纳米化超氧化物岐化酶及其制备方法 所属领域
发明涉及一种酶的纳米化及其制备方法。具体地说，是涉及纳米化超氧化物岐化酶及其制备方法(superoxide dismutase，SOD)，通过多种技术(如超高压纳米匀质方法、微乳化法、脂质体化方法和超音速射流技术)将SOD分子纳米化，根据不同目的加入各种药物组成多种配方，用于保健和治疗等领域。
背景技术
SOD是国际生物医学界公认的唯一能清除人体内细胞中产生的超氧阴离子自由基的酶，具有极强的抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗突变和抗癌作用，用于治疗高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、自身免疫性疾病、各种炎症、心脑血管疾病和癌症等疾病效果极佳，且可用于延缓衰老和防治多种老年性疾病等。SOD作为药用酶在美国、西德、澳大利亚、日本等国已有相关产品，它主要用于自身免疫性疾病(如慢性类风湿性关节炎)、肿瘤、放疗后的病人及心脏手术等。SOD也广泛用于食品、保健品、药品、化妆品、日用化工制品和烟酒等领域。但SOD由于分子量大(大于30000)、半衰期短(半衰期只有几分钟)、口服消化液的影响、外用时皮肤直接吸收差等弱点及本身是一种蛋白质具有一定的免疫原性，故其应用受到很大的限制。目前尚无SOD直接纳米化的报道。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种纳米化超氧化物岐化酶及制备方法，主要用于在保留酶(蛋白质)活性前提下，将其纳米化从而达到提高生物利用度、延长半衰期等目的。
纳米化超氧化物岐化酶，其特征在于微囊/微滴直径2-200nm，抗氧化活性提高10倍以上，皮肤、粘膜吸收率可达90％以上，半衰期延长两个数量级以上，且能透过生物膜进入细胞内直接发挥清除自由基的作用。
纳米化超氧化物岐化酶制备方法，其特征在于以植物或动物来源提取的纯化SOD为原料，经过超高压匀质技术制成纳米SOD液体，再应用微乳化或脂质体化技术使纯化纯化SOD分子分散、乳化，形成纳米SOD微滴；或应用超音速射流技术将纳米SOD液体制成纳米SOD微囊。
纳米化超氧化物岐化酶及其制备方法技术内容
纳米化、微乳化和脂质体化过程，使纯化SOD具有一定的脂溶性，因此提高了保护生物膜脂质免受自由基损伤，具有更强的抗脂质过氧化作用；由于粒度小，克服了蛋白质的抗原性问题；油包水型(W/O型)的微滴，解决了生物膜透过性问题(易通过各种生物膜)和提高了稳定性(避免了蛋白酶的破坏)。
1、纳米化方法
纳米对撞机的工作原理是将纯化地SOD的液体，用高压泵加压以后(工程压力为10Kgf-2000Kgf/cm2以高速分为两股射流时入两片单晶金刚石晶片组成的通道中，相向对撞后流出。由于液体的速度很高(压力为700Kgf/cm2时速为300m/sec)，流体相向对撞时，对撞界面产生强冲击波，因而激励金刚石晶片产生高频强有力超声波专长，使液体中被加工物颗粒瞬间产生极热、非常的化学变化，完成裂解、乳化、分散、催化与合成同步进行，(声化学主要是利用超声空化能量为加速和控制化学反应、提高反应率、引发新的化学反应的一门新兴边缘交叉学科，是研究声能量与物质间的一种独特相互作用的学科。由于超声的空化作用，在受作用的物体中产生微观极热，持续时间又非常短，因此，可产生非常的化学变化，这种变化不同于传统的光化学、热化学和电化学过程，它有其独特的性质和规律。声空化是液体中气泡在声场作用下所发生的一系列动力学过程。当足够强度的超声小组通过液体时，一旦声波负压半周期的声压幅值超过内部静压器时，存在于液体中的微小气泡(空化核)就会迅速增大，而在相继而来的声波正压相中，气泡又被突然压缩，直到崩溃。因此，超声空化现象只能存在于液体中的微气核(空化核)内，是声场作用下空化核振动生长和崩溃闭合的动力学过程；纳米尺度控制在2-200nm。
2.微乳化法
微乳化法是最近几年发展起来的新技术，由于粒子表面包裹一层表面活性剂分子，使粒子间不易聚结，同时通过选择不同的表面活性剂分子可对粒子表面进行修饰，并控制微粒的大小。微乳液是由表面活性剂、油相、水相及助溶剂等在适宜比例下混合自发形成的热力学稳定体系，具有透明(或半透明)、低粘度、各向同性、分散相液滴极其微小和均匀等特点。
一种是将油、水、表面活性剂混合形成乳状液后，向其中滴加助表面活性(醇类)，滴加到一定数量时体系变为澄清透明的微乳液，该方法休为Schulman法，常用于O/W型微乳酸的制备；
一种是将油、水、表面活性别按一定比例混合均匀后，向其中滴加适量的水，即可形成澄清的微乳液，继续加入过量的水，液滴数量增多，体积增大，体系由W/O型逐渐过渡为浑浊、高粘度的双连续型，最后水成为连续相，形成(O/W型微乳液，该方法休为Shah法，用于O/W型微乳液的制备。
一种是固定适当的水、油比例，改变表面活性剂的用量，就可以得到单相区、两相区或三相区微乳液。这也是种比较简单的微乳液的制备。
微乳液的形成不需要外加功，主要依靠体系内各组分量的匹配，自发形成。研究这种配比关系，目前采用PI丁(相转换温度)、CER(粘附能比)、表面活性剂在油相和界面相的分配、HlB和盐度扫描等方法。
3、脂质体化方法：
脂质体(Liposome)作为靶向药物载体、疫苗佐剂，由于其良好的生物相容性、可降解性、无抗原性及多功能性，越来越受到人们的广泛关注。由于构成脂质体的脂质材料不同，人们已制备出带不同表面电荷，温度敏感、光敏感的脂质体用于不同的目的。脂质体的功能在于三个方面：磷脂分子，双层分子膜结构，脂质体内容物。
1)、磷脂分子的功能：人体内有多种磷脂，它们是构成人体细胞的重要成分。尤其是纫胞膜性结构(纫胞膜，细胞核膜、纫胞度性小器官等)的主要成分，具有广泛的功能。例如保持和增强细胞膜的流动性、通透性和兴奋性，从而增强细胞的代谢活动。已证明磷脂可促进表皮纫胞的生长和修复，提高皮肤的免疫性的抗病能力。
2)、脂质体膜，即双层磷脂膜的功能，可以说脂质体的新功能源于磷脂双分予度。由于磷脂双分子膜是纫胞膜的基本结构，这样就使脂质体具有以下功能。
(1)、导入性。人细胞膜具有选经性，脂质体的磺脂双分子膜和细胞有着相同的基本结构，两者有很强的亲合力，使脂质体及其所包含的内容物容易进入到细胞内。由此脂质体可以把不容易进入到细胞内的物质带进。例如SOD分子量30000-90000；直接加到化妆品中很难穿过皮肤角质层和进入细胞内。经脂质体包封后，随着脂质体就较易进入细胞。
(2)、选择性。脂质体进入皮肤深层后。有的进入细胞内，有的在细胞间停留。脂质体化方法有超声法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、注入法等，可根据不同包裹材料的要求加以选择。
4、环形超音速射流方法：
1)、利用超音速喷嘴产生的高速射流，使物料加速，并在交汇的粉碎区域高速碰撞、研磨使物料被粉碎。
2)、粉碎的物料形成流化床，上升到分级区，通过涡轮式分级轮的分级作用，达到粒度要求的产品进入收集器，粗料又返回粉碎区继续粉碎。
3)、可用于各种硬度物料的超细加工，产品粒度可达到微米、亚微米级。
技术特点：
1)、马赫数2的超音速射流在流化床料层中产生强烈冲击、研磨作用，粉碎和分级在同一腔体内进行，能量利用率高，粉碎效率比其他类型气流粉碎机提高三分之一。
2)、粉碎在料层中进行，避免了粉碎腔的磨损，分级轮叶片采用工程陶瓷保护，产品不受污染，适合活性物质低温粉碎及高硬度陶瓷材料的超细加工。
3)、机内设置的无级变速分级轮可根据产品要求自由控制产品粒度。
4)、可与干燥、灭菌、表面改性等工艺联合作业，简化流程。
纳米SOD微滴/微囊可以直接加工成软胶囊、胶囊或其它剂型用于疾病的预防和治疗，也可作为中间体用于食品、保健品、药品、化妆品、日用化工制品、烟酒等领域。该技术克服了目前SOD等生物蛋白酶的应用限制和不足，为其广泛应用打开了新的大门，宜于普及推广。经试验表明：
(1)、胃酸耐受性结果表明，SOD在小鼠模拟胃酸中37℃保持150min，活力仍残存81％。
(2)、模拟胃肠道蛋白酶和胰酶对SOD的酶解结果表明，在37℃下保持210min其活力残存分别为82％和84％。
(3)、离体小肠结扎后SOD的透出量随时间的变化而变化，10h后小肠外SOD的总活性接近试验时加入小肠的总活性，这表明SOD可透过小肠从肠膜一侧到达另一侧。
(4)、小鼠经口摄入SOD后4h，血中SOD活性达到最高值，与对照组相比机体内SOD活性提高30％％～40％，因此口服SOD能明显提高血中的SOD水平。
(5)、用异硫氰酸荧光素(PITC)标记SOD的试验表明，小鼠口服2h后血中标记物明显增加，4h后达到最高峰。
上海第二军医大学同位素标记试验结果证实，经口摄取的SOD能够进入体内。用[125I]标记SOD给小鼠灌胃，3h后在血中达最高峰，大部分SOD分布在血浆中，小部分进入血细胞中，SOD在组织中的分布顺序是肾＞肝＞脾＞心。
【具体实施方式】
1、超微粉碎技术 使用特制机械设备将原药材或提取物进行粉碎，使之达到纳米级。我国研制出了一种利用湍流原理进行粉碎的高湍流粉碎机，对中药甘草的粉碎实验表明，产品粒径可达到1μm以下，对矿物质的粉碎则达到100nm以下，而且粒径分布窄。
2、固体分散技术 药物以微粉，微晶或分子态均匀分散在无生理活性的载体中，药物在载体中的粒径小于100nm。该技术是通过物理分散而获得纳米药物粒子的。若将药物包埋于不同性质的高分子聚合物中，可形成速释型或缓释型固体分散物。
3、包合技术。以β环糊精为载体材料，可以增加难溶性药物的溶解度和溶出度，降低药物的刺激性，特别是中药易挥发性成分经包合后，可明显提高保留率，增加贮存过程中药物的稳定性。
4、微乳化技术 将油、水、乳化剂和助乳化剂按一定比例在一定温度下通过适当的方法混合而得。药物以粒径在10～100nm范围内的乳滴分散在另一种液体中形成的胶体分散系统。
5、脂质体技术 是由磷脂分散在水中而形成的具有双分子层结构的囊泡。脂质体作为药物的载体，可以延长药物作用的时间，增加药物在体外的稳定性，降低药物的毒性，同时可使药物具有定向分布的靶向特性。将脂质体引入到中药制剂领域，可以明显提高中药对疾病的治疗指数，可使一些毒性较大的药物在治疗疾病时更安全。纳米脂质体的药物以纳米级分散于脂质体双分子层中，同普通的脂质体制剂相比，还具有纳米药物所特有的一些性质。
纳米化超氧化物岐化酶制备方法：用植物或动物来源中提取的纯化SOD，首先采用纳米超高压(可达200Mpa)匀质技术(该技术原理是利用超高速流发生射流冲击能量，物料相互对撞摩擦产生高频振荡，使物料瞬间完成破碎、分散和乳化)将其纳米化其破碎粒径可达(2-60nm)；再用微乳化或脂质体化技术使纳米SOD分子分散、乳化，形成纳米SOD微滴；也可应用超音速射流技术将纳米SOD液体制成纳米SOD微囊。具体方法如下：
实施例1
纳米SOD液体∶甘油或其它油性液体∶表面活性剂混合＝1-10∶1-10∶1-5，形成乳状液后，向其中滴加助表面活性剂(如正丁醇)，滴加到一定数量时体系变为澄清透明的油包水(W/O)微乳液；
实施例2
纳米SOD液体∶甘油＝15∶10，改变表面活性剂(如AE03+TX10)的用量1-5，就可以得到单相区、两相区或三相区微乳液；
实施例3
卵磷脂∶胆固醇2-10∶1-5混合，加适量正丁醇使之溶解，再加入经过超高压纳米匀质处理后的纯化SOD液体，100W超声乳化，室温下电磁搅拌(500r/min)使之成为稳定的W/O型乳液。
实施例4
将纯化SOD溶液通过特殊形态的射流孔道以850m/s(2.5倍音速)喷射而出，在射流干燥塔内形成液体超细微粒(塔内温度为30-40℃)，通过一定的工艺操作，使细微粒子飞行形成特殊的轨迹，在一定的飞行时间空间中，逐渐干燥，形成纳米SOD微胶囊状结构，粒径2-200nm；
实施例5
应用超音速射流技术将纳米SOD液体制成纳米SOD微囊；
实施例6
纯化SOD用超高压匀质技术将其纳米化，其破碎粒径可达2-60nm；用微乳化或脂质体化技术使纳米SOD液体分子分散、乳化，形成纳米SOD微滴；用超音速射流技术将纳米SOD液体制成纳米SOD微囊；
实施例7
纳米SOD微滴/微囊可以直接加工成软胶囊、胶囊、乳剂、片剂、注射液或其它剂型。用于疾病的预防和治疗；
实施例8
纳米SOD微滴/微囊也可根据不同目的加入各种药物组成多种配方；如黄芪、葛根、人参等；
实施例9
纳米SOD微滴/微囊可直接作为中间体用于食品、保健品、药品、化妆品、日用化工制品、烟酒制品；
实施例10
纳米SOD微囊/微滴直径100nm。