用于关节软骨愈合和修复的方法和组合物 发明领域
本发明涉及组织修复领域，具体地说，涉及稳定的功能性关节软骨修复再生。因此，本发明可以用于整复外科或用于关节软骨再生或修复的其它方法。
发明背景
关节软骨损伤的修复仍是当前矫形外科学的一个挑战。目前的几种治疗策略基于软骨组织和骨软骨组织的移植。自体骨软骨移植提供了最合适的生理材料。然而，供体组织是有限的，通常需要在第二个部位接受手术，以获得用于移植的组织。因此，尽管在该领域进行了相当大的努力，但仍需要一种关节软骨缺损和损伤修复的有效方法，提供适当的生理修复，而不需要从患者收集自体组织。
发明概述
本发明提供用于合乎生理要求的功能性组织修复再生的方法和组合物，用于修复关节软骨损伤和缺损。具体地说，本发明包括治疗关节软骨损伤或缺损患者的方法。本发明的方法和组合物的优点是它们利用骨形态发生蛋白(BMP)，所述蛋白已知具有骨发生和/或软骨发生特性，并且可以通过重组DNA技术来生产，因此具有可能无限的供应。本发明的方法和组合物的另一优点是：可以加速功能性关节软骨的再生，或功能性关节软骨的再生可能具有更大地最终强度和稳定性，并且在缺损或损伤部位形成的组织是合乎生理要求的。
应用BMP增进关节软骨缺损和损伤的修复可能产生更好的骨关节炎治疗方法，因此避免、延迟或减小对人工髋关节置换和其它常用干涉的需要。临床前评估表明，rhBMP-2改善了兔子关节软骨全厚度缺损的早期愈合。
发明详述
按照本发明，提供用于治疗患有某些形式的关节软骨损伤或缺损的患者的方法和组合物。所述损伤可能是急性压迫的结果、或诸如由于参加体育运动或可能撕裂、擦伤或者伤害关节软骨的意外发生所引起的损伤。
所述方法和组合物的优点是：修复或改善关节软骨缺损、特别是全厚度关节软骨缺损。其它缺损也可以用本发明的方法和组合物治疗，特别是加上使所述缺损部位进一步加重以便到达作为基础的软骨下骨的另一种方法。
在本发明中，将活性生长因子例如一种BMP加入合适的组织源中。所述组织源或者可以是该患者自体的骨软骨移植物，或者可以包含同种移植物或人工制备的组织。在一个优选实施方案中，所述组织源可以是软骨细胞的细胞培养物，例如已经通过离体细胞培养法、并且加入或不加入额外的生长因子制备的软骨细胞或干细胞培养物。例如，参见US5226914、US581 1094、US5053050、US5486359、US5786217和US5723331的说明书。所有这些申请的说明书均通过引用结合到本文中。
所述组织也可以用传统的基于非细胞培养的方法获得，采用例如镶嵌成形术(mosaicplasty)的技术，其中用市售的仪器例如Acufex7[Smith和Nephew，Inc.，Andover MA]、COR系统[InnovasiveTechnologies，Marlborough MA]或Arthrex7骨软骨自体移植物转移系统[Arthrex，Munich，德国]收集软骨。所获得的组织可以直接用于本发明方法中，或可以与上述基于组织的细胞培养系统相结合。
生长因子
用于本发明中的活性生长因子最好来自通常称为骨形态发生蛋白(BMP)的蛋白亚类，它们已经被公开为具有骨发生、软骨发生和其它生长和分化类型的活性。这些BMP包括rhBMP-2、rhBMP-3、rhBMP-4(也称为rhBMP-2B)、rhBMP-5、rhBMP-6、rhBMP-7(rhOP-1)、rhBMP-8、rhBMP-9、rhBMP-12、rhBMP-13、rhBMP-15、rhBMP-16、rhBMP-17、rhBMP-18、rhGDF-1、rhGDF-3、rhGDF-5、rhGDF-6、rhGDF-7、rhGDF-8、rhGDF-9、rhGDF-10、rhGDF-11、rhGDF-12、rhGDF-14。例如在美国专利5,108,922、5,013,649、5,116,738、5,106,748、5,187,076和5,141,905中公开的BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7；在PCT说明书WO91/18098中公开的BMP-8；和在PCT说明书WO93/00432中公开的BMP-9、在美国专利5,637,480中公开的BMP-10、在美国专利5,639,638中公开的BMP-11、或在美国专利5,658,882中公开的BMP-12或BMP-13、在美国专利5,635,372中公开的BMP-15以及在共同待审的专利申请序号08/715,202中公开的BMP-16。也可能有用的其它组合物包括Vgr-2和任何生长分化因子(GDF)，包括在PCT申请WO94/15965、WO94/15949、WO95/01801、WO95/01802、WO94/21681、WO94/15966、WO95/10539、WO96/01845、WO96/02559和其它申请中公开的那些因子。在本发明中也有用的是在WO94/01557中公开的BIP、在JP公布号7-250688中公开的HP00269和在PCT申请WO93/16099中公开的MP52。所有这些申请的说明书均通过引用结合到本文中。上述蛋白和修饰的蛋白或其部分缺失产物的异二聚体也可用于本发明。这些蛋白可以单独地使用，或作为两种或更多种蛋白的混合物使用，最好使用rhBMP-2。
BMP可以重组产生，也可以从蛋白组合物中纯化。所述BMP可以是同二聚体，或者可以是与其它BMP的异二聚体(例如由BMP-2和BMP-6各一个单体组成的异二聚体)或与TGF-β超家族其它成员例如活化素、抑制素和TGF-β1的异二聚体(例如由一种BMP和一种TGF-β超家族的相关成员各一个单体组成的异二聚体)。这类异二聚体蛋白的实例描述于例如公开的PCT专利申请WO93/09229中，其说明书通过引用结合到本文中。此中有用的骨发生蛋白的量是有效刺激浸润性祖细胞的骨发生活性增加的量，这将取决于待治疗的缺损的大小和性质、以及使用的载体。一般而言，待传递的蛋白量范围为约0.05mg至约1.5mg。
在一个优选实施方案中，所述骨发生蛋白与能够诱导腱样组织或韧带样组织形成的有效量的蛋白一起给予。这类蛋白包括BMP-12、BMP-13和BMP-12亚家族的其它成员以及MP52。这些蛋白及其在腱样组织和韧带样组织再生方面的应用公开于1994年12月22日申请的美国申请序号08/362,670中，其说明书通过引用结合到本文中。在另一优选实施方案中，按照下述方法，给予其中一种单体单位是一种骨发生蛋白例如BMP-2、而另一种单体亚单位是腱诱导蛋白例如BMP-12的一种异二聚体，以诱导结缔组织和骨之间形成功能连接。
生长因子的应用
生长因子可以以缓冲液的形式应用于组织源。一种优选的缓冲液是除包含所述活性生长因子外还包括约1.0至约10.0％(w/v)甘氨酸、约0.1至约5.0％(w/v)糖最好是蔗糖、约1至约20mM谷氨酸盐酸盐和任选的约0.01至约0.1％非离子表面活性剂例如多乙氧基醚的组合物。优选的溶液是约1％至约20％w/v纤维素载体/缓冲液。如有需要，可以加入一种盐。
可适用于本发明方法和组合物中的生长因子应用方面的其它材料包括透明质酸、手术用网或缝线、polyglyconate、温度敏感聚合物、脱矿质骨、矿物质和陶瓷，例如磷酸钙、羟基磷灰石等，以及上述材料的组合。然而在本发明的优选实施方案中不使用载体。
在例如上述的适当缓冲液中或者与合适的载体组合的本发明的生长因子，可以直接应用于需要组织修复的组织和/或部位。例如，所述生长因子可以通过喷雾或浸渍、或用刷或其它合适的涂药器例如注射器，物理应用于所述组织。或者，或另外，可以将所述蛋白直接应用于需要组织修复的部位。
以下实施例用BMP-2进一步描述本发明实施方案的实施。所述实施例不是限制性的，正如本领域技术人员将认识到的，可以根据上述具体描述而变化。
实施例
I.兔同种移植物
所有步骤均由IACUC批准进行。使用12只雄性新西兰白兔(6月龄)。2只兔子作为供体，10只兔子用作受体。从供体的滑车沟(trochlear groove)或股骨中髁获得骨软骨移植物(直径为3.5mm)，将其移植到受体滑车沟中3.5mm深的缺损中。在移植之前，将移植物或者浸入rhBMP-2(0.5 mg/ml)中或者浸入缓冲液对照中。手术后4周处死兔子，如Sellers等，J.Bone Joint Surg.，79-A：1452-1463(1997)描述的，通过组织学的组织化学分级标准，评估移植物和周围组织。也进行组织切片的计算机控制图象分析。用非成对Students t检定评估结果。
肉眼检查时，关节未显示出炎症体征。所有缺损均充填修复组织。缺损的表面外观是可变的，但是可接受的，并且与处理形式无关。在3个关节(实验组中有2个，对照缓冲液组中有1个)中发现骨赘。
在任何缺损的肉眼检查外观和组织学外观之间没有关联。在供体软骨陷窝中软骨细胞的存在和细胞的散在克隆表明该组织存活。供体软骨的局灶性退化在对照组的所有兔子中均存在，但仅在rhBMP-2处理组中的1只兔子中存在。rhBMP-2处理组中缺损的愈合与对照组相比显著增加。rhBMP-2处理组的骨整合(bony integration)改善，表现为软骨下骨腔隙中纤维性修复组织较少。用rhBMP-2处理也导致高于原始潮痕(tidemark)的软骨更多，明显地由供体组织和新再生的受体软骨两者组成。在这两组之间观察到的骨总量没有显著差异。
表I
软骨修复的组织学计分和组织形态测定的测量结果，平均值(SD)参数rhBMP-2对照平均计分**10.0(5.42)*20.6(5.18)不足潮痕的骨％73.26(13.28)62.88(18.07)不足潮痕的纤维组织％2.19(2.04)15.81(9.88)高于潮痕的软骨％74.70(41.08)*18.17(26.70)缺损填满％96.53(4.86)*88.79(8.04)
*与对照有统计学显著差异(p＜0.05)。
**标准系统范围为0(正常软骨)至31(未修复)。
另一组织形态测定分析数据进一步支持rhBMP-2对移植物愈合的有益效应。例如，已经表明，高于潮痕的新组织在rhBMP-2处理组充填的百分比为81.52％，而在对照中为57.63％。在rhBMP-2处理组中(23.83％)移植物软骨退化比对照组(44.52％)少。移植物或新形成的软骨与宿主软骨的整合在rhBMP-2处理组(56.48％)中比对照组(21.89％)有所改善。在rhBMP-2的影响下，或者在移植物边缘或者在移植物顶部形成更新的软骨，在移植物边缘，这消除了移植物和宿主之间的间隙，而在移植物顶部，使得移植物与关节表面更好地融合。
上述结果表明，关节软骨缺损中的同种异体骨软骨移植物的愈合由于加入rhBMP-2而得到改善。所述活性生长因子可能加速了软骨下骨的愈合，为关节软骨组织提供支持和营养。生长因子的加入也可能刺激了骨髓和/或滑膜组织中由受体间质干细胞形成新的软骨。这些结果表明，活性生长因子特别是骨形态发生蛋白和骨软骨同种移植物的组合可能提供用于治疗关节软骨缺损、特别是全厚度关节软骨缺损的有效策略。II.兔自体移植物
从兔子的滑车沟或股骨髁获得骨软骨移植物(直径为2.7mm，长3.0mm)，将其移植到该兔子的滑车沟或膝关节的股骨髁上宽2.7mm、长3.5mm的供体部位中。在移植之前将缓冲液滴加到一半动物的所述受体部位，然后将该移植物浸入缓冲液中2分钟，然后置于受体部位中。在移植之前将51μg rhBMP-2滴加到另一半动物的受体部位，然后将该移植物浸入含500μg/ml rhBMP-2的缓冲液中2分钟，然后移植到受体部位中。手术后4周处死动物，用组织学的组织化学分级标准[Sellers等，J.Bone Joint Surg.，79-A：1452-63(1997)]和组织的定量计算机控制图象分析，对受体部位进行组织评价。数据表明，用rhBMP-2处理改善了自体移植物的愈合。最突出的效应是移植物软骨退化减少(rhBMP-2的8.18％对对照的36.25％)以及移植物边缘形成更多的软骨(rhBMP-2的88.23％对对照的50％)。III.非人类灵长类自体移植物：
用于自体移植物实验的非人类灵长类是南美弥猴(cynomologousmacaques)。从6只南美弥猴的滑车沟收集骨软骨移植物(3.5mm直径×6mm长)，将其移植到钻入同一动物(总共n＝12移植物)的股骨中髁和股骨侧髁中的受体部位。在移植之前，将25μg rhBMP-2滴入6个受体部位，然后将来自那6个移植物的移植物浸入1.25mg/ml rhBMP-2的溶液中达2分钟。在另外6个移植物中，仅将缓冲液滴入受体部位，并且在移植之前将移植物浸入单独的缓冲液中2分钟。手术后用石膏固定肢体达2周，手术后9周将动物处死。
所有动物的膝关节功能均正常。肉眼检查时，关节没有显示出炎症体征。在任一关节中没有发现骨赘。虽然在肉眼检查时缺损表面看来与周围软骨齐平，但显微镜观察表明，在大多数情况下移植物下沉。肉眼观察到的覆盖表面的组织实际上是在移植物顶部新形成的组织。由不知情的评价人员进行计算机控制图象分析，以对缺损充填百分比、形成的高于原始潮痕的新组织类型以及移植物和周围的软骨整合进行定量。在rhBMP-2处理组的所有这些参数中，均观察到良好结果。在移植物和宿主软骨之间形成更新的软骨，消除了间隙，导致移植物与周围软骨之间更好地整合(rhBMP-2 88.59％对对照64.82％)。在rhBMP-2处理组(95.02％)中软骨缺损的充填比对照组(86.68％)要好。在对照组中有更多的纤维组织(11.90％对rhBMP-2的5.65％)，而在rhBMP-2处理组中发现更多的过度型组织(36.38％对对照20.53％)。两组之间在总体组织学的组织化学计分上没有显著差异。外周定量计算机控制断层扫描术(pQCT)表明，随着时间的推移在供体部位中骨密度增加。手术后6周和9周时，与对照部位相比，用rhBMP-2处理的供体部位中的组织明显更为致密，愈合过程更为提前。在组织学上，在所有情况下供体部位都含有再生的骨小梁与表面的纤维组织。IV.rhBMP-2的活体外保留：
用来自非人类灵长类的移植物，评价采用该技术的rhBMP-2在骨软骨移植物的保留。将移植物浸入125I标记的rhBMP-2和未标记的rhBMP-2的混合物溶液中。结果表明，被吸收到移植物中的rhBMP-2的量与该蛋白的浓度以及浸泡时间成比例。影响rhBMP-2保留的其它因素包括移植物的大小和骨小梁之间骨髓成分的存在。V.rhBMP-2的体内保留时程：
在兔子中评价rhBMP-2在骨软骨移植物中的保留时程。在移植之前，将含有5ug rhBMP-2和20 uCi125I的125I标记的rhBMP-2和未标记的rhBMP-2的混合物溶液加样至移植物上。在手术后继续的22天时间内，用γ-摄像机扫描所述动物。与用胶原蛋白海绵作为载体的时程相比，rhBMP-2在骨软骨移植物中的半衰期从1天增至3天。10％的起始点放射性的保持从胶原蛋白海绵的11天变为移植物的22天。VI.非人类灵长类同种移植物：
从12只成年南美弥猴的滑车沟取出供体部位(3.5mm宽×6mm长)，并将其移植到非相关个体的股骨中髁和侧髁中的3.5×6mm的受体部位中。在移植之前，将一半的移植物浸泡在1.25mg/ml rhBMP-2中2分钟，而将另一半移植物在缓冲液中浸泡。在首次手术后7周，对另一肢体实施同样的步骤。在每次手术后，手术后以石膏(in a cast)固定肢体2周，在第二次手术后9周处死动物，用于组织学分析。
这些结果表明，活性生长因子(特别是骨形态发生蛋白)和骨软骨自体移植物的组合，可能提供一种治疗关节软骨缺损、特别是全厚度关节软骨缺损的有效的策略。在其它实施方案中，也将BMP-2应用于冷冻的骨软骨同种移植物，用于治疗局灶性关节软骨缺损。
上述描述详细说明了本发明目前优选的实施方案。预计本领域技术人员在考虑这些描述时，会想到本发明实施中的许多修改和变化。那些修改和变化被认为包括在所附权利要求书中。