一种冷沉淀的预纯化方法.pdf

本发明公开了一种冷沉淀的预纯化方法，它包括如下步骤：(1)取冷沉淀，溶解；(2)加入氢氧化铝凝胶干粉，氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5～30％w/w，搅拌15～30min；(3)再加入聚乙二醇至终浓度为3.0～4.0％w/v，混匀，调pH为6.0～6.5，继续搅拌15～60分钟；(4)离心，离心的时间是10～30min，得上清，滤膜过滤，即可。本发明预纯化方法的纯化效果好，FVIII的比活提高了3.69～5.64倍，而且操作简单，易于操作，质量可控。

1.  一种冷沉淀的预纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)取冷沉淀，溶解；
(2)加入氢氧化铝凝胶干粉，氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5～30％w/w，搅拌15～30min；
(3)再加入聚乙二醇至终浓度为3.0～4.0％w/v，混匀，调pH为6.0～6.5，继续搅拌15～60分钟；
(4)离心，离心的时间是10～30min，得上清，滤膜过滤，即可。

2.  根据权利要求1所述的预纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，冷沉淀溶解于20mmol/L、pH6.8的Tris溶液中。

3.  根据权利要求2所述的预纯化方法，其特征在于：溶液的步骤是：在搅拌条件下，将冷沉淀加入Tris溶液中，其中，搅拌的频率是80～120rpm。

4.  根据权利要求1～3任意一项所述方法，其特征在于：步骤(1)中，溶解时的温度不低于20℃。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5～15％w/w。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述搅拌时间为15～20分钟。

7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，聚乙二醇是通过加入聚乙二醇母液的方式加入，其中，聚乙二醇母液中含有30％w/v的聚乙二醇和0.21％w/v的枸橼酸钠，且其pH为6.3。

8.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述搅拌时间为20～40分钟。

9.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中，所述搅拌的频率是80～120rpm。

10.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述离心的时间是15～20分钟。

11.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，离心机的转速为3500～4200rpm。

12.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)～(4)期间，控制温度为20～37℃。

13.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述温度为25～35℃。

14.  权利要求1～13任意一项所述的方法制备的预纯化液。

15.  权利要求14所述预纯化液在制备人凝血因子VIII制剂中的用途。

一种冷沉淀的预纯化方法
技术领域
本发明涉及血液制品的制备方法，特别涉及一种冷沉淀的预纯化方法。
背景技术
冷沉淀(cryoprecipitate)是由健康人体血浆分离出来的一种成分血，为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，是大规模制备人凝血因子VIII(FVIII)浓缩制剂的原料。目前，国内外普遍采用的FVIII纯化工艺是以冷沉淀为原料，经过初步纯化除去大部分的杂蛋白，利用阴离子凝胶对预纯化料液中蛋白吸附能力的差异去除杂蛋白，得到高纯FVIII成品。
对冷沉淀这种多成分原料来说，预纯化工艺直接影响上样料液(预纯化料液)的质量，后者导致离子交换层析对FVIII的纯化效果和凝胶使用寿命变现出显著性差异。
冷沉淀预纯化方法包括氢氧化铝凝胶吸附、甘氨酸沉淀、聚乙二醇沉淀和酸性沉淀，已经将它们的组合，但是纯化效果均不佳。
如，罗亮等，“离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂”，华西药学杂志2000,15(3)∶174～176公开了一种预纯化方法，具体是先将冷沉淀用肝素钠水溶液溶解，再经氢氧化铝吸附、酸沉淀和聚乙二醇沉淀处理，采用该方法纯化，FVIII的比活仅提高了1.85倍(0.61/0.33，详见表5)，且需要采用肝素钠进行前处理，涉及多次升温和降温过程，操作复杂，成本高。
邓志华等，“人凝血因子VIII提取工艺优化研究”，江西医药2014年2月第49卷第2期公开了一种预纯化方法，具体是先将冷沉淀用肝素钠水溶液溶解，再经氢氧化铝吸附、酸沉淀处理，采用该方法纯化，FVIII的比活最高也仅提高了1.9倍，且需要采用肝素钠进行前处理，涉及多次升温和降温过程，再者其需制备氢氧化铝胶，操作复杂，成本高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新冷沉淀预纯化方法。
本发明冷沉淀的预纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)取冷沉淀，溶解；
(2)加入氢氧化铝凝胶干粉，氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5～30％w/w，搅拌15～30min；
(3)再加入聚乙二醇至终浓度为3.0～4.0％w/v，混匀，调pH为6.0～6.5， 继续搅拌15～60分钟；
(4)离心，离心的时间是10～30min，得上清，滤膜过滤，即可。
步骤(1)中，冷沉淀溶解于20mmol/L、pH6.8的Tris溶液中。
优选地，溶液的步骤是：在搅拌条件下，将冷沉淀加入Tris溶液中，其中，搅拌的频率是80～120rpm。
步骤(1)中，溶解时的温度不低于20℃。
步骤(2)中，所述氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5～15％w/w。
步骤(2)中，所述搅拌时间为15～20分钟。
步骤(3)中，聚乙二醇是通过加入聚乙二醇母液的方式加入，其中，聚乙二醇母液中含有30％w/v的聚乙二醇和0.21％w/v的枸橼酸钠，且其pH为6.3。
步骤(3)中，所述搅拌时间为20～40分钟。
步骤(2)和步骤(3)中，所述搅拌的频率是80～120rpm。
步骤(4)中，所述离心的时间是15～20分钟。
步骤(4)中，离心机的转速为3500～4200rpm。
步骤(2)～(4)期间，控制温度为20～37℃。
所述温度为25～35℃。
本发明还提供了前述的方法制备的预纯化液。
本发明还提供了前述预纯化液在制备人凝血因子VIII制剂中的用途。
本发明预纯化方法的纯化效果好，FVIII的比活提高了3.69～5.64倍，而且操作简单，无需反复调整温度，只需一步离心即可实现杂蛋白和FVIII料液的有效分离，减少劳动强度和设备投入；沉淀剂均为药用级原料药，减少了自行配制过程中质量的不稳定和不安全性，易于操作，质量可控。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明冷沉淀的预纯化方法
⑴取冷沉淀25kg
冷沉淀指来源于-20℃以下保存不超过1年的健康人血浆；
冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于-60℃以下保存，-30℃以下运输。
⑵在搅拌下按1:3的比例将冷沉淀加入75L20mmol/LpH6.8Tris溶解液中，过程温度不得低于20℃；
⑶按5g氢氧化铝凝胶干粉/kg冷沉淀，于冷沉淀溶解液中加入125g氢氧化铝凝胶干粉。加入后继续搅拌15分钟，控制温度20℃；
⑷在上述溶液中加入聚乙二醇母液，使得聚乙二醇4000终浓度为3.0％，搅拌均匀后用1M醋酸溶液调pH至6.0；继续搅拌15分钟，控制温度20℃；
⑸搅拌结束后采用台式离心机提取沉淀上清，离心机转速3500rpm，离心温度20℃，离心时间10分钟；上清经不锈钢筛网过滤后加0.45um膜过滤后，即得预纯化液。
冷沉淀预纯化结果见表1。
实施例2本发明冷沉淀的预纯化方法
⑴取冷沉淀25kg
冷沉淀指来源于-20℃以下保存不超过1年的健康人血浆；
冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于-60℃以下保存，-30℃以下运输。
⑵在搅拌下按1:3的比例将冷沉淀加入75L20mmol/LpH6.8Tris溶解液中，过程温度不得低于20℃；
⑶按15g氢氧化铝凝胶干粉/kg冷沉淀，于冷沉淀溶解液中加入375g氢氧化铝凝胶干粉。加入后继续搅拌20分钟，控制温度30℃；
⑷在上述溶液中加入聚乙二醇母液，使得聚乙二醇4000终浓度为3.5％，搅拌均匀后用1M醋酸溶液调pH至6.3；继续搅拌20分钟，控制温度30℃；
⑸搅拌结束后采用台式离心机提取沉淀上清，离心机转速4000rpm，离心温度30℃，离心时间15分钟；上清经不锈钢筛网过滤后加0.45um膜过滤后，即得预纯化液。
冷沉淀预纯化结果见表1。
实施例3本发明冷沉淀的预纯化方法
⑴取冷沉淀25kg
冷沉淀指来源于-20℃以下保存不超过1年的健康人血浆；
冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于-60℃以下保存，-30℃以下运输。
⑵在搅拌下按1:3的比例将冷沉淀加入75L20mmol/LpH6.8Tris溶解液中，过程温度不得低于20℃；
⑶按15g氢氧化铝凝胶干粉/kg冷沉淀，于冷沉淀溶解液中加入375g氢 氧化铝凝胶干粉。加入后继续搅拌20分钟，控制温度35℃；
⑷在上述溶液中加入聚乙二醇母液，使得聚乙二醇4000终浓度为3.5％，搅拌均匀后用1M醋酸溶液调pH至6.5；继续搅拌40分钟，控制温度35℃；
⑸搅拌结束后采用台式离心机提取沉淀上清，离心机转速4000rpm，离心温度35℃，离心时间20分钟；上清经不锈钢筛网过滤后加0.45um膜过滤，即得预纯化液。
冷沉淀预纯化结果见表1。
实施例4本发明冷沉淀的预纯化方法
⑴取冷沉淀25kg
冷沉淀指来源于-20℃以下保存不超过1年的健康人血浆；
冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于-60℃以下保存，-30℃以下运输。
⑵在搅拌下按1:3的比例将冷沉淀加入75L20mmol/LpH6.8Tris溶解液中，过程温度不得低于20℃；
⑶按30g氢氧化铝凝胶干粉/kg冷沉淀，于冷沉淀溶解液中加入750g氢氧化铝凝胶干粉。加入后继续搅拌30分钟，控制温度37℃；
⑷在上述溶液中加入聚乙二醇母液，使得聚乙二醇4000终浓度为4.0％，搅拌均匀后用1M醋酸溶液调pH至6.5；继续搅拌60分钟，控制温度37℃；
⑸搅拌结束后采用台式离心机提取沉淀上清，离心机转速4200rpm，离心温度37℃，离心时间30分钟；上清经不锈钢筛网过滤后加0.45um膜过滤，即得预纯化液。
冷沉淀预纯化结果见表1。
表1.实施例1、2、3中冷沉淀预纯化结果汇总