重组融合蛋白,含该重组融合 蛋白的(疫苗)组合物及其制备方法 本发明涉及一种重组融合蛋白,含该重组融合蛋白的(疫苗)组合物及该重细融合蛋白的制备方法。
猪的水肿病是由形成志贺菌毒素的大肠杆菌(STEC)引起的。这种病原体对这种临床疾病唯一负责的主要毒性因素是2e志贺菌毒素(Stx2e)(Mac Leod等人,1991)。由于这种疾病在大多数情况下发病甚急,开始治疗时又大多太迟,或者未取得预期的效果,因而研究一种有效的预防方法是很有意义的。但是,Stx2e的制备和彻底纯化都存在问题
Stx2e的B亚单位由于各种原因被考虑用作疫苗候选物。它是从康复猪仔的血清中鉴定的,即它具有抗原决定族。其次,该毒素的B-亚单位在胃肠外施用之后诱导中和毒素的抗体形成(Acheson等人1996;Boyd等人1991)。籍助基因工程方法成功地制备了一种重组融合蛋白,该融合蛋白由Stx2eB亚单位和Shistosoma Japonicum的谷胱甘肽-S-转移酶的片段组成(Franke等人1995)。对患水肿病的断奶仔猪的病原体排泄以及对STEC感染的免疫反应进行了长时间的研究。为证明Stx2e抗体存在所用的由Stx2eB亚单位和谷胱甘肽S-转移酶片段组成的重组融合蛋白很好地适宜于间接证明STEC感染,迄今被视为预防水肿病的潜在疫苗(Wieler L.H.,Franke Sylvia,Rose M.和Karch H.:用一种志贺菌类毒素IIe的重组B-亚单位表征猪水肿病的免疫响应,在BadNau-heim 21.DVG会议上的报告(1995.3))。
因此,本发明地目的在于,提供适用于接种目的的重组融合蛋白,编码它的质粒,用于与水肿,特别是猪水肿相关的各种不同用途的含该融合蛋白的(疫苗)组合物以及该重组融合蛋白的制备方法。
该目的是通过具有权利要求1特征的重组融合蛋白,具有权利要求5特征的(疫苗)组合物,符合权利要求18的含质粒的大肠杆菌菌株和具有权利要求20特征的方法来实现的。本发明的其它方面描述在从属权利要求中。
本发明提供一种重组融合蛋白和一种含有这种重组融合蛋白的(疫苗)组合物,它们可以用于有关水肿病,尤其是猪水肿病的各种用途。尤其考虑下列用途:
-证明抗Stx2e的抗体,
-诊断水肿病,
-产生抗水肿病病原体毒素的单克隆抗体,尤其是作为检查制备重组融合蛋白的收率的基础或通过免疫亲和层析纯化制备全毒素的基础,
-针对水肿病,尤其是猪水肿病的免疫。
重组融合蛋白是2e志贺菌毒素的亚基因Stx2e片段和一种末端标记物的融合物,该末端标记物大小大约相当于该片段的大小或该片段一部分的大小。末端标记物是该蛋白质氨基酸序列的标记的末端基团。该亚基因Stx2e片段优选是2e志贺菌毒素的B亚单位(Stx2eB)。末端标记物的大小最大优选为5kDa,其最大更优选为1kDa。该末端标记物还优选是氨基末端His-标记物。该His-标记物包含6个细氨酸。其大小约为0.66kDa。
重组融合蛋白具有天然蛋白质的实质性抗原域。这是其适宜于水肿病相关各种用途的原因。的确,这还是理论性的,在迄今所知的由Stx2eB亚单位和谷胱甘肽-S-转移酶的片段细成的重组融合蛋白已证明这点。但是,这里存在的问题是,按申请人的估计,必须考虑干扰性的免疫反应,它们防碍属间的融合蛋白(generic fusion protein)对,例如,治疗目的的应用。相反,本发明的融合蛋白的显著优点在于,这里由于专门选择的标记物,可不考虑干扰性的免疫反应,从而第一次提供了能在疫苗中应用的融合蛋白。如属间的融合蛋白一样,本发明所采用的标记物亦对制备重组融合蛋白有利,尤其对其纯化,例如通过亲和层析方法的纯化有利。
交联His-Stx2eB单体的低聚物能特别有效地形成融合蛋白。
按照一个有利的方面,(疫苗)组合物除了重组融合蛋白之外还包含至少一种外加抗原。疫苗组合物是免疫原性量的重组融合蛋白和免疫原性量的至少一种外加抗原的配方。用这种组合疫苗可同时实现对猪水肿病和至少一种其它疾病的免疫接种。
(变苗)组合物除了重组的融合蛋白之外可以包含至少一种外加抗原,该外加抗原选自含有与细胞结合的类毒素的多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)菌苗,支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)菌苗,猪缸斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)抗原,多杀巴斯德氏菌D型和/或大肠杆菌和/或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的一种或多种可溶性非细胞类毒素(non-cell toxiods),多杀巴斯德氏菌A或D型的灭活全细胞,大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、以及猪生殖和呼吸综合征病毒(Porcine Reproduction and Respiratory SyndromVirus)、流感病毒、假狂犬病病毒和猪环状病毒I和II的培养物。
已知前面所提及的抗原是下列疾病的原因:
-多杀巴斯德氏菌和支气管炎博德特氏菌引起猪进行性萎缩性鼻炎,亦称“吸鼻涕病”;在致病方面,主要是多杀巴斯德氏菌毒素起重要作用(商用疫苗中该类毒素成分是重要的)。
-多杀巴斯德氏菌A和D型引起猪的呼吸道疾病(肺炎),多杀巴斯德氏菌D亦引起鼻呼吸阻塞病。
-猪红斑丹毒丝菌引起猪丹毒病
-大肠杆菌引起腹泻病(猪水肿病是其中一种特殊形式)(毒素起决定作用)
-产气荚膜梭菌引起乳猪坏死性肠炎(毒素起决定作用)
-大叶性肺炎放线杆菌引起出血坏死性胸膜肺炎
-副猪嗜血菌:格拉瑟病(纤维蛋白性浆膜炎和关节炎)
-猪链球菌:链球菌败血症
-猪肺炎支原体引起地方性兽肺炎,亦称“仔猪流感”
-猪生殖和呼吸综合征病毒:仔猪呼吸道病(肺炎),母猪不育症
-流感病毒:呼吸道病
-假狂犬病病毒引起猪的奥耶斯基病(假狂犬病)
-猪环状病毒I和II:断奶后多系统消瘦(Post-weaningmultisystemicwasting)综合征。
该至少一种外加抗原优选这样选择,即它与一种疾病有关,该疾病典型地与水肿病在大致相同的年龄侵害猪。上面所引的抗原基本上是这种情况。因而此疫苗组合物使得可以特别有效地联合接种。
该疫苗组合物中优选含有重组融合蛋白和/或该至少一种外加抗原,每一种的量为免疫原性量,用于抗猪水肿病及其它病毒和/或细菌感染的猪接种。
此外,本发明涉及疫苗组合物,其成份和/或数量这样选择,即相关动物对至少一种疾病的免疫可通过先后和/或同时接种疫苗细合物实现。
对疫苗细合物,特别重要的是佐剂的选择。例如可采用W/O/W乳剂(例如ISA206),W/O乳剂(例如iFA不完全弗氏佐剂),水性悬浮剂(例如氢氧化铝)或0/W乳剂。
按照本发明的方法,为了重组制备与末端标记物融合的2e志贺菌毒素(Stx2e)的亚基因片段,在一合适的载体系统中从Stx2e操纵子克隆亚单位,产生的重组质粒转化至大肠杆菌菌株中,诱导所产生的表达系统,该融合蛋白被表达并被纯化。
将2e志贺菌毒素B-亚单位(Stx2eB)的基因克隆在不同的表达载体中。用这样产生的重细质粒转化各种大肠杆菌K12实验室菌株。将全部转化体在表达研究中在变化的条件下(温度,诱导水平,诱导时间)进行重组B-亚单位形成测试。确定这种转化体或克隆,其重组蛋白相对细胞总蛋白含量的产率最高。对由这种菌株形成的融合蛋白,即含有成熟的B-亚单位和N端His-标记物(His-Stx2eB)的融合蛋白,开发了一种纯化方法,并以实验室规模进行了试验。为了将这种纯化方法在大规模上实施,拟采用应用适宜缓冲体系的FPLC。
实施例
Stx2e重组B亚单位的制备
为了制备重组B亚单位,采用了菌种大肠杆菌Cux-Stx2eB,DSM编号12721(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH),Mascheroder Weg I b,D-38124 Brauschweig)。这种大肠杆菌实验室菌株含有质粒pHIT-24,这种质粒克隆了Stx2e的B-亚单位。
从此菌种建立种子分批体系并在-78℃冷藏于2ml低温小瓶中。
为了产生重组B亚单位,将1安瓿工作种子(2ml)融化以便培养预培养物1。
预培养物1的制备条件如下:
培养基:150ml无菌的标准I营养内汤+0.01%氨苄青霉素放入300ml的三角瓶中。培养:37℃,15小时,直立静置培养。
采用带有5升培养容器的发酵罐“BIOSTAT B”制备主要物质。此培养容器装有4L标准I营养肉汤+0.01%氨苄青霉素,并作为一单元在121℃下高压灭菌25分钟。
将预培养物1放入此培养基中,并在下列条件下培养6小时:
温度:37℃
pH=7.0-7.1
搅拌速度:100-150rpm
空气导入量:2升/分钟
pH的控制通过自动加入无菌的10%NaOH溶液来保证。
诱导在培养6小时之后通过添加0.25mM IPIG溶液(异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)进行,pH从7.1跃至7.5.诱导时间约为3.5小时。
然后将培养物泵入10升收集容器中并在一离心机中以2500xg离心。除去上清液体,粒状沉淀放入200ml 8M尿素缓冲液中并在冷室(4-8℃)放置约15小时.然后对所得重悬沉淀进行超声处理(4×15分钟,190赫兹,0.3秒脉冲),接着以10000xg离心。上清液体小心取出并进一步处理,丢弃此步骤得到的沉淀。
接着将此溶液籍助超滤(“Pellicon XL”)从200ml浓缩至80ml。
这样得到的80ml蛋白质溶液然后籍助亲和层析(FPLC“ktaexplorer”)进一步处理。
对所得含重组目的蛋白质的材料分份,每份3ml,并送入一装有金属螯合物基质(NI-NTA,Qiagen)的柱(容积:8ml)中。
这种基质专门结合重组蛋白质的His-标记物。
目的蛋白质被金属滞留并在变性的条件下(8M尿素,0.1M Na2HPO4,10mMTris/HCl,pH8)洗涤。
去除污染蛋白质之后,重组蛋白质通过pH跳跃(8M尿素,0.1M NaH2PO4,10mMTris/HCL,pH3)从亲合基质上脱附并在柱出口被收集。
纯化后的蛋白质籍助交叉流过滤(Cross-Flow-Filtration)(孔尺寸5kDa)浓缩。经过纯化和收率检验之后(通过SDS凝胶电泳,Western印迹,Elisa,蛋白质测定)将尿素缓冲液与一种生理缓冲溶液(PBS,PH7.2)进行交换,交换籍助交叉流过滤(孔尺寸5kDa)实现。
重组蛋白质的浓度为300μg/ml。
重组融合蛋白的描述
目的蛋白质由基因片段Stx2eB编码。Stx2eB亚单位亚基因片段的大小为228bp。
对重组蛋白质的下列性质进行检验:
1.分子量大小
从SDS凝胶电泳得出目的蛋白质的分子量约为7.5kDa.
2.在免疫印迹中用患病仔猪血清检查重组蛋白
对纯化后的抗原用患有水肿病的仔猪血清在免疫印迹进行研究。动物用的是养猪场的仔猪,其中出现明白无误的Stx2e-大肠杆菌菌株的临床症状。这种血清的90%以上与重组蛋白质呈阳性反应。为了排除错误的阳性结果,曾用偶联在Schistosoma japonicum谷胱甘肽S转移酶上的B-亚单位确证了该研究。
3.用抗Stx2eB单克隆抗体检查重组蛋白质。
为了确定重组B-亚单位的结构是否与野生型蛋白质相近,曾用斑点印迹方法对重组Stx2eB进行了研究。为此采用了单克隆抗体BC5BB12,该抗体特异识别Stx2的B-亚单位并与Stx2eB亚单位发生交叉反应。作为阳性检验,引入Stx2e全毒素。作为阴性检验采用一种Stx1的粗毒素制剂。
单克隆抗体BC5BB12既与Stx2e全毒素反应又与重组Stx2eB蛋白质反应,但不与Stx1反应。
4.在Vero细胞试验中检验重组蛋白质的细胞毒性
重组蛋白的细胞毒性在对Vero细胞,Hela细胞以及MDBK细胞的毒性试验中进行了研究。为此目的,应用了浓度为0.3μg/ml-100μg/ml的重组Stx2eB。即使在最低的稀释阶段也未能在被研究的细胞系中发现与阴性实验(无重组蛋白质的缓冲液)有显著的差别。结果征实,重组的Stx2eB本身不带细胞毒性。
5.家兔试验证明重组Stx2eB的免疫性。
使两只品种为“Weiβe Neuseel鋘der”,兔龄约为12个月的雄家兔接受重组Stx2eB免疫。第一次接种时,皮下注射添加有不完全弗氏佐剂(iFA)的100μg抗原。六星期之后皮下注射50μg重组Stx2eB加强免疫,同样添加iFA。对接种前后得到的血清在免疫印迹上进行试验。
在两只兔子中皆证明有特异的血清转换。
疫苗制剂制备的描述(实施例)
1.W/O/W疫苗制剂的制备
在无菌条件下将抗原作为水相(温度22℃)在搅拌下(速度<2000rpm)连续加入佐剂(例如Montanide ISA206),然后乳液在约2000rpm下匀化10分钟。
在8℃下放置24小时之后将疫苗制剂重新匀化。用显微镜和染色试验检验相位(Phasenlage)。
2.W/O疫苗制剂的制备。
在无菌条件下将抗原作为水相(温度22℃)在搅拌下(速度<2000rpm)连续加入佐剂(例如不完全弗氏佐剂)并进行乳化。
用显微镜和染色试验检验相位。
3.水相悬浮物的制备。
在无菌条件下将水性抗原在搅拌下(例如磁力搅拌器)连续加入水性佐剂(例如氢氧化铝)并进行搅拌。
疫苗根据参数pH和渗涨度(tonizitt)检验。
4.O/W-悬浮物的制备。
在无菌条件下将水相抗原连续加入佐剂并进行乳化。
用显微镜和染色试验检验相位。
疫苗制剂制成之后直至进一步应用之前皆在+4℃-+8℃的温度下置于冰箱中存放。
应用不同疫苗制剂证明重组Stx2eB对目标动物猪的免疫原性作用的例子
试验目的
研究的问题:基因工程方法制备的重组Stx2eB蛋白质(应用不同佐剂的条件下)能否在两次肌肉注射之后在仔猪体内诱导免疫反应?
为进行此试验用了8只年龄为6周的仔猪。
用疫苗制剂处理6只动物,2只动物给予一种安慰剂。
接种,间隔3周施用疫苗2次。
从每只动物采集下列血样:
1.第1次免疫之前
2.第1次免疫之后14天
3.直接在第2次免疫之前(第1次免疫之后21天)
4.第2次免疫之后14天
5.第2次免疫之后21天
血清用Elisa检查重组Stx2eB的特异性抗体的存在。此外还评价了疫苗的相容性和安全性值。一般的试验数据动物动物种类:猪动物类别:Absetzer年龄:6周(第1次免疫时)性别:混杂试验开始时动物的免疫状况:Stx2eB抗体阴性饲养方式:分组饲养喂养方案:随意水供应:由自来水管随意供应饲料添加剂的应用:无疫苗接种参数施用方法:注射施用途径:肌内两次免疫注射的间隔:3周所用疫苗的预处理:无试验动物的预处理:无被免疫动物数目:8对照动物:2研究方案:随机化,盲试接种剂量,动物特征,疫苗使用具体试验计划列于表l。关键佐剂佐剂A-ISA206佐剂B-iFA佐剂C-Montanide试验进程副反应的出现:在第1次免疫后-一般状况和进食有轻微影响,动物7和8体温稍增+轻微腹泻。
在第2次免疫后-除动物8体温增高外无其它副反应。
在试验过程中被淘汰的动物数:
仔猪2,原因:大肠杆菌引起的胃和肠炎
与接种无关的疾病的出现:
除仔猪2的疾病外,无
用其它药剂治疗:无
结果
疫苗制剂的相容性和安全性:
总体评估,疫苗制剂是相容的和安全的,虽然在第1次免疫之后动物7和8的一般状况稍有干绕,进食受到短时间不利影响,体温增高及轻微腹泻。第2次免疫未出现临床症状。只有动物8对再次注射疫苗出现体温升高的反应。
局部组织反应—触诊发现轻微水肿-仅动物5和6在第1次免疫后在注射处出现。
在仔猪宰杀之后,除动物1和3之外皆在注射通道(Strichkanal)周围发现宏观可识别的炎症,全部动物的炎症处皆被坏死材料塞满。对仔猪1和3的组织学研究能发现,只有结缔组织轻微增生(成血管细胞渗有淋巴细胞和组织细胞),而所有其它仔猪被坏死材料填满的注射通道皆被一种结缔组织的被膜包围。在结缔组织的被膜上可观察到带淋巴细胞和组织细胞渗入的炎症。
疫苗制剂的有效性
这组试验表明,重组Stx2eB在年龄6周的仔猪肌内注射后,可被动物免疫系统识别并诱发免疫反应,产生特异性的免疫球蛋白。
可籍助Elisa和免疫印迹证明这种抗体的存在。
免疫反应的强度似乎取决于所采用的疫苗制剂选取。
在所选的试验条件下,W/O乳剂(例如在采用iFA的条件下)可达到最佳效果。表2列出了详细结果。
表1:被测样本、动物体重和注射的疫苗量 动物编号 名称 组成 有效组份含量 猪的数目/VM 体重(kg) 注射疫苗量(ml) 1 Stx2eB 疫苗G27V27 PBS 佐剂A - 2 12,5 2,2 3 01安慰剂 Thiomersal 12,5 2,2 2 Stx2eB 疫苗 rStx2eB 佐剂A 0,167mg/ml 2 15 2,7 4 G97V27-02 Thiomersal 13 2,3 5 Stx2eB 疫苗 rStx2eB 佐剂B 0,167mg/ml 2 16 2,9 6 G97V27-03 Thiomersal 12,5 2,2 7 Stx2eB 疫苗 rStx2Eb 佐剂C 0,250mg/ml 2 14 2,5 8 G97V27-04 Thiomersal 14 2,5
表2:免疫试验得出的猪血清试样的抗-Stx-B2e的血清检验结果 注射物 免疫印迹结果/ELISA(ELISA单位) 27.1.1998 10.2.1998 17.2.1998 3.3.1998 10.3.1998 编号 IB ELISA 编号 IB ELISA 编号 IB ELISA 编号 IB ELISA 编号 IB ELISA 安慰剂 佐剂A l - -(236)* 9 - -(357,6) 17 - -(359,6) 25 - -(258,3 ) 33 - -(398) 3 - +(403) 11 - -(356,3) 19 - -(328) 27 - ?(1130) 35 - -(380,3) rStx2eB 佐剂A 2 - -(231) 10 / / 18 / / / / / / / / 4 - -(221) 12 - -(350,3) 20 - +(436) 28 - +(432,3 ) 36 - -(345) rStx2eB 佐剂B 5 - (+) 357 13 ++ +++ (1133,3) 21 ++ +++ (1849,6) 29 ++ +++ (2767) 37 ++ +++ (2908) 6 - -(281,3) 14 (+) +(432,6) 22 + ++ (691,3) 30 ++ +++ (819,3) 38 + +++ (1095,3) rStx2EB 辅剂C 7 - -(233,6) 15 - +(474,6) 23 (+) + (539,3) 31 + + (473,6) 39 - +(411) 8 - -(241) 16 - +(425) 24 (+) +(473) 32 - + (411,6) 40 - -(389,3)
+阳性检验+++(808);阴性检验-(187,3)
保藏的微生物
大肠杆菌菌株Cux-Stx2eB以原始名称:Cux-SLT-IIe-B,保藏在
德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 Brauschweig)。
该保藏单位指定的该微生物保藏号为DSM 12721。申请人案卷号国际申请号
关于保藏的微生物的说明
(PCT实施细则第13条之二)A.以下所作的说明涉及说明书第12页第2-5行所指的微生物。B.保藏物标识 更多的保藏物标识见附页口保藏单位名称:DSMZ-德意志微生物保藏中心保藏单位地址(包括邮政编码和国家):Mascheroder Weg 1bD-38124 Braunschweig/DE保藏日期:1999年03月09日保藏编号:DSM 12721C.其它说明(如果不适用则留空) 该信息续在附页上口微生物的科学名称、特征,接收处发布的保藏证明和存活证明见下列文件: 申请人在1999年3月5/8日第一次保藏期间所作的声明,及附件(附件1); 1999年3月11日DSMZ第一次保藏期间发布的保藏证明(附件2); 1999年3月11日DSMZ发布的存活证明(附件3)D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)E.单独提交的说明(如果不适用则留空)以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质,如“保藏编号”) 本栏由受理局填写口本页和国际申请一起收到核准人签字 本栏由国际局填写口国际局于以下日期收到本页: 年 月 日核准人签字PCT/RO/134表