gln + Leu 96Met + Tyr167Glu + Ser188Glu

     Tyr104Cys + Gly160Asp + Ile205Pro + Ala216Glu

     Asp 60Glu + Ser130Asp + Pro201Gln + Ala216Gly

     Ile107Asp + Ser191Asp + Gln206Asp + Ala216Thr

     Gln 59Asp + Val 95Asn + Ser101Glu + Ser163Glu

     Val 95Gln + Tyr104Cys + Lys213Glu + Asn218Asp

     Asn 62Asp + Gly 97Asn + Ala 98Ser + Ser162Glu

     Gln103Glu + Ser204Asp + Gln206Asn + Ala216Pro

     Ser101Asp + Ser162Asp + Gly166Ser + Tyr217Thr

     Leu126Ile + Gly128Asp + Pro210Ser + Asn218Glu

     Gly100Glu + Gly160Ser + Gly166Glu + Ala216Thr

     Gln103Asn + Ser132Asp + Ser163Glu + Ser188Asp

                        表25

                  多环五突变变异体

    Val 95Gln + Tyr104Cys + Gly127Gln + Lys213Glu + Ala216Pro

    Asn 61Ser + Leu 96His + Gly157Pro + Val203Asp + Ala216Gly

    Leu 96Gln + Gly127Gln + Glu156Asp + Tyr214Ala + Thr220Asn

    Gly100Gln + Tyr167Cys + Ser188Glu + Val203Gln + Ala216His

    Asn 62Ser + Trp106Gly + Ser132Asp + Ala187Ser + Phe189Ser

    Thr 66Ser + Gly127Gln + Pro201Asn + Ala216Thr + Gly219Asp

    Gly 97Asn + Gly154Pro + Gln206Asn + Pro210Glu + Gly211Pro

    Pro129Gly + Ser132Glu + Thr158Asn + Val165Thr + Gln206Asn

    Gly 65Ser + Gly 97Gln + Gly128Ser + Lys213Asp + Gly219Gln

    Leu 96Met + Gln103Asn + Ala133Ser + Gly154Pro + Gly219Pro

    Asn 61Gln + Trp106Ala + Gly211Pro + Asn218Asp + Gly219Asn

    Thr 66Gly + Tyr104Ile + Gly211Glu + Gly215Pro + Ala216Gly

    Leu126Ile + Ser130Asp + Gly154Asn + Asn212Ser + Tyr217Thr

    Leu126Val + Gln206Ser + Pro210Gly + Gly215Glu + Ala216Pro

    Leu 96Asn + Leu126Pro + Lys213Asp + Ala216Ser + Tyr217His

    Trpl06Asn + Gly127Ser + Ser161Glu + Gln206Asn + Gly219Asn

    Ser101Glu + Gly102Gln + Ile107Gln + Val165Gln + Val203Ala

    Asp 60Glu + Ala 98Gly + Ile107Ser + Gly157Ser + Thr164Ser

    Pro129Glu + Gly160Pro + Gly166Asn + Ala187Pro + Gly202Ser

    Leu 96Ile + Tyr167Thr + Ser188Asp + Val203His + Gln206Ser

    Asn 61Gln + Val 95Asp + Gly102Asn + Gly131Asn + Ala187Asn

    Gly160Asn + Val203Thr + Pro210Glu + Asn218Gln + Thr220Gln

    Gly128Asn + Asn155Glu + Gly166Gln + Ala216Gly + Thr220Gly

    Gly 65Ser + Val 95Met + Gly100Asn + Gly131Asp + Tyr214Gly

    Tyr104Gly + Pro129Ser + Ser163Glu + Gln206Ser + Gly219Ser

    Asn 61Ser + Val 95Gln + Ser204Asp + Pro210Gly + Ala216Gln

    Gly 65Gln + Gly 97Pro + Ser130Glu + Gly154Ser + Pro210Asn

    Trp106Ser + Gly128Asn + Ser159Glu + Pro201Ser + Tyr217Val

    Leu 96Met + Leu126Asn + Asn155Gln + Ser188Glu + Gly202Gln

    Gly100Glu + Thr158Gln + Thr164Asn + Gln206Asn + Ala216Thr

    Asn 62Glu + Leu 96Ile + Gly 97Ser + Gly211Ser + Gly219Ser

    Gly102Asp + Tyr167Ala + Pro210Gly + Ala216Thr + Tyr217Met

    Ser132Glu + Thr158Pro + Phe189Thr + Ala200Gln + Tyr214Ala

    Ala 98Pro + Trp106Pro + Gly160Pro + Ala216Asn + Tyr217Asp

    Gly127Pro + Ala133Asn + Thr164Glu + Gly211Gln + Tyr214Thr

    Gly100Asn + Trp106Pro + Gly127Ser + Lys213Glu + Tyr214Ala

    Gly157Asn + Ser204Asp + Gln206Asn + Tyr217Val + Gly219Pro

    Leu 96Thr + Gly131Asp + Ala133Thr + Gln206Asn + Ala216Gly

    Gly100Ser + Tyr104Ala + Thr164Asp + Gly211Gln + Thr220Ser

    Ser101Asp + Pro129Ser + Phe189Val + Pro201Asn + Ala216Ser

    Thr 66Gly + Gly102Asn + Tyr104His + Trp106Thr + Ala187Asn

    Thr 66Asn + Gly102Glu + Trp106Gly + Gly166Ser + Ala216Thr

    Gly128Gln + Gly154Asn + Tyr167Gly + Tyr217Leu + Asn218Glu

    Ala133Ser + Gly157Ser + Phe189Thr + Gly202Asn + Asn212Glu

    Tyr104Ser + Thr158Gly + Thr164Glu + Gln206Asn + Ala216Pro

    Gln 59Asn + Gln103Asn + Thr164Gly + Ala187Pro + Thr220Asp

    Gly 97Gln + Gly102Asp + Gly127Ser + Phe189Gln + Tyr217Leu

    Thr 66Asn + Gln206Glu + Tyr214Ile + Ala216Thr + Tyr217Cys

    Asp 60Glu + Thr 66Gly + Leu 96Gly + Ala216His + Tyr217Asn

    Ile107Asp + Gly160Asn + Val203Pro + Gly211Pro + Gly219Asn

    Val 95Ser + Trp106Cys + Val165Gln + Pro210Gln + Tyr217Glu

    Trp106Thr + Thr158Ser + Thr164Pro + Ser204Glu + Thr220Pro

    Gly128Pro + Ala187Ser + Gln206Asn + Asn212Ser + Gly215Asp

    Trp106Gln + Leu126Gly + Thr164Ser + Val203Gln + Asn218Asp

    Asp 60Glu + Val 95Gln + Leu126Pro + Gly157Asn + Val203Thr

    Gln 59Asn + Trp106Cys + Ala200Thr + Gly211Gln + Ala216Gln

    Asn 62Ser + Ile107Gly + Leu126Cys + Pro210Glu + Thr220Gly

    Asn 62Gln + Thr158Glu + Val203Ser + Gly215Ser + Ala216Thr

    Gln 59Asn + Asp 60Glu + Trp106Phe + Gly154Gln + Thr208Pro

    Thr 66Ser + Asn155Gln + Val203Gln + Gln206Glu + Tyr217His

    Gly128Pro + Phe189Met + Val203Gly + Ser204Glu + Ala216Glu

    Gln 59Ser + Asn 62Ser + Leu 96Gly + Ser204Glu + Asn218Asp

    Gln103Ser + Gly128Gln + Ser204Glu + Gly211Asn + Asn218Glu

    Gly 97Pro + Pro129Gln + Gly157Asn + Ser204Asp + Asn218Glu

    Leu126Asn + Thr158Gln + Val165Met + Gly211Glu + Lys213Glu

    Gly157Ser + Ser204Glu + Gln206Asp + Tyr217Cys + Thr220Gly

    Ala133Thr + Phe189Ser + Ser204Asp + Gln206Asp + Tyr214Ile

    Gly100Gln + Gly154Asn + Ser204Glu + Gln206Asp + Tyr217Thr

    Gly127Asp + Gly128Glu + Gly154Glu + Gly157Asn + Phe189Ser

    Gly100Gln + Trp106Thr + Ser130Asp + Tyr167Glu + Tyr217Thr

    Glu156Asp + Thr158Asp + Tyr167Gly + Pro201Gln + Gly215Ser

    Gly157Gln + Val203Asp + Ser204Asp + Ala216Pro + Gly219Asp

    Leu126Gly + Pro129Glu + Gly131Glu + Tyr167Met + Thr220Gln

    Leu 96Ser + Ser130Asp + Gly166Glu + Ala216Gln + Tyr217Ile

    Asn155Glu + Gly160Asn + Gly166Glu + Tyr217Cys + Thr220Asp

    Asn 62Asp + Gly 97Gln + Trp106Gly + Pro210Asp + Asn212Gln

    Val 95Asp + Tyr104Glu + Leu126Ser + Asn155Gln + Gln206Ser

    Gly154Glu + Thr158Asp + Phe189Glu + Gly215Asn + Tyr217Met

    Ile107Leu + Gly154Asp + Gly157Glu + Val203His + Gly219Glu

    Trp106Ile + Asn155Ser + Ser159Asp + Ser191Glu + Ala216Thr

    Gly100Asp + Leu126Asp + Gly127Ser + Pro129Gln + Thr220Ser

    Ala133Pro + Gln206Glu + Tyr214Ala + Asn218Glu + Gly219Ser

    Thr 66Gly + Ser101Glu + Gly102Asn + Leu126Glu + Ala216Pro

    Gly100Glu + Gly102Glu + Tyr104Glu + Asn155Gln + Val203Ala

    Leu126His + Ala187Glu + Val203Glu + Gln206Asp + Asn218Glu

    Asp 60Glu + Leu 96Asn + Pro129Gln + Gly211Glu + Tyr217Met

    Leu 96Cys + Ile107Ala + Ala133Pro + Gly157Asp + Gly160Asp

    Ser 63Asp + Thr158Gly + Gln206Asp + Tyr214Asp + Tyr217Asp

    Gln 59Asp + Asn 62Asp + Gly100Glu + Phe189Tyr + Tyr214Met

    Ser101Glu + Gly127Glu + Ala187Gln + Gln206Asn + Tyr217Ile

    Asn 62Asp + Ser 63Glu + Gly100Asp + Gly131Asn + Lys213Glu

    Asp 60Glu + Gly 97Asp + Ala 98Glu + Phe189His + Gly211Glu

    Asp 60Glu + Val 95Glu + Asp 99Glu + Ser101Asp + Val165Thr

    Gly102Gln + Gly154Glu + Asn155Glu + Ser191Asp + Gln206Asp

    Asn 61Ser + Thr 66Ser + Leu126Glu + Asn155Glu + Gly157Asp

    Pro129Asn + Ala133Gln + Phe189Ile + Gln206Glu + Lys213Glu

    Asn 61Ser + Gln206Asp + Lys213Glu + Tyr217Ala + Gly219Asn

    Gln 59Asn + Gly128Asn + Ala200Thr + Gln206Glu + Lys213Glu

    Phe189Gln + Val203Gly + Gln206Asp + Lys213Asp + Tyr217Pro

    Ala 98His + Gly154Glu + Ser163Asp + Val203Met + Tyr217Met

    Leu 96Met + Pro129Gly + Gly154Glu + Ser163Glu + Tyr217Ser

    Gly 97Pro + Ser204Glu + Lys213Asp + Ala216Glu + Gly219Ser

    Val165Ser + Lys213Glu + Tyr214Cys + Ala216Glu + Tyr217Pro

    Ser191Glu + Ser204Glu + Gln206Asp + Tyr214His + Ala216Asp

    Gly102Pro + Asn155Asp + Ala216Glu + Tyr217His + Asn218Glu

    Asn155Asp + Gly215Pro + Ala216Glu + Tyr217Ser + Asn218Glu

    Gly160Ser + Ser204Glu + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Ser

    Ala 98Thr + Ala187Ser + Ser204Glu + Gln206Glu + Lys213Asp

    Gly127Pro + Ser204Glu + Gln206Glu + Lys213Glu + Tyr217Ala

    Leu126Met + Pro129Glu + Ser163Glu + Phe189Thr + Asn218Ser

    Ser101Asp + Ser204Asp + Gln206Glu + Ala216Asn + Tyr217Glu

    Val 95Ala + Tyr167Asp + Ser204Glu + Gln206Glu + Tyr217Glu

    Asn155Glu + Glu156Asp + Thr164Asp + Ser204Glu + Tyr214Thr

    Trp106Pro + Gly127Asp + Ser130Asp + Asn155Asp + Gly219Gln

    Pro129Ser + Ser204Asp + Gln206Glu + Pro210Asp + Asn218Glu

    Tyr104Val + Leu126Asp + Gly157Asp + Ser163Asp + Thr164Asp

    Leu 96Asp + Gly 97Asp + Gln103Asp + Tyr217Cys + Gly219Asp

    Ser159Glu + Asn212Gln + Lys213Glu + Gly215Asp + Ala216Glu

    Gln 59Asp + Asn 62Glu + Ser 63Glu + Pro129Ser + Asn155Asp

    Gln103Ser + Tyr104Ala + Val203Asp + Gln206Asp + Lys213Glu

    Val 95Glu + Glu156Asp + Gly157Asp + Tyr214Gly + Thr220Asp

    Val 95Glu + Gly215Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu + Gly219Ser

    Ser 63Asp + Gly160Asp + Ser161Glu + Va1203Ser + Tyr217Cys

    Gly160Asp + Ser161Asp + Tyr167Met + Ser204Asp + Tyr217Ala

    Leu 96His + Trp106Asp + Gln206Asn + Asn218Asp + Gly219Asp

    Gly100Glu + Ser101Asp + Trp106Met + Ser162Asp + Thr164Pro

    Ser105Glu + Ala187Ser + Va1203Glu + Ser204Asp + Ala216Gly

    Asp 60Glu + Trp106Asn + Va1203Glu + Ser204Glu + Ala216Gln

    Gln103Asp + Ser163Glu + Thr164Glu + Pro201Gln + Ala216Pro

    Val 95Gln + Gly100Asn + Glu156Asp + Gly157Asp + Lys213Glu

    Thr158Asp + Ser159Asp + Ser204Glu + Gly215Asn + Tyr217Cys

    Ser105Asp + Trp106Glu + Thr164Asn + Ala216Asp + Gly219Ser

    Gln 59Glu + Asp 60Glu + Tyr104Asn + Ser191Glu + Pro201Gln

    Gln103Asp + Ser161Glu + Ser162Asp + Gln206Ser + Tyr217His

    Ala 98Asp + Asp 99Glu + Ser105Glu + Thr164Gln + Aia187Ser

    Gly154Asp + Asn155Asp + Ser204Glu + Ala216Gln + Tyr217Ala

    Asn 61Glu + Tyr104Ser + Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Cys

    Gly157Ser + Thr158Glu + Gln206Asp + Lys213Asp + Ala216Asp

    Val 95Thr + Gly157Glu + Ser188Glu + Ser204Glu + Ala216Asp

    Tyr104His + Asn155Glu + Gly157Asn + Tyr167Glu + Gly202Ser

    Gly128Asp + Gly157Asn + Pro210Gln + Asn218Glu + Thr220Glu

    Asn 62Glu + Val 95Ala + Gly100Asp + Lys213Glu + Tyr217His

    Gly166Asp + Gln206Ser + Gly215Pro + Tyr217Asp + Gly219Asp

    Ser130Asp + Ser163Asp + Tyr167Ser + Ser191Asp + Tyr217Met

    Gly 97Pro + Ser132Asp + Thr158Gly + Ser204Glu + Ala216Asp

    Gly154Asp + Ser191Asp + Lys213Asp + Tyr214Ala + Tyr217Asn

    Asn 61Gln + Ile107His + Ser204Glu + Lys213Glu + Asn218Glu

    Gln 59Asp + Ala 98Glu + Gly102Asp + Ser105Glu + Leu209Thr

    Ala133Gly + Gly154Asp + Gln206Glu + Gly215Glu + Thr220Gln

    Gly154Asn + Gly160Ser + Gly166Glu + Gln206Asp + Gly215Asp

    Leu 96Glu + Ala 98Asn + Tyr167Asn + Gln206Glu + Gly215Glu

    Ser162Glu + Thr164Glu + Thr208Gln + Ala216Asp + Tyr217Glu

    Val 95Asp + Ile107Asp + Tyr167His + Ser188Glu + Thr220Asn

    Gly154Glu + Gly166Asp + Lys213Asp + Ala216Ser + Tyr217Cys

    Gly 97Glu + Asp 99Glu + Glu156Asp + Tyr167Ala + Ala216Pro

    Thr 66Gly + Gln103Asp + Trp106Glu + Gly128Asn + Ser162Asp

    Gln103Glu + Ser105Glu + Thr158Ser + Leu209Thr + Lys213Glu

    Thr 66Gln + Thr164Asp + Va1203His + Gly211Glu + Lys213Glu

    Pro129Asn + Gly131Gln + Thr164Glu + Gly211Glu + Lys213Asp

    Ser159Asp + Ser162Glu + Gln206Ser + Pro210Glu + Tyr214Ala

    Asp 99Glu + Ser101Asp + Gly131Asn + Lys213Glu + Gly215Ser

    Gln103Glu + Tyr104Gly + Thr164Pro + Pro210Asp + Asn212Glu

    Asn 62Ser + Ser132Asp + Gly160Glu + Ser162Glu + Ala216His

    Gly160Glu + Ser162Asp + Tyr167Ile + Ser204Glu + Gly219Ser

    Asp 60Glu + Ser 63Asp + Ser130Glu + Gly202Gln + Gly215Ser

    Gly154Glu + Glu156Asp + Pro210Glu + Lys213Asp + Asn218Gln

    Ser105Asp + Trp106Gly + Gly127Asp + Gly154Asp + Val165Gln

    Asn 62Glu + Gly100Glu + Gly157Asn + Gly166Glu + Tyr217Leu

    Asn 62Asp + Pro129Gly + Ala133Gly + Ser204Asp + Gln206Asp

    Asp 60Glu + Gly100Asn + Ser204Asp + Gln206Glu + Pro210Ser

    Ser162Glu + Thr164Glu + Va1203Thr + Ser204Asp + Asn212Ser

    Gly 97Glu + Ser130Glu + Tyr167Asp + Tyr217Val + Gly219Ser

    Gly128Glu + Ser163Glu + Gly166Glu + Gln206Glu + Ala216Ser

    Asp 60Glu + Asn 61Glu + Ala187Gly + Lys213Glu + Ala216Glu

    Gly 97Asp + Ser101Asp + Tyr104Glu + Ser161Glu + Tyr217Val

    Ser 63Glu + Ile107Gln + Gln206Asp + Ala216Asp + Thr220Glu

    Ser130Glu + Ser132Glu + Gly160Asp + Ala216Gln + Thr220Gly

    Val 95Glu + Ser130Asp + Ser132Glu + Ala200Gly + Tyr217His

    Thr 66Gly + Gly100Glu + Gln103Asp + Ser132Asp + Tyr217Asn

    Asp 60Glu + Gly128Glu + Gln206Asn + Pro210Glu + Ala216Gln

    Leu126Val + Thr158Glu + Va1203Met + Lys213Asp + Gly215Glu

    Asp 99Glu + Ser159Glu + Thr164Glu + Tyr167Leu + Gln206Ser

    Val 95Asp + Pro129Asn + Thr164Gln + Ala216Glu + Asn218Glu

    Gly154Asp + Ala187Gly + Gly215Asp + Tyr217Thr + Asn218Glu

    Asn 62Glu + Gly 97Asp + Gly100Asn + Ser204Glu + Tyr217Cys

    Asn 62Glu + Gly 97Asp + Glu156Asp + Val203Cys + Ala216Gly

    Asn 62Asp + Gly 97Asp + Ser204Asp + Tyr214Leu + Tyr217Leu

    Glu156Asp + Ser163Asp + Gln206Ser + Gly215Asp + Ala216Asp

    Ser159Glu + Ser163Glu + Phe189His + Ser204Glu + Tyr217Ser

    Gly100Pro + Asn155Gln + Ser159Asp + Ser163Asp + Ser204Glu

    Gly102Asp + Ala187Asp + Ser188Asp + Va1203His + Ser204Asp

    Asp 99Glu + Thr158Asp + Ser162Asp + Va1203Met + Ala216Thr

    Val 95Cys + Gly 97Pro + Ser163Glu + Serl91Asp + Ser204Asp

    Leu 96Glu + Asp 99Glu + Ser159Glu + Gln206Asn + Ala216Thr

    Gly127Pro + Ser162Glu + Ser191Glu + Gly211Glu + Asn212Asp

    Ser 63Glu + Ser191Asp + Gln206Asp + Ala216Asp + Tyr217Gln

    Ser 63Glu + Phe189Ile + Val203Met + Gln206Asp + Gly211Glu

    Trp106Tyr + Phe189Asp + Pro210Asp + Lys213Glu + Asn218Glu

    Ser191Glu + Gln206Glu + Ala216Gly + Tyr217Leu + Thr220Asp

    Val 95Gly + Thr158Asp + Ser161Asp + Ala187Pro + Asn218Asp

    Thr 66Glu + Gly166Glu + Phe189Val + Ser191Glu + Gly219Ser

    Asp 60Glu + Asp 99Glu + Gln206Glu + Gly211Pro + Ala216Glu

    Asn 61Asp + Ser 63Asp + Gln103Glu + Lys213Asp + Tyr217Pro

    Tyr104Glu + Gly128Gln + Ser132Glu + Asn212Asp + Ala216Ser

    Asn 62Asp + Ser204Asp + Gly215Glu + Ala216Gln + Tyr217Leu

    Asn 61Asp + Gly100Asp + Trp106Ala + Asn212Gln + Lys213Asp

    Gly127Glu + Gly157Gln + Ser204Asp + Lys213Asp + Ala216Glu

    Leu 96Glu + Gly97Ser + Gly100Glu + Gln206Asp + Lys213Asp

    Asp 60Glu + Leu 96Cys + Gly 97Glu + Ser204Glu + Gly215Asn

    Tyr167Pro + Ser204Asp + Lys213Glu + Ala216His + Gly219Glu

    Gly 97Ser + Ser105Asp + Asn155Glu + Gly166Asp + Va1203Asn

    Gly102Asn + Gly160Asn + Thr164Glu + Gln206Asn + Thr220Asp

    Asn 61Ser + Ala 98Asp + Asn155Asp + Ser188Glu + Va1203Ser

    Glu156Asp + Ser204Asp + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Pro

    Asp 99Glu + Gly157Pro + Ser204Glu + Gln206Asp + Lys213Glu

    Ser130Asp + Gly160Asn + Ser204Glu + Gln206Asn + Gly215Asp

    Gly127Glu + Glu156Asp + Ser204Glu + Gln206Asp + Tyr214Pro

    Ala 98Glu + Asp 99Glu + Trp106Gly + Gly154Asp + Asn218Glu

    Gln 59Ser + Val 95Glu + Ala 98Asn + Ser105Glu + Gln206Glu

    Gly 97Pro + Gly128Glu + Lys213Asp + Ala216Glu + Asn218Glu

    Gln103Asp + Ile107Asp + Gly157Pro + Tyr167Glu + Ala216Glu

    Asp 60Glu + Gln206Glu + Lys213Asp + Gly215Pro + Asn218Glu

    Ser130Glu + Thr164Glu + Va1203Met + Ser204Asp + Gln206Asp

    Asp 60Glu + Ser 63Glu + Gly154Asp + Gly166Ser + Ser188Asp

    Leu 96His + Ser130Glu + Glu156Asp + Tyr167Glu + Lys213Glu

    Gln 59Ser + Glu156Asp + Gly160Glu + Gly211Glu + Lys213Glu

    Gly127Glu + Asn155Asp + Ala187His + Ala216Glu + Tyr217His

    Gln103Glu + Gly160Asn + Gln206Glu + Tyr214Gly + Asn218Glu

    Ser 63Asp + Gly202Pro + Lys213Asp + Gly215Gln + Asn218Asp

    Asp 60Glu + Leu 96Glu + Thr158Gln + Gly166Pro + Gln206Asp

    Gly 97Asp + Gln103Asp + Phe189Ala + Gln206Ser + Lys213Asp

    Asn 62Asp + Thr 66Glu + Tyr104Pro + Ser132Asp + Asn212Asp

    Ala 98Pro + Pro129Asp + Ser130Asp + Lys213Glu + Tyr217Glu

    Ser 63Asp + Glu156Asp + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Pro

    Asp 60Glu + Gly102Gln + Ser105Glu + Thr164Gln + Gly211Glu

    Asp 60Glu + Thr158Gln + Lys213Glu + Ala216Gln + Tyr217Val

    Ile107Asp + Gly131Asp + Ala216Asp + Tyr217His + Asn218Asp

    Ser 63Asp + Gly100Glu + Gln103Asp + Gln206Asn + Gly219Asp

    Asn155Glu + Gly157Glu + Gln206Asn + Pro210Asp + Ala216Glu

    Ser 63Asp + Ile107Met + Pro129Asn + Ser191Asp + Gly219Glu

    Ser 63Asp + Val 95Ala + Asp 99Glu + Leu126Thr + Ser163Asp

    Thr 66Glu + Gly100Gln + Gln103Asp + Lys213Asp + Ala216Asn

    Thr158Asp + Ser161Asp + Gln206Asp + Tyr217Cys + Gly219Asp

    Ser 63Glu + Ser162Asp + Ala187Gln + Gly211Asn + Lys213Asp

    Gly 97Ser + Ser101Asp + Val203Cys + Tyr214Glu + Tyr217Asp

    Val 95Glu + Asp 99Glu + Ser204Asp + Gly215Glu + Asn218Gln

    Gln 59Glu + Thr 66Asp + Ser163Asp + Pro201Gln + Gly215Glu

    Ala 98His + Ser101Glu + Gly166Gln + Ser188Asp + Val203Asp

    Ser 63Asp + Gly160Asp + Val203Ala + Ser204Asp + Gln206Glu

    Gly127Glu + Ser162Glu + Ser163Glu + Lys213Asp + Ala216His

    Ser162Asp + Ala187Glu + Pro201Gln + Gln206Asp + Tyr217Glu

    Gly157Glu + Phe189Tyr + Val203Glu + Ser204Glu + Lys213Glu

    Gly160Glu + Ser161Asp + Tyr167Glu + Gly202Asn + Gln206Glu

    Asp 60Glu + Ser159Asp + Thr164Glu + Phe189His + Lys213Glu

    Tyr104Cys + Ser162Glu + Lys213Glu + Asn218Asp + Gly219Glu

    Tyr104Asp + Gly128Asn + Ser130Asp + G1y157Ser + Ser204Glu

    Ser132Glu + Gly157Ser + Ser163Asp + Asn212Asp + Lys213Glu

    Gly 97Asp + Ala 98Asp + Pro129Glu + Tyr167Leu + Gln206Asp

    Ser101Glu + Thr158Gln + Ala187Glu + Ser188Glu + Gln206Glu

    Asp 99Glu + Gly100Asp + Asn155Asp + Gly166Gln + Ser204Glu

    Ser130Glu + Ser161Glu + Ser162Asp + Thr164Asn + Gly211Asp

    Gln 59Asn + Tyr104Asp + Thr158Asp + Ser191Glu + Asn218Glu

    Asp 60Glu + Ser101Glu + Ser204Glu + Gln206Ser + Pro210Asp

    Ser130Asp + Ser159Asp + Ser163Glu + Pro210Gln + Tyr217Asp

    Asn 61Asp + Gly100Asp + Trp106Pro + Gly128Glu + Tyr217Asp

    Gly102Pro + Gly131Asp + Ser188Asp + Ser204Glu + Gln206Glu

    Glu156Asp + Ser204Asp + Gln206Asp + Asn212Asp + Ala216His

    Thr 66Pro + Gln103Asp + Glu156Asp + Ser191Glu + Gln206Asp

    Gly131Pro + Phe189Leu + Ser191Glu + Gln206Glu + Lys213Glu

    Ala 98Glu + Gly157Ser + Gln206Asp + Lys213Asp + Gly215Gln

    Tyr104Leu + Thr158Glu + Gly202Ser + Gln206Glu + Lys213Glu

    Ser 63Glu + Ala 98Gln + Gly102Asn + Ser130Asp + Tyr217Glu

    Thr158Glu + Gly166Asn + Pro210Glu + Lys213Glu + Thr220Glu

    Trp106Thr + Gly154Ser + Gly157Asp + Lys213Glu + Ala216Glu

    Ala 98Ser + Ala187Glu + Lys213Asp + Gly215Gln + Ala216Asp

    Tyr104Pro + Ser159Asp + Gly202Asn + Lys213Glu + Ala216Asp

    Leu126Asn + Asn155Glu + Thr164Asn + Lys213Asp + Ala216Glu

    Ser161Asp + Val203His + Ser204Asp + Gly211Asp + Tyr217Asp

    Asn 61Asp + Ser163Asp + Val203His + Ser204Glu + Tyr217Asp

    Val 95Asp + Trp106Glu + Ser161Glu + Ala187Pro + Ser204Asp

    Leu 96Glu + Gly100Asp + Trp106Cys + Ser188Glu + Gln206Asp

    Ser101Glu + Ser204Asp + Gly211Glu + Lys213Asp + Gly215Asn

    Asp 99Glu + Ser159Glu + Ser162Glu + Ser204Asp + Gly219Asn

    Leu 96Ala + Gln103Asp + Leu126Val + Gly128Asp + Ser204Asp

    Ala 98Glu + Ser105Glu + Gly154Glu + Glu156Asp + Phe189Pro

    Asn 61Glu + Ser159Glu + Gln206Ser + Pro210Glu + Ala216Glu

    Gly 97Asp + Ser101Asp + Ala133Glu + Gln206Glu + Gly219Pro

    Leu126Ala + Gly131Glu + Ser204Glu + Pro210Asp + Lys213Glu

    Val 95Glu + Ala 98Asn + Gly102Glu + Ser162Asp + Ser204Glu

    Asn 61Glu + Gly100Asn + Pro129Asp + Ser163Glu + Asn218Ser

    Gly102Asp + Gly127Ser + Thr158Asp + Gly160Glu + Lys213Glu

    Ser130Asp + Asn155Gln + Thr158Glu + Ser191Asp + Gly215Glu

    Ala133Asp + Ser159Glu + Ser161Asp + Ser204Asp + Ala216Gln

    Ser132Glu + Thr164Asp + Ser204Asp + Gln206Glu + Tyr217Pro

    Gly157Glu + Tyr167Asp + Ser204Glu + Gln206Glu + Ala216Asn

    Thr 66Ser + Ser130Glu + Thr158Glu + Ser204Glu + Gln206Glu

    Asp 99Glu + Ser159Glu + Ser204Glu + Gln206Glu + Tyr217Pro

    Thr 66Ser + Ser105Asp + Ser159Glu + Ser204Glu + Gln206Asp

    Asp 60Glu + Gly127Asp + Ser204Glu + Gln206Glu + Tyr214Asn

    Ser 63Glu + Ser130Asp + Gln206Asp + Ala216Gly + Asn218Asp

    Pro129Gly + Ser159Glu + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser204Asp

    Gly131Asp + Glu156Asp + Ser162Glu + Ala187Pro + Tyr214Gly

    Gly102Asp + Trp106Glu + Ser159Glu + Pro210Gln + Thr220Asp

    Gly131Asp + Ser161Asp + Ser163Asp + Gly166Asn + Ser204Asp

    Gln 59Asn + Ser188Asp + Gln206Asp + Gly211Glu + Tyr217Glu

    Ala 98Glu + Gly157Asp + Thr164Asp + Phe189Thr + Lys213Asp

    Gln103Asp + Trp106Tyr + Gly160Asp + Lys213Glu + Gly215Asp

    Val 95Asp + Gly131Gln + Ser159Asp + Ala216Asp + Asn218Asp

    Ser101Asp + Gln103Glu + Ser161Glu + Gln206Glu + Ala216His

    Thr 66Glu + Gly128Pro + Gly154Asp + Thr164Asp + Ser204Glu

    Val 95Asp + Gly131Glu + Ser163Asp + Ser191Glu + Gln206Asn

    Val 95Ser + Ala 98Glu + Ser101Asp + Gly131Asp + Phe189Asp

    Asn 62Asp + Leu126His + Gly131Pro + Lys213Glu + Tyr217Asp

    Ser 63Asp + Ser130Glu + Thr158Pro + Ala216Glu + Tyr217Ile

    Gln 59Asp + Gly157Asp + Gln206Glu + Tyr214Val + Asn2I8Asp

    Val 95Glu + Asp 99Glu + Gly215Asp + Ala216Asn + Tyr217Ile

    Ser132Glu + Gly154Gln + Gly157Glu + Ser161Asp + Tyr214Ser

    Ser101Asp + Gly131Pro + Ser188Asp + Ser191Glu + Gln206Glu

    Thr 66Asp + Leu 96Glu + Glu156Asp + Va1203His + Gly215Asp

    Asn 62Glu + Gly166Gln + Ser188Glu + Gly211Glu + Ala216His

    Ile107Asp + Ala187Asp + Ser191Asp + Gln206Asp + Ala216Thr

    Ser105Asp + Ser159Glu + Ser191Asp + Lys213Asp + Ala216Thr

    Asn155Asp + Ser163Asp + Val165Asn + Gln206Ser + Lys213Glu

    Ser101Glu + Gly131Asn + Asn155Glu + Ala187Glu + Lys213Asp

    Gln 59Glu + Gly160Asp + Ser188Asp + Va1203Glu + Tyr217Ile

    Ala133Asp + Ser161Glu + Thr164Asp + Ser204Asp + Asn218Ser

    Gln103Glu + Tyr104Cys + Ser161Glu + Thr164Asp + Lys213Glu

    Ser 63Glu + Gly160Asp + Tyr167Met + Lys213Asp + Asn218Asp

    Ser101Glu + Leu126Glu + Ser188Glu + Lys213Asp + Ala216Asn

    Asp 60Glu + Leu 96Glu + Gly128Asn + Ser130Glu + Gln206Glu

    Gln103Ser + Ser130Asp + Ala133Gly + Gln206Glu + Gly219Asp

    Gly102Asn + Ser162Asp + Gln206Asp + Tyr217Gly + Gly219Asp

    Thr 66Gln + Asp 99Glu + Gln103Glu + Val203Ser + Tyr217Asp

    Asp 99Glu + Gln103Asp + Gly157Asn + Lys213Asp + Ala216Gln

    Thr 66Asp + Pro129Asp + Ser159Glu + Lys213Asp + Tyr217His

    Ser 63Asp + Gly 97Asp + Tyr167Ala + Ser188Asp + Ser204Glu

    Gly102Pro + Tyr104Ala + Glu156Asp + Tyr167Glu + Ser204Glu

    Gln 59Glu + Asn 62Gln + Glnl03Glu + Gly131Glu + Phe189Leu

    Asp 60Glu + Ser162Glu + Ala200Gln + Val203Glu + Gly211Asp

    Asp 60Glu + Ile107Glu + Gly157Asp + Gly160Glu + Phe189Ser

    Serl01Asp + Gly102Ser + Tyrl04Glu + Phe189Asp + Lys213Glu

    Ser101Asp + Serl05Asp + Val203Asp + Ala216His + Tyr217His

    Ser132Asp + Asn155Glu + Gly211Pro + Lys213Glu + Asn218Asp

    Gln103Asp + Gly128Asp + Ser163Asp + Ala187Glu + Tyr217Ile

    Leu 96Ile + Gly128Asp + Ser191Glu + Gly202Asn + Gln206Glu

    Thr 66Glu + Gln103Asp + Ser204Glu + Lys213Asp + Gly219Ser

    Ala 98Asp + Ser132Asp + Gly166Glu + Pro210Asp + Tyr214Gln

    Ser 63Glu + Pro129Glu + Val203Met + Lys213Glu + Gly219Asp

    Gln 59Glu + Gly 97Asp + Gly128Asp + Ser159Glu + Ala216Ser

    Ser 63Glu + Gln103Glu + Ile107Ser + Glu156Asp + Lys213Asp

    Gly102Asp + Gly157Asn + Ser162Glu + Ser191Glu + Ser204Glu

    Ser105Asp + Ser162Asp + Ser191Asp + Pro210Gly + Gly211Glu

    Asp 60Glu + Val 95Glu + Trp106Gly + Pro129Glu + Ser159Asp

    Ser101Glu + Trp106Asp + Thr164Glu + Ser204Asp + Pro210Ser

    Gln 59Glu + Gly100Gln + Gly157Asp + Gly211Asp + Tyr217Glu

    Gly 97Asp + Ser130Asp + Gln206Asp + Lys213Asp + Ala216Asn

    Tyr104Asp + Gly154Asp + Gly160Asn + Ser163Asp + Ser204Glu

    Ser132Glu + Gly154Glu + Ser163Glu + Pro210Gly + Asn212Asp

    Leu 96Thr + Ala133Glu + Asn155Glu + Lys213Asp + Ala216Asp

    Asp 60Glu + Asp 99Glu + Leu126Gly + Ser130Asp + Ser162GluII.清洁组合物

    在本发明的另一个实施方案中，有效量的一种或多种酶变异体被包含于用于清洁各种表面，去除蛋白质类的污物的组合物中。这样的清洁组合物包括用于清洁硬表面的清洁剂组合物，不限形式(例如液体或颗粒)；用于清洁织物的清洁剂组合物，不限形式(例如颗粒、液体和条状固体配方)；洗涤碗碟组合物(不限形式)；口腔清洁组合物，不限形式(例如牙粉、牙膏和口腔洗涤剂配方)；假牙清洁组合物，不限形式(例如液体、片剂)；和接触透镜(contact lens)清洁组合物，不限形式(例如液体、片剂)。

    除了前述的BPN’变异体，清洁组合物还包括一种或多种与蛋白酶相容的清洁组合物材料。此处使用的名词“清洁组合物材料”意思是为所需要的特定类型的清洁组合物而选择的任何液体、固体或气体材料，以及产品的形式(例如液体、颗粒、条状固体、喷剂、棒状固体、糊剂、乳胶剂)，该材料还还与组合物中使用的BPN’变异体相容。清洁组合物材料的特定选择是在考虑了将被清洁的表面材料，以及为使用过程中清洁状况而选定的组合物形式(例如，通过清洁剂使用)。此处使用的名词“相容”意思是清洁组合物材料没有在如下程度上降低BPN’变异体的蛋白水解活性，即蛋白酶不象在正常的使用情况下使用时那么有效。下面将举例说明特定的清洁组合物材料。

    此处所使用的名词“有效量的酶变异体”指在特定的清洁组合物中达到必要的酶活性的必要的酶变异体的数量。该有效量可以被本领域中一种普通的方法很容易地测定，有效量基于许多因素，例如所使用的特殊的酶变异体，清洁应用，特定的清洁组合物，以及是否需要液体或干组合物(例如颗粒、条状固体)，以及类似的因素。优选的清洁组合物包含大约0.0001％至大约10％的一种或多种本发明的酶变异体，更优选的是从大约0.001％至大约1％，还要优选的是从大约0.01％至大约0.1％。下面是进一步详细讨论各种清洁组合物的几个实例，其中可能用到酶变异体。对于所有的部分，除非特别说明，此处使用的百分比和比例都是重量比。

    此处所使用的名词“非织物清洁组合物”包括硬表面清洁组合物、碗碟洗涤组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物以及接触透镜清洁组合物。A.用于硬表面、碗碟和织物的清洁组合物

    本发明的酶变异体可以被用于多种多样的，需要有高泡并清除溶解性良好的底物的清洁剂组合物。于是酶变异体可以与许多常规成分一起使用，来提供全配方的硬表面清洁剂、碗碟洗涤组合物、织物清洁组合物以及其它类似的清洁剂。这样的组合物可以以液体、颗粒、条状固体以及其它类似的形式存在。这样的组合物可以被描述为现代的“浓缩”清洁剂，它包含有重量百分比为30％-60％的表面活性剂。

    此处的清洁组合物可以有选择地、优选地包含各种阴离子、非离子、两性离子等表面活性剂。这样的表面活性剂的含量水平通常是组合物的5％至35％。

    此处有用的表面活性剂的非限定性的实施例包括常规的C11-C18烷基苯磺酸盐和伯烷基的以及无规烷基硫酸盐、分子式为CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸盐，其中的x和(y+1)是不小于大约7的整数，最好不小于9，并且M是水溶阳离子，尤其是钠，C10-C18烷基烷氧基硫酸盐(尤其是EO 1-5乙氧基硫酸盐)，C10-C18烷基烷氧基羧酸盐(尤其是EO 1-5乙氧基羧酸盐)、C10-C18烷基多聚糖苷以及它们相应的多聚糖苷硫酸盐，C12-C18α磺化脂肪酸酯，C12-C18烷基和烷基酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜碱和硫代甜菜碱(“sultaines”)，C10-C18胺氧化物等。烷基烷氧基硫酸盐(AES)和烷基烷氧基羧酸盐(AEC)在此处是优选的。(与上文提及的胺氧化物和/或甜菜碱或硫代甜菜碱这样的表面活性剂结合使用也是优选的，这依赖于配制者的需要。)其它常规的有用的表面活性剂被列于标准文本中。特别有用的表面活性剂包括C10-C18 N-甲基葡萄糖酰胺，它公开于美国专利第5,194,639号，Connor等，颁布于1993年3月16日，此处作为文献引用。

    清洁剂清洁组合物中有多种多样的其它的有用成分可以包含于此处的组合物中，包括其它的活性成分、载体、水溶助长剂、加工助剂、染料或色素、液体制剂的溶剂等。如果想要更多的发泡量，泡沫增强剂例如C10-C16链烷酰胺(alkolamides)可以加入该组合物中，通常是约1％至约10％的水平。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺代表这类包沫增强剂的一个典型类别。将这样的泡沫增强剂与高泡添加剂表面活性剂，例如上文提及的胺氧化物、甜菜碱和硫代甜菜碱一起使用也是有益的。如果需要，可以加入可溶性镁盐，如MgCl2、MgSO4等，通常从约0.1％至约2％的水平，以提供更多的泡沫。

    此处的液体清洁剂组合物可以包含水和其它的溶剂作为载体。低分子量的伯或仲醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇是适合的。一元醇是加溶表面活性剂的优选物，但是多元醇例如那些含有约2至6个碳原子的和约2至6个羟基团的(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)醇类也可以使用。组合物中可能包含约5％至90％这样的载体，典型的是约10％至50％。

    这里的清洁剂组合物优选地被配制为是：在水溶液洗涤操作过程中使用时，洗涤水的pH值将是从约6.8至约11.0。终产品典型地被配制在此范围之内。在推荐的使用水平控制pH值的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的专业人员所熟知的。

    当配制本发明的硬表面清洁组合物和织物清洁组合物时，配制者可能希望在约5％至50％重量比水平的使用各种助洗剂。典型的助洗剂包括1-10微米的沸石、多聚羧化物，例如柠檬酸盐和羟基丁二酸氢盐、层积硅酸盐、磷酸盐等。其它的常规的助洗剂列于标准配方表中。

    同样地，配方师可能希望在这样的组合物中使用各种常规的添加酶，例如纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，典型的含量水平是重量比从约0.001％至约1％。各种清洁剂和织物清洁酶是洗衣清洁剂领域所熟知的。

    各种漂白物质可以被用于该组合物，例如过碳酸盐、过硼酸盐等，典型的含量水平是重量比从约1％至约15％。如果需要，这样的组合物还可以包含漂白激活剂，例如四乙酰乙二胺、壬酰苯酚磺酸盐等，它们也是本领域熟知的。使用量的典型范围是重量比从约1％至10％。

    各种污物清除剂，尤其是阴离子寡酯类，各种螯合剂，尤其是氨基磷酸盐和乙二胺二琥珀酸盐、各种粘土污物清除剂，尤其是乙氧基化的四乙基戊胺，各种分散剂，尤其是聚丙烯酸酯和聚天门冬氨酸酯，各种增白剂，尤其是阴离子增白剂，各种消泡剂，尤其是硅氧化和仲醇，各种织物柔顺剂，尤其是绿土，以及类似物都可以被用于该组合物，含量水平范围从重量比约1％至约35％。标准的配方表和公开的专利包含这些常规物质的多种、详尽的描述。

    酶稳定剂也可以被用于该清洁组合物。这样的酶稳定剂包括丙二醇(优选的是从约1％至约10％)、甲酸钠(优选的是从约0.1％至约1％)和甲酸钙(优选的是从约0.1％至约1％)。1.硬表面清洁组合物

    这里所使用的“硬表面清洁组合物”是指用于清洁例如地板、墙壁、卫生间瓷砖等硬表面的液体的和颗粒的清洁剂组合物。本发明的硬表面清洁剂组合物包括有效量的一种或多种本发明的酶变异体，优选的活性酶在该组合物中的含量是重量比从约0.001％至约10％，更优选的是从约0.01％至约5％，还要优选的是从约0.05％至约1％。除包含一种或多种酶变异体之外，这样的硬表面清洁组合物通常包括表面活性剂和水溶性螯合助洗剂。但是在一些特殊的产品中，例如窗户喷洒清洁剂，有时并不使用表面活性剂，因为它们可能在玻璃表面产生薄膜状的/斑点状的残迹。

    当含有表面活性成分时，它的含量可能只有该组合物的0.1％，但是典型的组合物中含有从约0.25％至约10％的表面活性剂，优选的是从约1％至约5％。

    典型的组合物包含从约0.5％至约50％的清洁助洗剂，优选的是从约1％至约10％。

    优选的pH值是在8至12的范围内。如果需要调节，可以使用常规的pH值调节剂，例如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸。

    组合物中可能包含溶剂。有用的溶剂包括但不限于乙二醇醚，例如二甘醇单己基醚、二甘醇单丁基醚、乙二醇单丁基醚、丙二醇单丁基醚、二丙基乙二醇单丁基醚，和二醇例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。当使用时，这样的溶剂的典型含量从约0.5％至约15％，优选的是从约3％至约11％。

    另外，在表面上“全浓度”使用该组合物之后若没有清洗表面，可以在本发明的组合物中使用例如异丙醇或乙醇的高挥发溶剂，使得组合物从表面的蒸发得更快、更容易。当使用时，挥发溶剂在组合物中的典型含量水平从约2％至约12％。

    本发明的硬表面清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。

                    实施例7-12

                液体硬表面清洁组合物

                                 实施例编号

      成分        7       8       9       10      11     12

    Ser105Glu    0.05    0.50    0.02    0.03    0.10    0.03

    Gly127Gln+   -        -       -       -     0.20    0.02

    Ala216Pro

    Na2DIDA*

    EDTA**       -        -     2.90    2.90      -       -

    柠檬酸钠      -        -       -       -     2.90    2.90十二烷基苯磺酸钠 1.95      -     1.95      -     1.95      -十二烷基硫酸钠    -      2.20      -     2.20      -     2.20十二烷基(乙氧基)硫-      2.20      -     2.20      -     2.20

    酸钠十二烷基二甲胺氧  -      0.05      -     0.05      -     0.05

    化物异丙基苯磺酸钠   1.30      -     1.30      -     1.30      -  己基卡必醇*** 6.30    6.30    6.30    6.30    6.30    6.30

    水****                          补充至100％  *N-二甘醇-N，N-亚氨基二乙酸二钠  **乙二胺二乙酸钠  ***二甘醇单己基醚  ****所有配剂调至pH7  在实施例7-10中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸105谷氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例11-12中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被甘氨酸127谷氨酰胺+丙氨酸216脯氨酸所取代，结果大体上相同。

                       实施例13-18

           用于清洁硬表面和家居除霉的喷洒组合物

                                   实施例编号

        成分            13    14    15    16    17    18Tyr104Ile+Gly215Pro    0.50  0.05  0.60  0.30  0.20  0.30

    Asp99Glu             -     -     -     -   0.30  0.10

    辛基硫酸钠         2.00  2.00  2.00  2.00  2.00  2.00十二烷基硫酸钠         4.00  4.00  4.00  4.00  4.00  4.00

    氢氧化钠           0.80  0.80  0.80  0.80  0.80  0.80

    硅酸(钠)盐         0.04  0.04  0.04  0.04  0.04  0.04

    香味剂             0.35  0.35  0.35  0.35  0.35  0.35

    水                           补充至100％产物pH调至7。

    在实施例17-18中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被酪氨酸104异亮氨酸+甘氨酸215脯氨酸所取代，结果大体上相同。    在实施例17-18中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被酪氨酸104异亮氨酸+甘氨酸215脯氨酸所取代，结果大体上相同。2.碗碟洗涤组合物

    在本发明的另一个实施方案中，碗碟洗涤组合物中包含本发明的一种或多种酶变异体。这里所使用的“碗碟洗涤组合物”是指用于洗涤碗碟的组合物的所有形式，包括但不限于颗粒和液体形式。本发明的碗碟洗涤组合物的实施方案用下列实施例说明。

                        实施例19-24

                   碗碟清洁组合物

                                       实施例编号

        成分              19    20    21    22    23    24Glu59Ser+Leu96Gly+S      0.05  0.50  0.02  0.40  0.10  0.03

    er204GluLys96Gly+Ser204Glu        -      -     -     -   0.40  0.0212-14烷基-N-甲基-葡      0.90  0.90  0.90  0.90  0.90  0.90

    萄糖酰胺十二烷基乙氧基(1)        12.00 12.00 12.00 12.00 12.00 12.00

    硫酸盐 2-甲基十-烷酸           4.50  4.50  4.50  4.50  4.50  4.50十二烷基乙氧基(2)羧      4.50  4.50  4.50  4.50  4.50  4.50

    酸盐十二烷醇乙氧酸盐(4)      3.00  3.00  3.00  3.00  3.00  3.00十二烷基胺氧化物         3.00  3.00  3.00  3.00  3.00  3.00  异丙基苯碳酸钠         2.00  2.00  2.00  2.00  2.00  2.00

    乙醇                 4.00  4.00  4.00  4.00  4.00  4.00  Mg++(如氯化镁)        0.20  0.20  0.20  0.20  0.20  0.20  Ca++(如氯化钙)        0.40  0.40  0.40  0.40  0.40  0.40

    水                                补充至100％

    产物pH调至7。

    在实施例19-22中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被谷氨酰胺59S丝氨酸+亮氨酸96甘氨酸+丝氨酸204谷氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例23-24中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被谷氨酰胺59S丝氨酸+亮氨酸96甘氨酸+丝氨酸204谷氨酸和赖氨酸96甘氨酸+丝氨酸204谷氨酸所取代，结果大体上相同。3.织物清洁组合物

    在本发明的另一个实施方案中，织物清洁组合物包含一种或多种本发明的酶变异体。这里所使用的“织物清洁组合物”是指用于清洗织物的清洁剂组合物的所有形式，包括但不限于颗粒、液体和条状形式。优选的织物清洁组合物是液体形式的。a.颗粒状织物清洁组合物

    本发明的颗粒状的织物清洁组合物包含有效量的一种或多种本发明的酶变异体，优选的活性酶在该组合物中的含量是重量比从约0.001％至约10％，更优选的是从约0.005％至约5％，还要优选的是从约0.01％至约1％。除包含一种或多种酶变异体之外，该颗粒状的织物清洁组合物通常包括至少一种表面活性剂、一种或多种助洗剂，并且在某些情况下，包含漂白剂。

    本发明的颗粒状的织物清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。

                  实施例25-28

               颗粒状织物清洁组合物

                                 实施例编号

      成分              25     26       27      28

    Ser101Asp          0.10   0.20     0.03     0.05

    Thr66Glu             -     -       0.02     0.05  十三链烷基苯磺酸     22.00  22.00    22.00    22.00磷酸盐(如三聚磷酸钠)   23.00  23.00    23.00    23.00

    碳酸钠             23.00  23.00    23.00    23.00

    硅酸钠             14.00  14.00    14.00    14.00

    沸石               8.20   8.20     8.20     8.20螯合剂(二亚乙基三胺五乙0.40   0.40     0.40     0.40

    酸)

    硫酸钠             5.50   5.50     5.50     5.50

    水                         补充至100％

    在实施例25-26中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体被丝氨酸101天门冬氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例27-28中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被丝氨酸101天门冬氨酸和苏氨酸66谷氨酸所取代，结果大体上相同。

                  实施例29-32

              颗粒状织物清洁组合物

                                  实施例编号

      成分                     29    30    31    32Val95Asp+Leu126Ser+Asn155Gln  0.10  0.20  0.03  0.05Gly65Ser+Gly102Asn+Val203Glu    -    -    0.02  0.05

    十二烷基苯磺酸            12.00 12.00 12.00 12.00

    沸石A(1-10μm)            26.00 26.00 26.00 26.00

    2-丁基辛酸                4.00  4.00  4.00  4.0012-14仲(2，3)烷基硫酸盐，钠盐 5.00  5.00  5.00  5.00

    柠檬酸钠                  5.00  5.00  5.00  5.00

    光学增亮剂                0.10  0.10  0.10  0.10

    硫酸钠                    17.00 17.00 17.00 17.00

    水和微量物质                   补充至100％

    在实施例29-30中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体被缬氨酸95天门冬氨酸+亮氨酸126丝氨酸+天门冬酰胺155谷氨酰胺所取代，结果大体上相同。

    在实施例31-32中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被缬氨酸95天门冬氨酸+亮氨酸126丝氨酸+天门冬酰胺155谷氨酰胺和甘氨酸65丝氨酸+甘氨酸102天门冬酰胺+缬氨酸203谷氨酸所取代，结果大体上相同。

                  实施例33-36

                颗粒状织物清洁剂

                              实施例编号

      成分               33      34      35      36

    Ser63Glu            0.10    0.20    0.03    0.05  Leu96Asn+Lys213Asp      -       -     0.02    0.05  十三链烷基苯磺酸      22.00   22.00   22.00   22.00磷酸盐(如三聚磷酸钠)    23.00   23.00   23.00   23.00

    碳酸钠              23.00   23.00   23.00   23.00

    柠檬酸钠            14.00   14.00   14.00   14.00

    沸石                8.20    8.20    8.20    8.20螯合剂(二亚乙基三胺五乙 0.40    0.40    0.40    0.40

    酸)

    硫酸钠              5.50    5.50    5.50    5.50

      水                        补充至100％

    在实施例33-34中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体被丝氨酸63谷氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例35-36中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被丝氨酸63谷氨酸和亮氨酸96天门冬酰胺+赖氨酸213天门冬氨酸所取代，结果大体上相同。

                            实施例37-40

                        颗粒状织物清洁组合物

                                      实施例编号

        成分                    37    38    39   40Asn62Ser+Ser163Asp+Phe189Ser+  0.10  0.20  0.03  0.05

    Ala216GluGly97Ser+Trp106Ile+Tyr217Leu    -     -    0.02  0.05

    十二烷基苯磺酸             12.00 12.00 12.00 12.00

    沸石(1-10μm)              26.00 26.00 26.00 26.00

    2-丁基辛酸                 4.00  4.00  4.00  4.0012-14仲烷基(2，3)硫酸盐，钠盐  5.00  5.00  5.00  5.00

    柠檬酸钠                   5.00  5.00  5.00  5.00

    光学增亮剂                 0.10  0.10  0.10  0.10

    硫酸钠                     17.00 17.00 17.00 17.00

    水和微量物质                   补充至100％

    在实施例37-38中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体被天门冬酰胺62丝氨酸+丝氨酸163天门冬氨酸+苯丙氨酸189丝氨酸+丙氨酸216谷氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例39-40中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被天门冬酰胺62丝氨酸+丝氨酸163天门冬氨酸+苯丙氨酸189丝氨酸+丙氨酸216谷氨酸和甘氨酸97丝氨酸+色氨酸106异亮氨酸+酪氨酸217亮氨酸所取代，结果大体上相同。

               实施例41-42

           颗粒状织物清洁组合物

                           实施例编号

        成分               41      42

    链烷基苯磺酸盐        11.4    10.70  动物脂烷基硫酸盐        1.80    2.40  14-15烷基硫酸盐         3.00    3.10 7倍乙氧基化14-15烷醇     4.00    4.0011倍羟乙基化动物脂肪醇    1.80    1.80

    分散剂                0.07    0.1

    液体聚硅氧烷          0.80    0.80

    柠檬酸三钠            14.00   15.00

    柠檬酸                3.00    2.50

    沸石                  32.50   32.10  马来酸丙烯酸共聚物      5.00    5.00二亚乙基三胺五亚甲基磷酸  1.00    0.20Ala98Asp+Ala187Ser        0.30    0.30

    脂肪酶                0.36    0.40

    淀粉酶                0.30    0.30

    硅酸钠                2.00    2.50

    硫酸钠                3.50    5.20

    聚乙烯吡咯烷酮        0.30    0.50

    过硼酸盐              0.5    1

    苯磺酸盐              0.1    0.2

    过氧化物酶            0.1    0.1

    微量物质         加至100         加至100

                  实施例43-44

              颗粒状织物清洁组合物

                                        实施例编号

          成分                          43      44

    12链烷基苯磺酸钠                    6.5     8.0

    硫酸钠                              15.0    18.0

    沸石A                               26.0    22.0

    次氮基三乙酸钠                      5.0     5.0

    聚乙烯吡咯烷酮                      0.5     0.7

    四乙酰乙二胺                        3.0     3.0

    硼酸                                4.0      -

    过硼酸                              0.5     1

    酚磺酸                              0.1     0.2Gln59ser+Asn62Ser+Leu96Gly+Ser204Gln    0.4     0.4填充剂(例如硅酸盐、碳酸盐、香味剂、水)加至100加至100

                  实施例45

          紧密型颗粒状织物清洁组合物

      成分                                    重量％

    烷基硫酸                                   8.0

    烷基乙氧基硫酸                             2.03位和7倍乙氧基化25和45烷醇的混合物             6.0

    聚羟基脂肪酰胺                             2.5

    沸石                                       17.0

    层状硅酸/柠檬酸盐                          16.0

    碳酸盐                                     7.0

    马来酸丙烯酸共聚物                         5.0

    去污聚合物                                 0.4

    羧甲基纤维素                               0.4

    聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物                  0.1

    乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮共聚体           0.1

    聚乙二醇2000                               0.2Val95Gln+Tyr104Glu+Gly127Gln+Lys213Glu+        0.5

    Ala216Asp

    脂肪酶                                     0.2

    纤维素酶                                   0.2

    四乙酰乙二胺                               6.0

    过碳酸盐                                   22.0

    乙二胺二琥珀酸                             0.3

    消泡剂                                     3.54，4’-双(2-吗啉代-4-苯胺基-均三嗪-6-基氨基)   0.25

    茋-2，2’-二磺酸二钠4，4’-双(2-sulfostyril)二苯基二钠                0.05  水、香味剂和微量物质                          加至100

                    实施例46

              颗粒状织物清洁组合物

        成分                           重量％

    链烷基苯磺酸盐                       7.6

    16-18烷基硫酸盐                      1.3

    7倍乙氧基化14-15烷醇                 4.0

    椰子烷基二甲基羟乙基氯化铵           1.4

    分散剂                               0.07

    液体聚硅氧烷                         0.8

    柠檬酸三钠                           5.0

    沸石4A                               15.0

    马来酸丙烯酸共聚物                   4.0

    二亚乙基三胺五亚甲基磷酸             0.4

    过硼酸盐                             15.0

    四乙酰乙二胺                         5.0

    蒙脱石粘土                           10.0

    聚(氧乙烯)(分子量300,000)            0.3Ser63Glu+Thr104Asn+Gln206Ser+Tyr217Thr   0.4

    脂酶                                 0.2

    淀粉酶                               0.3

    纤维素酶                             0.2

    硅酸钠                               3.0

    碳酸钠                          10.0  羧甲基纤维素                      0.2

    增亮剂                          0.2水、香味剂和微量物质              加至100

                      实施例47    

              颗粒状织物清洁组合物

      成分                                    重量％

    链烷基苯磺酸                              6.92

    动物脂肪烷基硫酸盐                        2.05

    7倍乙氧基化14-15烷醇                      4.43倍乙氧基化12-15烷基乙氧基硫酸盐              0.16

    沸石                                      20.2

    柠檬酸盐                                  5.5

    碳酸盐                                    15.4

    硅酸盐                                    3.0

    马来酸丙烯酸共聚物                        4.0

    羧甲基纤维素酶                            0.31

    去污共聚物                                0.30Asn62Ser+Trp106Gly+Ser132Asp+Ala187Ser        0.2

    +Phe189Ser

    脂酶                                      0.36

    纤维素酶                                  0.13

    过硼酸盐四水合物                          11.64

    过硼酸盐单水合物                          8.7

    四乙酰乙二胺                    5.0二亚乙基三胺五甲基磷酸              0.38

    硫酸镁                          0.40

    增亮剂                          0.19增亮剂、聚硅氧烷、消泡剂            0.85

    微量物质                      加至100b.液体织物清洁组合物

    本发明的液体织物清洁组合物包含有效量的一种或多种本发明的酶变异体，优选的活性酶在该组合物中的含量是重量比从约0.005％至约5％，更优选的是从约0.01％至约1％。该液体织物清洁组合物通常还包括一种阴离子表面活性剂、一种脂肪酸、一种水溶性清洁助洗剂和水。

    本发明的液体织物清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。

                  实施例48-52

              液体织物清洁组合物

                              实施例编号

      成分              48    49    50    51    52Ser161Glu+Gly219Asn    0.05  0.03  0.30  0.03  0.10Asn62Ser+Ile107Ala       -    -      -   0.01  0.20+Glu206Asp+Tyr217Thr12-14烷基硫酸盐，钠    20.00 20.00 20.00 20.00 20.00

    2-丁基辛酸         5.00  5.00  5.00  5.00  5.00

    柠檬酸钠           1.00  1.00  1.00  1.00  1.00  十烷醇乙氧酸盐(3)    13.00 13.00 13.00 13.00 13.00

    单乙醇胺           2.50  2.50  2.50  2.50  2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1)          补充至100％

    在实施例48-50中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸161谷氨酸+甘氨酸219天门冬酰胺所取代，结果大体上相同。

    在实施例51-52中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被丝氨酸161谷氨酸+甘氨酸219天门冬酰胺和天门冬酰胺62丝氨酸+异亮氨酸107丙氨酸+谷氨酸206天门冬氨酸+酪氨酸217苏氨酸所取代，结果大体上相同。

                实施例53-57

             液体织物清洁组合物

                                   实施例编号

        成分               53    54    55    56    57Ser101Asp+Ile107Ala       0.05  0.03  0.30  0.03  0.10

    +Gly202SerVal95Thr+Thr208Gly          -     -     -   0.01  0.2012-14烷基硫酸盐，钠       20.00 20.00 20.00 20.00 20.00

    2-丁基辛酸            5.00  5.00  5.00  5.00  5.00

    柠檬酸钠              1.00  1.00  1.00  1.00  1.00十烷醇乙氧酸盐(3)         13.00 13.00 13.00 13.00 13.00

    单乙醇胺              2.50  2.50  2.50  2.50  2.50  水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1)          补充至100％

    在实施例53-55中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸101天门冬氨酸+异亮氨酸107丙氨酸+甘氨酸202丝氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例56-57中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被丝氨酸101天门冬氨酸+异亮氨酸107丙氨酸+甘氨酸202丝氨酸和缬氨酸95苏氨酸+苏氨酸208甘氨酸所取代，结果大体上相同。

             实施例58-59

         颗粒状织物清洁组合物

                           实施例编号

          成分              58    59  12-14碳链烯基琥珀酸       3.0   8.0

    柠檬酸单水合物          10.0  15.0

    12-15烷基硫酸钠         8.0   8.02倍乙氧基化12-15烷醇硫酸钠   -    3.0  7倍乙氧基化12-15烷醇       -    8.0  5倍乙氧基化12-15烷醇      8.0   -二亚乙基三胺五(亚甲基磷酸)  0.2   -

    油酸                    1.8   -

    乙醇                    4.0   4.0

    丙二醇                  2.0   2.0

    Asp60Glu+Gln206Asn      0.2   0.2

    聚乙烯吡咯烷酮          1.0   2.0

    消泡剂                  0.15  0.15

    氢氧化钠                调至pH7.5

    过硼酸盐                0.5   1

    酚磺酸盐                0.1   1

    过氧化物酶              0.4   0.1

    水和微量物质             加至100

    在实施例58和59中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被天门冬氨酸60谷氨酸+谷氨酰胺206天门冬酰胺所取代，结果大体上相同。

                  实施例60-62

              液体织物清洁组合物

                                  实施例编号

      成分                      60        61        62

    柠檬酸                      7.10      3.00      3.00

    脂肪酸                      2.00       -        2.00

    乙醇                        1.93      3.20      3.20

    硼酸                        2.22      3.50      3.50

    单乙醇胺                    0.71      1.09      1.09

    1，2丙二醇                  7.89      8.00      8.00

    异丙基苯磺酸钠              1.80      3.00      3.00

    甲酸钠                      0.08      0.08      0.08

    氢氧化钠                    6.70      3.80      3.80

    硅消泡剂                    1.16      1.18      1.18

    Asn61Glu                    0.0145     -         -

    Gly97Glu+Thr164Pro            -       0.0145     -Asn62Glu+Thr158Ser+Gly215Ser      -        -         0.0145

    脂酶                        0.200     0.200      0.200

    纤维素酶                      -       7.50       7.50

    去污共聚物                  0.29      0.15       0.15

    消泡剂                      0.06      0.085      0.085

    增亮剂36                    0.095      -              -

    增亮剂3                       -       0.05       0.05

    12烷基苯磺酸                  9.86      -      -12-15烷基聚乙氧基(2，5)硫酸盐     13.80   18.00   18.00

    12烷基葡萄糖酰胺              -       5.00    5.0012-13烷基聚乙氧基化物(9)          2.00    2.00    2.00

    水、香味剂和微量物质            补充至100％c.条状织物清洁组合物

    用于手工洗涤脏织物的本发明的条状织物清洁组合物包含有效量的一种或多种本发明的酶变异体，在组合物中的优选的含量是重量比从约0.01％至约1％。

    本发明的条状织物清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。

                    实施例63-66

                条状织物清洁组合物

                                           实施例编号

            成分                  63    64       65      66  Gly97Glu+Thr164Pro             0.3    -        0.1     0.02  Ala98Ser+Gly154Asn              -     -        0.4     0.03

    12-16烷基硫酸钠              20.0    20.0    20.0    20.012-14碳N-甲基葡萄糖酰胺          5.0     5.0     5.0     5.00  11-13烷基苯磺酸钠              10.0    10.0    10.0    10.0

    碳酸钠                       25.0    25.0    25.0    25.0

    焦磷酸钠                     7.0     7.0     7.0     7.00

    三聚磷酸钠                   7.0     7.0     7.0     7.00

    沸石A(0.1-10μ)              5.0     5.0     5.0     5.00

    羧甲基纤维素                 0.2     0.2     0.2     0.20聚丙烯酸酯(分子量1400)          0.2    0.2    0.2    0.20

    椰子单乙醇胺                5.0    5.0    5.0    5.00  增亮剂、香味剂                0.2    0.2    0.2    0.20

    硫酸钙                      1.0    1.0    1.0    1.00

    硫酸镁                      1.0    1.0    1.0    1.00

    水                          4.0    4.0    4.0    4.00

    填充物*                          补充至100％*可选自如碳酸钙、滑石粉、粘土、硅酸盐等。

    在实施例63-64中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被甘氨酸97谷氨酸+苏氨酸164脯氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例65-66中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被甘氨酸97谷氨酸苏氨酸164脯氨酸和丙氨酸98丝氨酸+甘氨酸154天门冬酰胺所取代，结果大体上相同。

                  实施例67-70

              条状织物清洁组合物

                                         实施例编号

        成分                      67    68    69    70

    Val203Glu                     0.3    -    0.1   0.02  Gly100Glu+Ile107Ser              -    0.3   0.4   0.03

    12-16烷基硫酸钠               20.0  20.0  20.0  20.0012-14碳-N-甲基葡萄糖酰胺          5.0   5.0   5.0   5.0011-13烷基苯磺酸盐，钠             10.0  10.0  10.0  10.00

    碳酸钠                        25.0  25.0  25.0  25.00

    焦磷酸钠                      7.0   7.0   7.0   7.00

    三聚磷酸钠                 7.0    7.0    7.0    7.00  沸石A(0.1-10μ)              5.0    5.0    5.0    5.00

    羧甲基纤维素               0.2    0.2    0.2    0.20聚丙烯酸酯(分子量1400)         0.2    0.2    0.2    0.20

    椰子单乙醇胺               5.0    5.0    5.0    5.00  增亮剂、香味剂               0.2    0.2    0.2    0.20

    硫酸钙                     1.0    1.0    1.0    1.00

    硫酸镁                     1.0    1.0    1.0    1.00

    水                         4.0    4.0    4.0    4.00

    填充物*                       补充至100％*可选自如碳酸钙、滑石粉、粘土、硅酸盐等。

    在实施例67中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被缬氨酸203谷氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例68中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被甘氨酸100谷氨酸+异亮氨酸107丝氨酸所取代，结果大体上相同。

    在实施例69-70中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被缬氨酸203谷氨酸和甘氨酸100谷氨酸+异亮氨酸107丝氨酸所取代，结果大体上相同。B.其它清洁组合物

    除了以上所讨论的硬表面清洁组合物、碗碟清洁组合物和织物清洁组合物以外，当需要水解不溶性底物时，一种或多种本发明的变异体可以加入许多其它清洁组合物。这样的清洁组合物包括但不限于口腔清洁组合物、假牙清洁组合物，和接触透镜清洁组合物。1.口腔清洁组合物  在本发明的另一个实施方案中，组合物中包含药物学可接受量的一种或多种本发明的酶变异体，所述组合物可以用来除去牙齿或假牙上的蛋白质类污物。这里所使用的“口腔清洁组合物”是指牙粉、牙膏、牙胶、牙粉、口腔清洗剂、口腔喷剂、口腔胶、口香糖、糖锭、袋装剂、片剂、生物胶、预防膏、牙科治疗液等。口腔清洁组合物包含一种或多种本发明的酶变异体，在组合物中的优选的含量是重量比从约0.001％至约20％，更优选的是从约0.001％至约10％，还要优选的是从约0.01％至约5％，以及药物学可接受的载体。这里所使用的“药物学可接受”的意思是术语中描述的药品、药剂或无活性的成分适用于接触人类和低级动物的组织，并且没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、刺激、过敏反应等，具有合理的利益/风险比。    典型地，口腔清洁组合物中口腔清洁成分中的药用口腔清洁载体成分的重量比通常是从约50％至约99.99％，优选的是从约65％至约99.99％，更优选的是从约65％至约99％。

    可以包含于本发明的口腔清洁组合物的药用载体成分和可选的成分对于本领域的专业人员是熟知的。口腔清洁组合物中有用的许多不同的组合物类型、载体成分和可选成分公开于美国专利5,096,700，西贝尔，颁布于1992年3月17日；美国专利5,028,414，桑帕库马，颁布于1991年7月2日；和美国专利5,028,415，贝尼笛格、布什和桑伯格，颁布于1991年7月2日；所有这些在此处作为文献引用。

    本发明的口腔清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。

                  实施例71-74

                  牙粉组合物

                                        实施例编号

          成分                    71     72     73     74Gln59Asp+Ala98Glu+Gly102Asp     2.000   3.500   1.500  2.000

    +Ser105Glu+Leu109Thr

    山梨醇(70％水溶液)          35.000  35.000  35.000 35.000

    PEG-6*                     1.000   1.000   1.000  1.000

    硅石牙科擦粉**       20.000  20.000 20.000 20.000

    氧化钠                0.243   0.243  0.243  0.243

    二氧化钛              0.500   0.500  0.500  0.500

    糖精钠                0.286   0.286  0.286  0.286烷基硫酸钠(27.9％水溶液)  4.000   4.000  4.000  4.000

    香味剂                1.040   1.040  1.040  1.040

    羧乙烯聚合物***      0.300   0.300  0.300  0.300

    角叉胶****           0.800   0.800  0.800  0.800

    水                          补充至100％

    *PEG-6＝分子量为600的聚二醇

    **冷凝的硅石鉴别为Zeodent119，由J.M.胡伯提供。

    ***Carbopol由B.F.古德里希化学公司提供。

    ****Iota角叉胶由何库斯化学公司提供。

    在实施例71-74中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被谷氨酰胺79天门冬氨酸+丙氨酸98谷氨酸+甘氨酸102天门冬氨酸+丝氨酸105谷氨酸+亮氨酸209苏氨酸所取代，结果大体上相同。

                实施例75-78

              口腔清洁组合物

                                      实施例编号

        成分                    75    76    77    78 Leu96Thr+Gly128Asp            3.00   7.5   1.00  5.00+Ala133Glu+Asn155Glu+Lys213Asp+Ala216Asp

    SDA 40醇                   8.00   8.00  8.00  8.00

        香味剂        0.08   0.08   0.08   0.08

        乳化剂        0.08   0.08   0.08   0.08

        氟化钠        0.05   0.05   0.05   0.05

        甘油          10.00  10.00  10.00  10.00

        甜味剂        0.02   0.02   0.02   0.02

        安息香酸      0.05   0.05   0.05   0.05

        氢氧化钠      0.20   0.20   0.20   0.20

          染料        0.04   0.04   0.04   0.04

            水                  补充至100％

    在实施例75-78中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被亮氨酸96苏氨酸+甘氨酸128天门冬氨酸+丙氨酸133谷氨酸+天门冬酰胺155谷氨酸+赖氨酸213天门冬氨酸+丙氨酸216天门冬氨酸所取代，结果大体上相同。

                    实施例79-82

                     锭剂组合物

                                          实施例编号成分                           79      80        81       82Ser132Asp+Tyr217Leu           0.01     0.03     0.10     0.02

    山梨醇                    17.50    17.50    17.50    17.50

    甘露醇                    17.50    17.50    17.50    17.50

    淀粉                      13.60    13.60    13.60    13.60

    甜味剂                    1.20     1.20     1.20     1.20

    香味剂                    11.70    11.70    11.70    11.70

    色素                      0.10     0.10     0.10     0.10

    玉米浆                          补充至100％

    在实施例79-82中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸132天门冬氨酸+酪氨酸217亮氨酸所取代，结果大体上相同。

                实施例83-86

                口香糖组合物

                                      实施例编号

      成分                        83    84    85    86Thr66Pro+Gln103Asn              0.03    0.02  0.10  0.05

    +Lys213Asp

    山梨醇晶体                  38.44   38.00 38.00 38.00Paloja-T口香糖基质*            20.00   20.00 20.00 20.00山梨醇(70％水溶液)              22.00   22.00 22.00 22.00

    甘露醇                      10.00   10.00 10.00 10.00

    甘油                        7.56    7.56  7.56  7.56

    香味剂                      1.00    1.00  1.00  1.00

    *由L.A.德里夫斯公司提供。

    在实施例83-86中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被苏氨酸66脯氨酸+谷氨酰胺103天门冬酰胺+赖氨酸213天门冬氨酸所取代，结果大体上相同。2.假牙清洁组合物

    在本发明的另一个实施方案中，用于在口腔外清洁假牙的假牙清洁组合物包含一种或多种本发明的酶变异体。该假牙清洁组合物包含有效量的一种或多种酶变异体，在组合物中含量为重量比从约0.0001％至约50％，优选的含量是占组合物的重量比从约0.001％至约35％，更优选的是从约0.01％至约35％，以及假牙清洁载体。各种假牙清洁组合物的配方对本领域是熟知的，例如发泡片等(例见美国专利5,055,305，扬，此处作为文献引用)，并且是适合于与一种或多种酶变异体共同使用以从假牙上清除蛋白质类的污物。

    本发明的假牙清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。

                 实施例87-90

               双层起泡牙科清洁片

                                  实施例编号

      成分                    87    88    89    90

    酸性层Gln59Glu+Ser63Glu+Val95Met   1.0    1.5   0.01  0.05  +Gly97Pro+Tyr217Ala

    酒石酸                   24.0   24.0  24.00 24.00

    碳酸钠                   4.0    4.0   4.00  4.00

    磺酸                     10.0   10.0  10.00 10.00

    PEG20,000                4.0    4.0   4.00  4.00

    双碳酸钠                 24.5   24.5  24.50 24.50

    过硫酸钾                 15.0   15.0  15.00 15.00

    焦磷酸钠酸式盐           7.0    7.0   7.00  7.00

    焦化硅石                 2.0    2.0   2.00  2.00

    TAED*                   7.0    7.0   7.00  7.00

    蓖麻碱磺基琥珀酸         2.0    2.0   2.00  2.00

    香味剂                   7.0    7.0   7.00  7.00

    碱性层

    过硼酸钠单水合物         32.0   32.0  32.00 32.00

    二碳酸钠                 19.0   19.0  19.00 19.00

    EDTA                     3.0    3.0   3.00  3.00

        三聚磷酸钠      12.0  12.0  12.00  12.00

        PEG 20,000      2.0   2.0   2.00   2.00

        过硫酸钾        26.0  26.0  26.00  26.00

          碳酸钠        2.0   2.0   2.00   2.00

          焦化硅石      2.0   2.0   2.00   2.00

        染料/香味剂     2.0   2.0   2.00   2.00

    *四乙酰乙二胺

    在实施例87-90中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被谷氨酰胺59谷氨酸+丝氨酸63谷氨酸+缬氨酸95甲硫氨酸+甘氨酸97脯氨酸+酪氨酸217丙氨酸所取代，结果大体上相同。3.接触透镜清洁组合物  

    在本发明的另一个实施方案中，接触透镜清洁组合物包含一种或多种本发明的酶变异体。该接触透镜清洁组合物包含有效量的在组合物中含量为重量比从约0.01％至约50％的一种或多种酶变异体，优选的含量是占组合物的重量比从约0.01％至约20％，更优选的是从约1％至约5％，以及接触透镜清洁载体。各种接触透镜清洁组合物的配方对本领域是熟知的，例如片剂、液体等(例见美国专利4,863,627，戴韦思、米肯和力丝，颁布于1989年9月5日；美国专利Re.32,672，胡斯、拉木和其拉，重颁布于1988年5月24日；美国专利4,609,493，沙福，颁布于1986年9月2日；美国专利4,690,793，欧干比里和史密斯，颁布于1987年9月1日；美国专利4,614,549，欧干比里、里德海墨和史密斯，颁布于1986年9月30日；以及美国专利4,285,738，奥卡塔，颁布于1981年8月25日；其中每篇都在此处作为文献引用)，并且是适合于与一种或多种酶变异体共同使用以从接触透镜上清除蛋白质类的污物。

    本发明的接触透镜清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。

                    实施例91-94

              酶促接触透镜清洁组合物

                                        实施例编号

              成分                91    92    93    94

        Serl91Glu+Gly219Ser       0.01  0.5   0.1   2.0

            葡萄糖                50.00 50.0  50.0  50.0

        非离子表面活性剂(聚氧     2.00  2.0   2.0   2.0

        乙烯-聚氧丙烯共聚物)

        阴离子表面活性剂(聚氧     1.00  1.0   1.0   1.0

        乙烯-烷苯基醚硫醚钠)

            氯化钠                1.00  1.0   1.0   1.0

            硼砂                  0.30  0.3   0.3   0.3

            水                        补充至100％

    在实施例91-94中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸191谷氨酸+甘氨酸219丝氨酸所取代，结果大体上相同。

    在描述过本发明的具体实施方案之后，对于本领域的专业人员来说显而易见的是，各种针对本发明的改变和修改可以在本发明的主旨和范围的情况下完成。在后面的权利要求中，所有这样的修改将包含在本发明的范围内。

                          序列表

    (1)一般资料：

      (i)申请人：菲力浦F.布鲁德等

      (ii)发明名称：具有更低的吸附性和更高的水解能力的BPN’变异体，其中一个或多个环状区被取代

      (iii)序列数：1

    (iv)联系地址：

      (A)收件人：PROCTER&GAMBLE公司

      (B)街道：迈阿密河东路11810号

      (C)城市：罗丝

      (D)州：俄亥俄

      (E)国家：美国

      (F)邮编：45061

    (v)计算机可读格式：

      (A)介质类型：软盘

      (B)计算机：IBM PC兼容机

      (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

      (D)软件：专利发布#1.0，#1.25版

    (vi)现有申请数据：

      (A)申请号：

      (B)申请日期：

      (C)分类：

    (viii)律师/代理人信息：

      (A)姓名：布蓝穆·J科丝坦洁

      (B)注册号：34,804

      (C)代理人参考号：5597

    (ix)通讯信息：

      (A)电话：513-627-2858

      (B)传真：513-627-0260(2)第一号序列信息：  (i)序列特征：

      (A)长度：275个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)拓扑类型：线性

    (ii)分子类型：蛋白质

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：丙氨酸  谷氨酰胺  丝氨酸  缬氨酸  脯氨酸  酪氨酸  甘氨酸  1                                 5缬氨酸  丝氨酸  谷氨酰胺  异亮氨酸  赖氨酸  丙氨酸  脯氨酸

                   10丙氨酸  亮氨酸  组氨酸  丝氨酸  谷氨酰胺  甘氨酸  酪氨酸  15                                        20苏氨酸  甘氨酸  丝氨酸  天门冬酰胺  缬氨酸  赖氨酸  缬氨酸

                           25丙氨酸  缬氨酸  异亮氨酸  天门冬酰胺  丝氨酸  甘氨酸  异亮氨酸

         30                                              35天门冬酰胺  丝氨酸  丝氨酸  组氨酸  脯氨酸  天门冬酰胺  亮氨酸

                                      40赖氨酸  缬氨酸  丙氨酸  甘氨酸  甘氨酸  丙氨酸  丝氨酸

                  45甲硫氨酸  缬氨酸  脯氨酸  丝氨酸  谷氨酸  苏氨酸  天门冬酰胺   50                                       55脯氨酸  色氨酸  谷氨酰胺  天门冬氨酸  天门冬酰胺  天门冬酰胺  丝氨酸

                             60组氨酸  甘氨酸  苏氨酸  组氨酸  缬氨酸  丙氨酸  甘氨酸

          65                                      70苏氨酸  缬氨酸  丙氨酸  丙氨酸  亮氨酸  天门冬酰胺  天门冬酰胺

                                  75丝氨酸  异亮氨酸  甘氨酸  缬氨酸  亮氨酸  甘氨酸  缬氨酸

                    80丙氨酸  脯氨酸  丝氨酸  丙氨酸  丝氨酸  亮氨酸  酪氨酸  85                                      90丙氨酸  缬氨酸  赖氨酸  缬氨酸  亮氨酸  甘氨酸  丙氨酸

                          95天门冬酰胺  甘氨酸  丝氨酸  甘氨酸  谷氨酰胺  酪氨酸  丝氨酸

              100                                     105色氨酸  异亮氨酸  异亮氨酸  天门冬酰胺  甘氨酸  异亮氨酸  谷氨酸

                                         110色氨酸  丙氨酸  异亮氨酸  丙氨酸  天门冬酰胺  天门冬酰胺  甲硫氨酸

                  115天门冬氨酸  缬氨酸  异亮氨酸  天门冬酰胺  甲硫氨酸  丝氨酸  亮氨酸  120                                       125甘氨酸  甘氨酸  脯氨酸  丝氨酸  甘氨酸  丝氨酸  丙氨酸

                        130丙氨酸  亮氨酸  赖氨酸  丙氨酸  丙氨酸  缬氨酸  天门冬氨酸

          135                                      140赖氨酸  丙氨酸  缬氨酸  丙氨酸  丝氨酸  甘氨酸  缬氨酸

                                  145缬氨酸  缬氨酸  缬氨酸  丙氨酸  丙氨酸  丙氨酸  甘氨酸

                150天门冬酰胺  谷氨酸  甘氨酸  苏氨酸  丝氨酸  甘氨酸  丝氨酸  155                                       160丝氨酸  丝氨酸  苏氨酸  缬氨酸  甘氨酸  酪氨酸  脯氨酸

                        165甘氨酸  赖氨酸  酪氨酸  脯氨酸  丝氨酸  缬氨酸  异亮氨酸

         170                                      175丙氨酸  缬氨酸  甘氨酸  丙氨酸  缬氨酸  天门冬酰胺  丝氨酸

                                 180丝氨酸  天门冬酰胺  谷氨酰胺  精氨酸  丙氨酸  丝氨酸  色氨酸

                      185丝氨酸  丝氨酸  缬氨酸  甘氨酸  脯氨酸  谷氨酸  亮氨酸  190                                   195天门冬酰胺  缬氨酸  甲硫氨酸  丙氨酸  脯氨酸  甘氨酸缬氨酸

                                200丝氨酸  异亮氨酸  谷氨酰胺  丝氨酸  苏氨酸  亮氨酸  脯氨酸

          205                                         210甘氨酸  天门冬酰胺  赖氨酸  酪氨酸  甘氨酸  丙氨酸  酪氨酸

                                      215天门冬酰胺  甘氨酸  苏氨酸  丝氨酸  甲硫氨酸丙氨酸丝氨酸

                      220脯氨酸  组氨酸  缬氨酸  丙氨酸  甘氨酸  丙氨酸  丙氨酸225                                     230丙氨酸  亮氨酸  异亮氨酸  亮氨酸  丝氨酸  赖氨酸  组氨酸

                          235脯氨酸  天门冬酰胺  色氨酸  苏氨酸  天门冬酰胺  苏氨酸  谷氨酰胺

          240                                            245缬氨酸  精氨酸  丝氨酸  丝氨酸  亮氨酸  谷氨酸  天门冬酰胺

                                  250苏氨酸  苏氨酸  苏氨酸  赖氨酸  亮氨酸  甘氨酸  天门冬酰胺

                255丝氨酸  色氨酸  酪氨酸  酪氨酸  甘氨酸  赖氨酸  甘氨酸 260                                      265亮氨酸  异亮氨酸  天门冬酰胺  缬氨酸  谷氨酰胺  丙氨酸  丙氨酸

                                270丙氨酸  谷氨酰胺

         275

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本发明涉及枯草溶菌素BPN的变异体，它具有野生型BPN氨基酸序列的修饰氨基酸序列，该野生型氨基酸序列包括第一环状区、第二环状区、第三环状区、第四环状区和和第五环状区；其中修饰的氨基酸序列在一个或多个环状区中的特定位点，包含与存在于野生型枯草溶菌素BPN中的不同的氨基酸(即取代)，通过这些氨基酸的作用，BPN变异体与野生型枯草溶菌素BPN相比，对不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本发明还。

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