成人骨髓间充质干细体外定向诱导分化为血管内皮细胞的一种方法 一、技术领域
本发明涉及成人骨髓间充质干细体外定向诱导分化为血管内皮细胞的一种方法。
目前国际上及国内均单纯的采用分离CD34+细胞作为诱导分化内皮细胞的前体细胞，未见有利用成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞。
近年来，干细胞特有的生物学特性及潜在的应用价值受到各国学者的高度关注。骨髓、血液和其它组织来源的造血干细胞、间充质干细胞、成血-血管细胞、血管干细胞以及其它组织干细胞为组织工程的种植细胞来源提供了可能性。外周血、骨髓来源的CD34+造血干细胞在体外诱导条件下，15～20天后可形成“鹅卵石”样(cobblestone)内皮细胞层。目前对CD34+细胞的提取、体外扩增，以及向内皮细胞定向诱导分化已具有一套完备的方法。
骨髓是由非粘附的造血干细胞和粘附性基质细胞组成，这些粘附的基质细胞中含有丰富的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs是中胚层发育的早期细胞，具有多向分化潜能的组织干细胞。不仅能分化为造血基质，支持造血，还可分化为多种造血以外的组织细胞，特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。在合适的环境和诱导因子存在下，成人骨髓MSCs能分化成多种人体组织细胞，包括骨髓基质、骨骼、软骨、肌肉、腱、脂肪、成纤维细胞和心肌细胞等；此外，从理论上讲，MSCs还可向脏器中胚层分化，如向血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)和平滑肌细胞分化，但目前国内外还未进行将MSCs体外定向分化为血管内皮细胞的实验。
二、背景技术
决定MSCs分化为ECs的关键是诱导分化的条件。在体内，组织干细胞地发生及功能获得与组织中基因编码的转录因子和细胞外信号传导有关。但在体外，组织干细胞的定向分化机理尚不十分清楚。基础营养、细胞密度、空间组织、机械力、生长因子等对MSCs的分化都有很大的影响。Tremain指出，MSCs克隆的mRNA可表达出具有内皮细胞、表皮细胞和神经细胞的特点。Lodie指出，在合适条件下，MSCs能分化为内皮细胞。研究表明，VEGF是诱导MSCs分化为ECs的关键所在。VEGF是一种酪氨酸激酶受体Flk-1/KDR和Flt-1的配基，它能特异性促内皮细胞分裂，对人骨髓髓系祖细胞有调节作用。经含人血管内皮生长因子培养大约2周后，可分化出ECs。MSCs在向ECs诱导分化过程中，并不直接分化产生ECs，而是先分化而短暂扩增细胞(transient amplifying cell)，再经过几次到十几次不等的分裂后定向分化为内皮祖/前体细胞(committedprogenitors/precursor)，进而可分化为有丝分裂后细胞(post-mitotic cells)及终未分化细胞(terminally-differentiated cells)，即内皮细胞。
三、发明内容
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的方法。
本发明的目的是提供一种骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为内皮细的方法，为体外构建心脏组织工程瓣提供一种经济、便捷、有效的获取种植细胞的新方法，以便应用于动物实验模型和临床换瓣手术。
本发明利用Percoll(1.073g/ml)从正常成人骨髓中分离出MSCs，10％FBS的LG-DMEM培养基纯化和扩增、流式细胞仪鉴定其纯度；用血管内皮生长因(VEGF)诱导MSCs向ECs分化，VIII因子(vWF)和Tie-2免疫组化和透射电镜(TEM)鉴定细胞性质。结果显示5.0×105个MSCs在体外扩增15代后，获得8.0×1012个MSCs，扩增了约1.6×107倍；MSCs在加入VEGF诱导培养大约14～21天，90％的诱导细胞对VIII因子和Tie-2相关抗原呈阳性反应；TEM可观察到胞浆内有Weible-palade小体，证实为ECs。研究结果说明成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为ECs的潜能，这为心脏组织工程瓣体外构建，尤其是在小儿先天性心脏病组织工程研究中种植细胞的来源提供了可能性。
下面用实施例对本发明进行进一步详细说明。
四、附图说明(见说明书附图页)
五、具体实施方式
实施例1 成人骨髓间充质干细胞的体外分离、纯化和扩增
一方法
1.肝素液青霉素瓶准备：在已消毒的青霉素瓶中，加入1ml肝素液(250U/ml)；
作为取骨髓时的盛器。骨髓标本每瓶取5ml即可。
肝素液的配制：2支肝素(1.25万U/支)+100ml生理盐水→250U/ml/瓶。
2.Percoll应用液的配制：
Percoll原液(密度为1.13)→贮存液→应用液(密度为1.073)
即：Percoll原液5.04ml+0.56ml 1.5M NaCl+4.4ml生理盐水＝10ml应用液
或：Percoll原液∶1.5M NaCl＝9∶1(V/V)→贮存液
贮存液∶生理盐水＝5.6ml∶4.4ml→应用液
3.取骨髓标本4～5ml/瓶+肝素液1ml/瓶→5～6ml混合液→肝素液的终浓度为40～50U/ml。
4.Percoll应用液瓶中加入骨髓，即骨髓在Percoll应用液上两。一般按2∶1(实际应用时按1∶1)，其目的是为了节约Percoll应用液。即：Percoll应用液∶骨髓＝1∶1(v/v)。
5.梯度离心。1800rpm×20min，取中间界面的单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)层面，制备MNCs悬液。
6.细胞经PBS洗涤两遍，或用LG-DMEM洗涤两遍后计数。即：MNCs+LG-DMEM 10ml→轻轻吹打，混匀→离心，1500rpm，5min洗涤MNCs→再重复一遍。
7.去除上清后，用LG-DMEM 2ml悬浮MNCs(即稀释了2倍)。
8.接种培养。接种密度为：2×105/cm2(如用25cm2的培养瓶，则乘以25)。
9.原代培养的MSCs，其培养液组成为：LG-DMEM+10％FBS(进口)。
10.在48h后镜下观察，如有贴壁细胞，则可全换培养液；如未见贴壁细胞，半量换液。11.在原代培养第一次传代后，其培养液的组成如下(25cm2培养瓶)：LG-DMEM 4.5ml
FBS(国产) 0.5ml(10％)
L-谷氨酰胺 50μl(1mmol/l)
12.贴壁层细胞达到90％以上融合后，经0.125％胰蛋白酶消化按6×103cells/cm2的密度接种于传代培养瓶(T-75)中进行扩增培养。
13.原代培养当出现典型成纤维细胞样形态和细胞密度融合达到80％～90％时，进行细胞摄像(见说明书附图1)。
注：以上操作均严格按照无菌操作规程
二.结果
经上述方法可从5.0×105个原代MSCs在体外扩增15代后，获得8.0×1012个MSCs，扩增了约1.6×107倍。
实施例2 MSCs表面抗原分子检测
一、方法
1.MSCs细胞培养扩增到第二代时，用胰蛋白酶消化收获细胞，分别取2×105个细胞与鼠抗人CD13、CD29、CD34、CD45、CD105和HLA-DR抗体室温中反应30min，用PBS洗涤两次去除未反应的抗体后与FITC标记的二抗避光反应15min。
2.取2×105个细胞与CD166直标抗体室温避光孵育20min，1％BSA-PBS清洗2遍，加入500μl PBS重悬，并设IgG1-FITC、IgGl-PE、IgG1-PC5为对照。
3.应用流式细胞仪(COULTER Epics XL-AD 2517，BECKMAN COULTER公司，美国)检测至少10,000个细胞，用Cofit软件分析结果。
二结果
流式细胞仪检测MSCs的表面抗原特性。CD34(造血干/祖细胞及内皮细胞特异性标志)、CD45(白细胞共同抗原)和HLA-DR(HLA II类分子，抗原呈递细胞及激活的T细胞表面标志)等表达呈现阴性；而CD105(主要表达于内皮细胞和活化单核细胞)、CD13(主要表达于单核细胞和粒细胞)、CD29(纤连蛋白和透明脂酸盐的受体，基质细胞表面标志)和CD166(间质细胞表面标志)表达呈现阳性，均在98％以上。经过2代以上的传代后(细胞大约分裂14次)，体外扩增的MSC在形态和细胞表型上达到了95％以上的均一(见说明书附图2)。
实施例3 MSCs向内皮细胞的定向诱导分化
一.方法
1.选择第3～10代的MSCs作为实验材料。
2.其诱导培养体系的组成为：DMEM-HG，20％FBS(天津市川页生化制品有限公司，批号：030509)、VEGF(10ng/ml，Pepro Tech EC LTD公司，英国)、bFGF(5ng/ml，Pepro Tech EC LTD公司，英国)、L-谷氨酰胺(2mmol/L)、青霉素液(100U/ml)、链霉素液(100μg/ml)。
3.每2～3d更换培养液，当贴壁层细胞达到90％以上融合后，经0.125％胰蛋白酶消化传代；按6×103cells/cm2的密度接种于25cm2培养瓶中。重复上述细胞传代的操作即可实现细胞的有效扩增。
二.结果
MSCs在加入诱导分化培养体系大约14～21d后，形态多不固定，贴壁的细胞表现为较大，呈扁平、大多角形、长梭形、园形、椭原形或板状，细胞有丰富的胞浆和不规则突起。长成单层的胞，呈典型的“鹅卵石”样，为内皮细胞形态学特征(见说明书附图3)。
实施例4 MSCs定向诱导分化的内皮细胞鉴定
一.方法
1.当光镜下诱导的细胞长成单层，呈“鹅卵石”(cobblestone)样时制备细胞悬液，分别用5％戊二醛和1％四氧化锇固定，制成电镜标本行透射电镜(TEM，JEM-1010，日本)观察。
2.VIII因子(vWF)和Tie-2相关抗原的免疫组化检测(ABC酶标记法)：选择MSCs经诱导分化培养体系14～21天的细胞，消化后用离心涂片机涂片于载玻片上，丙酮固定细胞。采用ABC酶标记法进行检测，并设阴性对照组；滴加1∶100的兔抗人VIII因子抗体(一抗)和1∶200的Tie-2鼠抗人单克隆抗体。Nikon倒置相差显微镜(Olympus，日本)下观察，拍照。细胞浆内出现棕褐色颗粒为阳性反应。
二.结果
TEM下胞浆内可见Weible-palade小体(简称W-P小体)，是ECs特有的颗粒(见说明书附图5)。VIII(vWF)因子和Tie-2相关抗原的免疫组化结果显示细胞呈多角型或圆型，胞浆内布满细密的棕褐色颗粒，细胞核内未见着色，呈一片阴性对照区，证明培养的是内皮细胞(见说明书附图4)。