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1、10申请公布号CN104115873A43申请公布日20141029CN104115873A21申请号201410350082222申请日20140722A01N63/00200601A01P3/0020060171申请人山西昌鑫生物农业科技有限公司地址045209山西省阳泉市平定县龙川工业园区72发明人陈冬至杨丽丽杨文艳刘李玄牝74专利代理机构山西五维专利事务所有限公司14105代理人雷立康54发明名称一种生物复合型木霉抑制剂及其制备方法57摘要本发明属于防治食用菌木霉污染的微生物技术领域，具体涉及一种生物复合型木霉抑制剂及其制备方法。本发明的目的是解决现有防治木霉的药剂存在防治效果低、残留。
2、量大和成本高的问题。本发明技术方案为一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液按照重量比为1551的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；或者将两种发酵液的菌体过滤后剩余的滤液按照重量比为1551的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂。本发明具有治愈率高、环保无害的优点。51INTCL权利要求书1页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页10申请公布号CN104115873ACN104115873A1/1页21一种生物复合型木霉抑制剂，其特征在于它是由枯。
3、草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液按照重量比为1551的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；或者将两种发酵液的菌体过滤后剩余的滤液按照重量比为1551的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。2权利要求1所述的生物复合型木霉抑制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤1单菌种发酵液的制备枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液的制备将枯草芽孢杆菌ACCC11088在无菌条件下接种。
4、到液体培养基中，在30、180R/MIN条件下发酵培养，镜检80形成芽孢制成，其中所述的液体培养基为各组分在10L蒸馏水中的含量为蛋白胨911G，牛肉膏35G，氯化钠4555G，PH调至7274之间；泾阳链霉菌ACCC40041发酵液的制备泾阳链霉菌ACCC40041在无菌条件下接种到高氏号液体培养基中，在28、180R/MIN条件下发酵培养，发酵进行57天制成，其中所述高氏号培养基为各组分在10L蒸馏水中的含量为可溶性淀粉1823G，硝酸钾1G，磷酸氢二钾0406G，七水硫酸镁0406G，氯化钠0406G，七水硫酸亚铁001G，PH调至7476之间；2复合木霉抑制剂的制备将步骤1制备得到的枯。
5、草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液按照重量比为1551的比例混合制成；或者是将枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液分别过滤，取各自的滤液按照重量比为1551的比例混合制成。权利要求书CN104115873A1/7页3一种生物复合型木霉抑制剂及其制备方法技术领域0001本发明属于防治食用菌木霉污染的微生物技术领域，特别涉及一种生物复合型木霉抑制剂及其制备方法。背景技术0002木霉引起的绿霉病是食用菌生产过程中最大的威胁，生产上通常采用化学药剂防治，一旦在出菇期采用不得当的农药防治，就会造成农药的残留。且长时间使用单一化学药剂。
6、会使病害抗性增强，防治效果降低，且残留量大，对人体健康构成威胁，并且污染环境。近年来国内外开发代替化学农药的植物提取物如木醋液、植物熏蒸物、小桐子提取物一类提取物质控制木霉危害，虽然抑菌效果较好，但以上成品制造成本高、产率较低。因此利用微生物防治木霉具有较好的应用前景。目前已有用来防治木霉的微生物菌株以及抗生素，如枯草芽孢杆菌、纳他霉素等。虽然微生物对木霉的抑制效果较好，但是将能够抑制木霉的微生物菌株复配从而达到更好的抑制效果，并没有报道。发明内容0003本发明的目的是解决现有防治木霉的药剂存在的防治效果低、残留量大和制造成本高的技术问题，提供一种生物复合型木霉抑制剂及其制备方法。0004为解。
7、决上述技术问题，本发明采取的技术方案为0005一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液按照重量比为1551的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；或者将两种发酵液的菌体过滤后剩余的滤液按照重量比为1551的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0006本发明生物复合型木霉抑制剂的制备方法包括如下步骤00071单菌种发酵液的制备0008枯草芽孢杆。
8、菌ACCC11088发酵液的制备将枯草芽孢杆菌ACCC11088在无菌条件下接种到液体培养基中，在30、180R/MIN条件下发酵培养，镜检80形成芽孢制成，其中所述的液体培养基为各组分在10L蒸馏水中的含量为蛋白胨911G，牛肉膏35G，氯化钠4555G，PH调至7274之间；0009泾阳链霉菌ACCC40041发酵液的制备泾阳链霉菌ACCC40041在无菌条件下接种到高氏号液体培养基中，在28、180R/MIN条件下发酵培养，发酵进行57天制成，其中所述高氏号培养基为各组分在10L蒸馏水中的含量为可溶性淀粉1823G，硝酸钾1G，磷酸氢二钾0406G，七水硫酸镁0406G，氯化钠0406G。
9、，七水硫酸亚铁001G，PH调至7476之间；00102复合木霉抑制剂的制备说明书CN104115873A2/7页40011将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液按照重量比为1551的比例混合制成；0012或者是将枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液分别过滤，取各自的滤液按照重量比为1551的比例混合制成。0013本发明复合木霉抑制剂由两种有益微生物复合而成，分别是中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心保存的枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041。它们能够在食用菌菌丝生长初期有效的。
10、抑制食用菌木霉的生长，同时不会抑制食用菌菌丝的生长，且对人畜无毒无害。0014为进一步表明本发明生物复合型木霉抑制剂的效果，本发明做了如下实验0015一、从发病的平菇、香菇和金针菇的栽培料中分离木霉真菌，为木霉拮抗实验提供病原菌，具体步骤如下00161、从发病的平菇、香菇和金针菇栽培料或子实体上挑取木霉孢子于PDA平板上，置于26培养，观察培养好的平板，选择生长数量多的、绿色菌落进行纯化，挑取菌丝划线于PDA平板上，26培养，待得到纯的菌落后，接种于PDA斜面试管，保存于4冰箱中；纯化的木霉菌在PDA培养基上于26黑暗培养,每天观察菌落的形态特征和颜色,测量菌落直径并挑取菌丝及孢子制片,于显微。
11、镜下观察分生孢子梗分枝方式、产孢细胞和孢子的形态；00172、经分离纯化，从香菇上分离出一株木霉菌编号为XG，从平菇上分离出两株木霉菌编号为M3，M5，从金针菇上分离出一株木霉菌编号为JZG，各菌株的特征为如下0018XG在PDA平板上，菌落初呈白色绒状,后期出现轮状的菌丝密实产孢区，颜色为绿色至深绿色，分生孢子梗呈环状排列，次级分枝单个或以23个为一组，大角度伸出，分枝弯曲或波状，瓶梗基部缢缩，中部较宽，从中部以上变窄形成长颈，分生孢子呈球形，表面有刺。0019M3菌丝生长快，背面无色至淡黄色，菌落初呈白色，后变成绿色,后期在菌落中间有一圈明显的产孢区，分生孢子梗分枝多，分枝角度大，瓶梗细长。
12、，对生、轮生于孢子梗上，末端瓶梗较长，分生孢子呈椭圆形或卵圆形。0020M5菌落初呈白色，后变成绿色,后期在菌落中间有一圈明显的产孢区，分生孢子梗分枝多，分枝角度大，瓶梗细长，对生、轮生于孢子梗上，分生孢子呈短柱状。0021JZG菌丝生长很快，背面无色或暗黄色。菌落初呈白色绒状，后变为绿色至深绿色，后期出现轮状的菌丝密实产孢区，分生孢子梗分枝少，次级分枝单个或23个为一组，大角度伸出，分枝略呈弯曲状。0022二、食用菌感染木霉治疗实验0023实验方法00241、栽培袋的制备0025将平菇栽培原料棉籽皮和玉米芯经过简单的发酵处理后约5天左右，装袋，并接种平菇菌种，待平菇菌丝体生长至35CM左右时。
13、备用。00262、各种拮抗菌株的制备0027分别配制普通、高氏液体培养基，在28下摇瓶培养，菌液培养完成后备用。00283、病原菌返接说明书CN104115873A3/7页50029将M5、M3、XG和JZG病原菌活化后，用移液枪吸取01ML定量的注入到菌袋中，培养23天后备用。00304、病原菌治疗0031待病原菌生长到38CM时，用注射器吸取枯草芽孢杆菌ACCC11088泾阳链霉菌ACCC40041原液、10倍稀释液和过滤液的菌液注入病原菌部位，保证拮抗菌液接触到病原菌，测定各处理的治愈率。0032实验结果原液处理组对四个木霉病原菌治愈率达到88、93、90、91；十倍稀释液处理组对四个木。
14、霉病原菌治愈率达到75、81、84、84；菌体过滤液处理组对四个木霉病原菌治愈率达到85、91、90、91；空白对照的治愈率为5、5、10、9。具体数据见表1。0033上述实验表明，本发明对平菇、香菇、金针菇的木霉抑制率达到8591。0034表1复配组合对XG、JZG、M3和M5病原菌的治疗效果0035具体实施方式0036实施例10037一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液按照重量比为11的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数。
15、为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0038具体制备方法包括如下步骤说明书CN104115873A4/7页600391单菌种发酵液的制备0040枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液的制备将枯草芽孢杆菌ACCC11088在无菌条件下接种到普通液体培养基中，所述的液体培养基为各组分在10L蒸馏水中的含量为蛋白胨10G，牛肉膏3G，氯化钠5G，PH调至7274之间，30、180R/MIN条件下发酵培养，镜检80形成芽孢即可。0041泾阳链霉菌ACCC40041发酵液的制备泾阳链霉菌ACCC40041在无菌条件下接种到高氏号液体培养基中，所述高氏号。
16、培养基为各组分在10L蒸馏水中的含量为可溶性淀粉20G，硝酸钾1G，磷酸氢二钾05G，七水硫酸镁05G，氯化钠05G，七水硫酸亚铁001G，PH调至7476之间，28、180R/MIN条件下发酵培养，发酵进行57天即可。00422复合木霉抑制剂的制备0043将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液按照重量比为11的比例混合制成。0044实施例20045一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液按照重量比为13的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂。
17、；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0046具体制备方法包括如下步骤00471单菌种发酵液的制备0048采用本实施例1的方法，制得单菌种发酵液。00492复合木霉抑制剂的制备0050将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液按照重量比为13的比例混合制成。0051实施例30052一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液按照重量比为。
18、15的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0053具体制备方法包括如下步骤00541单菌种发酵液的制备0055采用本实施例1的方法，制得单菌种发酵液。00562复合木霉抑制剂的制备0057将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液按照重量比为15的比例混合制成。0058实施例40059一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培。
19、养制成发酵液，然后将两种发酵液按照重量比为21的说明书CN104115873A5/7页7比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0060具体制备方法包括如下步骤00611单菌种发酵液的制备0062采用本实施例1的方法，制得单菌种发酵液。00632复合木霉抑制剂的制备0064将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液按照重量比为21的比例混合制成。0065实施例50066一种生物复合型木霉抑制剂，它是。
20、由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液按照重量比为51的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0067具体制备方法包括如下步骤00681单菌种发酵液的制备0069采用本实施例1的方法，制得单菌种发酵液。00702复合木霉抑制剂的制备0071将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液按照重量比为51的比例混合制成。0072实施。
21、例60073一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液的菌体过滤后剩余的滤液按照重量比为11的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0074具体制备方法包括如下步骤00751单菌种发酵液的制备0076采用本实施例1的方法，制得单菌种发酵液。00772复合木霉抑制剂的制备0078将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌AC。
22、CC40041发酵液的菌体过滤后，滤液按照重量比为11比例混合制成。0079实施例70080一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液的菌体过滤后剩余的滤液按照重量比为12的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。说明书CN104115873A6/7页80081具体制备方法包括如下步骤00821单菌种发酵液的制备0083采用本实施例1的方法，制得单。
23、菌种发酵液。00842复合木霉抑制剂的制备0085将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液的菌体过滤后，滤液按照重量比为12比例混合制成。0086实施例80087一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液的菌体过滤后剩余的滤液按照重量比为14的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0088具体制备。
24、方法包括如下步骤00891单菌种发酵液的制备0090采用本实施例1的方法，制得单菌种发酵液。00912复合木霉抑制剂的制备0092将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液的菌体过滤后，滤液按照重量比为14比例混合制成。0093实施例90094一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液的菌体过滤后剩余的滤液按照重量比为31的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML。
25、，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0095具体制备方法包括如下步骤00961单菌种发酵液的制备0097采用本实施例1的方法，制得单菌种发酵液。00982复合木霉抑制剂的制备0099将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液的菌体过滤后，滤液按照重量比为31比例混合制成。0100实施例100101一种生物复合型木霉抑制剂，它是由枯草芽孢杆菌ACCC11088和泾阳链霉菌ACCC40041分别进行单菌种发酵培养制成发酵液，然后将两种发酵液的菌体过滤后剩余的滤液按照重量比为51的比例混合均匀制成生物复合型木霉抑制剂；其中生物复合型木霉抑制剂中枯草芽孢杆菌ACCC11088的菌数为05亿/ML40亿/ML，泾阳链霉菌ACCC40041的菌数为05亿/ML20亿/ML。0102具体制备方法包括如下步骤01031单菌种发酵液的制备0104采用本实施例1的方法，制得单菌种发酵液。说明书CN104115873A7/7页901052复合木霉抑制剂的制备0106将步骤1制备得到的枯草芽孢杆菌ACCC11088发酵液和泾阳链霉菌ACCC40041发酵液的菌体过滤后，滤液按照重量比为51比例混合制成。说明书CN104115873A。