相分离法纯化质粒DNA方法 【技术领域】
本发明涉及一种采用新型的两相法使DNA与其他生物大分子分离开来。而且能同时分离到不同的细菌组分，为这些细菌组分的分离纯化提供了便利的条件。
背景技术
传统的质粒DNA纯化方法是用SDS(十二烷基磺酸钠)、TX-100等试剂裂解细菌，使质粒DNA释放到上清中，再经酚、氯仿抽提去除蛋白质，上清中的质粒DNA经乙醇或异丙醇沉淀回收。但是这样纯化的质粒DNA中仍存留大量的蛋白质、脂多糖、多糖等物质，这些物质严重干扰了许多重要的生物学实验结果，尤其细胞转染、基因治疗、DNA疫苗免疫等生物学研究对质粒DNA的纯度要求更高，这种纯化方法已不能满足对质粒DNA纯度上的要求，需采用其它形式的纯化方法来分离纯化质粒DNA。
另有文献报道采用了DEAD-silica树脂(resin)来纯化质粒DNA。DNA分子上带有磷酸根基因，使DNA分子带负电荷。在silica上DEAE基团密度远高于传统多糖类树脂上的DEAE密度，使DNA更为牢固地结合到这种含高密度DEAE的树脂上的，而且需用很高的盐浓度才能将DNA洗脱下来，但蛋白质等其它杂质在较低的盐浓度时就被洗脱下来，DNA与其它杂质达到完全分离。但这种情况只有在生物大分子表面未结合SDS等阴离子时才出现。但是，在含质粒DNA的上清中，实际上存留了大量与SDS结合的变性蛋白质、LPS、多糖。SDS分子带有硫酸根基因，带负电荷，能与蛋白质等分子牢固结合，造成这些分子表面带有大量负电荷，大大改变了原来的层析行为，使蛋白质、LPS和多糖地洗脱条件发生了根本变化，无法完全将DNA与蛋白质、LPS等杂质彻底地分离开来。
中国专利文献CN1378592A公开了“在无RNA酶和有机溶剂的条件下应用切向流过滤来纯化质粒DNA的方法”，该方法包括如下步骤：(a)消化所述细胞；(b)将细胞培养约4到24小时以进行裂解并溶解，但不对RNA进行酶促消化；(c)除去来自细胞的裂解物杂质以提供一种质粒DNA溶液；(d)使该溶液流经切向流过滤装置而过滤，以获得含有该质粒DNA的回流液；(e)回收该回流液。该法分离速度和效果不够理想。
【发明内容】
本发明需要解决的技术问题是，克服背景技术的不足，提供了一种使DNA与其他生物大分子分离开来，分离速度和效果都较好的DNA纯化方法。
本发明的相分离法纯化质粒DNA方法，其特征在于按如下操作步骤：
1)加液悬浮：含质粒的细菌液离心弃上清后，加细菌悬浮液使彻底悬浮；
2)加碱裂解：加细菌裂解液温和混匀，使菌体充分裂解，形成透亮溶液；
3)中和凝集：加中和缓冲液温和混匀，至形成凝集块；
4)成相分离：加分相溶液温和混匀，形成乳浊液，离心，弃上相，将下相转入微量滤器滤去残留的相间沉淀；
5)过滤回收：在滤液中加DNA结合溶液转入DNA制备管，用负压或离心法使溶液滤过硅胶膜，使DNA结合到硅胶膜上而得到浓缩和回收。
上述步骤1)、2)和5)为常规步骤。3)到4)为新型的相分离体系。在这个体系中，首先必需含有在乙醇/异丙醇高度不溶解的盐，而且蛋白质，LPS(细菌脂多糖)，RNA以及脂质在该盐中将变性析出或不溶解，相反DNA必须完全溶解。硫酸铵、氯化铯具备这样的特性。由于硫酸铵价格低廉，而且又是蛋白质LPS，RNA的有效变性剂。在这个体系中细菌经SDS/NaOH溶解并释放出质粒DNA后，用含硫酸铵的溶液中和，使蛋白质变形并与基因组DNA形成紧密的不溶性复合物。但是这时溶液体系中硫酸铵浓度不足以使其他杂质都有效沉淀下来。在加入有机溶液乙醇∶异丙醇(v/v＝2～10∶1)后，水份被抽提到了有机相(上相)中，使无机相中的硫酸铵浓度几乎达到了饱和状态，呈高度的脱水状态。除了质粒DNA仍呈溶解状态位于下相外，细菌脂溶性成分被抽提到上相，所有其他的细菌成份由于与饱和硫酸铵和乙醇∶异丙醇都不相容而被变性沉淀出来，RNA由于密度大，被离心沉淀在管底，其他变性成份沉淀在相间。
纯化的关键性原理就是在饱和状态的硫酸铵中质粒DNA仍保持完全的溶解状态，而其他杂质被完全变性并沉淀出来。加入乙醇∶异丙醇混合溶剂使含硫酸铵溶液中的水份被抽提走，使下相达到近饱和状态的硫酸铵溶液。形成这两相体系的关键是(1)含一定浓度硫酸铵的溶液；(2)一定体积和一定比例的乙醇∶异丙醇溶剂。如果硫酸铵浓度过低，不易形成两相，而且硫酸铵会析出。浓度太高，硫酸铵也会析出。仅当加入适当比例体积的乙醇∶异丙醇混合溶剂时才能形成两相系统，并使下相中的硫酸铵的浓度达到近饱和的状态。当加入的乙醇∶异丙醇混合溶剂体积过小，不能成相，反而导致硫酸铵沉淀。体积过大，也形成沉淀，尽管DNA并不析出，但不利于后续的操作。乙醇也可以与硫酸铵的溶液形成两相体系，但所需的乙醇体积过大，而且比例稍有偏差，会导致或者不能成相，或者造成硫酸铵沉淀析出。加一定量的异丙醇，硫酸铵溶液与乙醇∶异丙醇有机溶剂的两者的比例范围大大加宽。
所述的中和缓冲液为硫酸铵(或氯化铯)380～480克，盐酸胍28～98克，NaH2PO4·2H2O 16～18克，加水至1升；所述的分相溶液为乙醇∶异丙醇(v/v)＝2～10∶1。其中，盐酸胍能促使质粒DNA的游离性，使DNA有效进入下相，而不至于与蛋白质形成共聚凝集。
所述的中和缓冲液中加有促使盐析的乙酸铵36～45克，则效果更好。
常规的DNA结合溶液：5～7M盐酸胍，还有20～100mM NaH2PO4，40～200mM NaAc，pH5.0～6.0。
在实际操作中，以加液悬浮步骤结束时体积为1个体积时，在3)、4)步骤中加中和缓冲液：分相溶液(v/v)＝1.6～2.4∶2.6～3.2，就能达到所需效果。
对所加分相溶液进行预冷，可以使分相效果更好，预冷通常不高于10℃。
本发明独特的相分离只需要一步即将不同的细菌组分同时分离开来，是本发明技术的创新点。在该相分离体系中，RNA在离心过程中沉淀于管底4，基因组DNA与变性蛋白质形成不溶性复合物位于相间2，多糖、脂多糖、脂质、细菌代谢产物和色素被抽提到上相1中，而质粒DNA仍呈溶解状态位于下相3，见图1。下相中已高度纯化的质粒DNA在特定的高盐条件下结合到silica膜/上，达到快速回收和进一步纯化的目的。经洗涤液、脱盐液(100mM NH4Ac，55～70％乙醇，10mM Tris-HCl，pH7.0)洗涤去除残留在silica膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到silica膜上的质粒DNA经微量水或三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗脱下来，并可立即用于各种分子生物学实验。
用本发明相分离技术将质粒DNA分离纯化，具有分离纯度高，速度快(约10-20分钟完成)的优点，而且能同时分离到不同的细菌组分，为这些细菌组分的分离纯化提供了便利的条件。
【附图说明】
图1是相分离结果示意图。
【具体实施方式】
下面结合实施例，对本发明做进一步详细描述。在实施例中，
细菌悬浮液：含有RNase Al的25mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0；
细菌裂解液：1％SDS/0.18～0.2M NaOH(SDS：十二烷基磺酸钠)；
中和缓冲液：380～480克，盐酸胍28～98克，NaH2PO4·2H2O 16～18克，加水至1升；
分相溶液：乙醇∶异丙醇(v/v)＝2～10∶1；
DNA结合溶液：5～7M盐酸胍，还有20～100mM NaH2PO4，40～200mM NaAc，PH5.0～6.0。
一般采用，细菌悬浮液：细菌裂解液：中和缓冲液：分相溶液：DNA结合溶液(v/v)＝1∶1∶1.6～2.4∶2.6～3.2∶2。
脱盐液：100mM NH4Ac，55～70％乙醇，10mM Tris-HCl，pH7.0；
洗涤液：2.5-5M盐酸胍，20mM Tris-HCl，pH6.5-7.0；
RNase Al是100μg/ml的RNA酶组分Al；
Tris是三羟甲基氨基甲烷；
实施例1——超纯质粒DNA小量纯化
一、实验准备
1.第一次使用时，将随试剂盒携带的RNase Al(100μg/ml的RNA酶组分)全部加入细菌悬浮液(含有RNase Al的25mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)中，混合均匀，4℃密闭贮存。
2.第一次使用时，按脱盐液(100mM NH4Ac终浓度，56％乙醇，pH值7.0)试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀。室温密闭贮存。
3.使用前注意观察细菌裂解液中是否有白色沉淀出现，如有沉淀，请于37℃温育溶解，并冷却至室温再使用。
4. 4℃预冷中和缓冲液和分相溶液。
二、操作步骤
1、加液悬浮：收集1～4ml LB培养基中培养过夜的质粒菌液，12000×g离心30秒，弃尽上清。用250μl已加了RNase Al的细菌悬浮液充分悬浮细菌沉淀。
注意：细菌过量会影响裂解、中和效率。若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少。
注意：确认细菌悬浮液中已加入RNase Al；悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则会影响菌体的裂解。
2、加碱裂解：加入250μl细菌裂解液(1％SDS/0.2M NaOH，温和但充分地上下翻转混合4～6次，此步骤不宜超过5分钟。
注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染；细菌裂解液使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和细菌裂解液中的NaOH，降低溶菌效率。
3、中和凝集：加入450μl 4℃预冷的中和缓冲液(硫酸铵420克，盐酸胍47克，NaH2PO4·2H2O 16克，乙酸铵36克，加水至1升)，立即温和地上下翻转8～10次，充分混合均匀。
注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
4、成相分离：加入650μl 4℃预冷的相分离液(乙醇∶异丙醇(v/v)＝3∶1)，温和地上下翻转10次，再稍用力混合数次使溶液形成混浊的乳浊液，12000×g离心1分钟。吸弃蓝色上相，将无色下相转移至微量滤器(置于1.5ml离心管中)中，12000×g离心30秒。
注意：上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相，可在Tip头内迅速分相，易于丢弃(见图1)。如在转移过程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可在过滤时除去。
5、过滤回收：弃微量滤器，加450μl DNA结合溶液到滤液中，混合均匀。
步骤6.1可以选择负压法或离心法操作。
6.1A.负压法
6.1A.1.将DNA制备管插到负压装置的插口上。将步骤5中的混合液加入DNA制备管中，开启并调节负压，以大约每秒1滴的流速缓慢吸尽管中溶液。
6.1A.2.将负压调至最大，加500μl洗涤液，负压吸尽管中溶液。
6.1A.3.保持负压，沿管壁四周加700μl已加入无水乙醇的脱盐液，负压吸尽管中溶液；以同样的方法再用700μl脱盐液洗涤一次。
注意：确认在脱盐液中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇；沿管壁四周加入脱盐液有助于彻底冲洗掉沾在管壁上的盐份。
6.1B.离心法
6.1B.1.将DNA制备管置于2-ml微量离心管中，将步骤5中的混合液加入DNA制备管中，12000×g离心30秒。
6.1B.2.弃滤液，将DNA制备管置回到2-ml微量离心管中，加500μl洗涤液，12000×g离心30秒。
6.1B.3.弃滤液，将DNA制备管置回到2-ml微量离心管中，加700μl已加入无水乙醇的脱盐液，12000×g离心30秒，以同样的方法再用700μl脱盐液洗涤一次。
注意：确认在脱盐液中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
6.2.将DNA制备管置于1.5ml离心管中，12000×g离心1分钟。
6.3.将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加60μl Eluent或去离子水，室温静置1分钟。12000×g离心1分钟洗脱DNA。
实施例2——超纯质粒DNA中量纯化
操作步骤
1、加液悬浮：收集40ml LB培养基中培养过夜的高拷贝质粒菌液，或100ml LB培养基中过夜培养的低拷贝质粒。≥3000×g离心8min，弃上清。将离心管倒置于纸巾上数分钟，除尽上清。用4.5ml已加入RNase Al的细菌悬浮液充分悬浮细菌。
注意：细菌过量会影响裂解、中和效率及质粒DNA的得率。若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少。
注意：确认细菌悬浮液中已加入RNase Al。悬浮需均匀，不应留有小的菌块。否则会影响菌体的裂解。
2、加碱裂解：加入4.5ml细菌裂解液，温和但充分地上下翻转混合4～6次，此步骤不宜超过5分钟。
注意：细菌裂解液使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的C02中和细菌裂解液中的NaOH，降低溶菌效率；
避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
3、中和凝集：加入8ml 4℃预冷的中和缓冲液，立即温和并充分地上下翻转混合均匀，直至沉淀形成紧实的凝集块。
注意：加入中和缓冲液后，应立即混合，以避免形成局部的凝结块；避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
4、成相分离：加入12ml 4℃预冷的相分离液1，温和地上下翻转10次，再稍用力上下混合数次使溶液形成混浊的乳浊液，4℃，≥10000×g离心8分钟。吸弃蓝色上相，将下相转入中量滤器中，用推注法将溶液过滤到50ml离心管或其他容器中。
注意：上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相，可在移液滴头内迅速分相，易于丢弃。如在转移过程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可在过滤时除去。
5.过滤回收：用力上下摇晃装有DNA结合溶液-R的试剂瓶，充分悬浮其中的硅胶颗粒，加8ml DNA结合溶液-R到滤液中，混合均匀。
注意：硅胶颗粒是DNA吸附介质，需充分悬浮均匀。
步骤6.1可以选择负压法或推注法操作。
6.1A.负压法
6.1A.1.正确连接VITAGENE(中文名称)负压装置，将甲量制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤5中的混合液转移到中量制备管中，开启并调节负压，以每秒约2滴的流速缓慢吸尽管中溶液。
6.1A.2.将负压调至最大，加9ml Buffer W1，负压吸尽管中溶液。
6.1A.3.保持负压，向中量制备管中加9ml已加入无水乙醇的脱盐液，负压吸尽管中溶液。
注意：确认在脱盐液溶液中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
6.1B.推注法
6.1B.1.吸取步骤5中的混合液转移到中量制备管中，插入注射器芯，垂直向下缓慢推注，以每秒约2滴的流速排尽管中溶液。
6.1B.2.旋转取下中量制备管上含硅胶颗粒的纯化柱，退出注射器芯，再将纯化柱重新安装到注射器上，加9ml Buffer W1，插入注射器芯，垂直向下推注，排尽液体。
注意：硅胶颗粒为白色颗粒，如未见白色颗粒沉积在柱中，复查步骤7是否将硅胶颗粒充分悬浮均匀。
6.1B.3.以同样方法，用9ml已加入无水乙醇的脱盐液洗涤中量制备管。
注意：确认在脱盐液中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
6.2.旋转取下含硅胶颗粒的纯化柱，置于1.5ml离心管中，最高速度离心2分钟。
6.3.将纯化柱置于洁净的1.5ml离心管中，在硅胶颗粒上加500μl水。用Tip头轻轻搅拌硅胶颗粒使其被洗脱液完全浸透，室温静置1分钟。12000×g离心1分钟。
5.4.弃纯化柱，在洗脱的质粒DNA中加400μl异丙醇，混合均匀，12000×g离心10分钟。
5.5.仔细倒置离心管丢弃上清。加500μl-20℃预冷的70％乙醇，12000×g离心2分钟。
5.6.仔细倒置离心管丢弃上清，室温干燥10分钟。
5.7.用适量水溶解DNA沉淀。