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一种菊粉酶突变体及其应用
技术领域：
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种菊粉酶及其制备方法。
背景技术：
低聚果糖(Fructooligosaccharides)，简称FOS，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,分子式为:G-F-Fn，n＝1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。它是由β-D-果糖基通过β-2,1糖苷键连接而成的直链低聚糖。目前，工业上生产低聚果糖的两种方法，酶法转化蔗糖合成的蔗果低聚糖和由菊粉部分水解得到的全果糖低聚糖。二者在结构上稍有不同，但生理功能基本一样。都具有很多对人体有益的功能，如它热量低，促进矿物质吸收，不引起龋齿，降血脂，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等，不易引起血糖波动，作为糖尿病人甜味剂等，被誉为营养、保健、疗效三位一体的21世纪健康新糖原。所以低聚果糖的工业化生产对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。
菊粉(Inulin)又称菊糖，主要来源于菊芋、菊苣等植物，是由D-呋喃果糖分子经β-2,1糖苷键脱水聚合而成的线性直链多糖，其还原端含有一个葡萄糖残基，呈直链结构，聚合度通常在2～60，分子量为3000～5000碳单位，是一种功能性果聚糖和水溶性膳食纤维。菊粉作为一种纯天然的功能性食品配料，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广泛运用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中国卫生部批准菊粉为新资源食品。
目前报道产菊粉酶的微生物包括鲁维酵母属、海洋酵母属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、节杆菌属、放线菌属等。但是通过野生型筛选、理化诱变和工艺条件优化的手段得到的菊粉酶普遍活力不高。基因工程手段是提高菊粉酶活性的有效途径之一。利用重组DNA技术菊粉酶基因酵母菌进行克隆和表达，实现菊粉酶的高效表达。目前国内江门量子高科、山东保龄宝、武汉盛世天元等单位生产低聚果糖所用的酶均来自国外少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵。因此，菊粉酶制剂国产化对于低聚果糖的生产和应用显得非常重要。
酶法转化蔗糖工业化大规模合成的蔗果低聚糖，反应的副产物葡萄糖是酶的抑制剂，反应进行不彻底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占总量≤55％～60％(干基)，且工艺复杂、生产成本高。而本专利所涉及到的菊粉酶，可高效水解菊粉长链为低聚糖，还不增加单糖副产物，低聚果糖含量高达95.78％ 以上，工艺简单，是一种生产低聚果糖的新工艺。
发明内容：
本发明解决上述问题所采用的技术方案之一，是提供一种通过基因工程手段获得的酶活性显著提高的菊粉酶突变体，其氨基酸序列如核苷酸序列表SEQIDNO：5所示。本发明以黑曲霉NRRL3135总RNA为模板逆转录扩增出菊粉酶基因，经密码子优化后，继而利用易错PCR等体外分子定向进化技术，对菊粉酶基因inuI进行分子改良，并对获得的突变位点进行定点突变组合，以期获得酶活力提高或酶学性质改善的优良突变体。目前报道的文献中，未有采用此方法来提高菊粉酶酶活。
本发明解决上述问题所采用的技术方案之二，是提供一种生产方案一所述菊粉酶突变体的基因工程菌。
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、菊粉酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示菊粉酶突变体中突变的氨基酸。如Thr102Ser，表示位置102位的氨基酸由亲本菊粉酶的Thr替换成Ser，位置的编号对应于SEQIDNO：3中菊粉酶的氨基酸序列编号。如Thr102Ser/Thr204Ser，表示位置102和位置204的氨基酸都发生了突变。
在本发明中，inuI表示菊粉酶的原始氨基酸序列(如SEQIDNO：3所示)，inuI’表示菊粉酶突变体的氨基酸序列(如SEQIDNO：5所示)。

菊粉酶/突变体碱基氨基酸inuIC305 A306 C611 G612Thr102 Thr204inuI’G305 T306 G611 T612Ser102 Ser204
用于表达所述的菊粉酶及其突变体的克隆载体和表达载体为pPIC9K；用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母GS115。
本技术方案的实验步骤概述如下：
(1)采用PCR技术以黑曲霉NRRL3135总RNA为模板，逆转录合成第一链 cDNA，并以第一链cDNA为模板设计引物，扩增获取菊粉酶基因，插入pPIC9K克隆载体上构建重组质粒，转入E.coliJM109，测序鉴定菊粉酶基因inuI；
(2)以上述构建正确的重组质粒为基础优化菊粉酶编码基因inuI,并通过全基因合成技术获得密码子优化的菊粉酶编码基因inuI’；
(3)在体外利用易错PCR技术向密码子优化的黑曲霉菊粉酶基因inuI’引入核苷酸突变；
(4)将易错PCR产物及其pPIC9K表达载体用EcoRI和NotI双酶切后连接，连接产物转入E.coliJM109构建易错PCR突变体库，采用抗生素筛选突变质粒；
(5)将突变质粒经限制性内切酶SalI线性化后，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构成突变文库；
(6)采用BMMYI平板和96孔板筛选菊粉酶活性较高的菌株；
(7)通过定点突变的方法，对上述酶活较高菌株的突变位点进行组合，将含有上述突变位点组合的基因与载体pPIC9K连接，电转化毕赤酵母GS115，以获得菊粉酶高效分泌表达的菌株。
本发明解决上述问题所采用的技术方案之三，是提供一种技术方案一所述菊粉酶突变体的生产方法，具体如下：
以技术方案二所获菌株为生产菌株；
种子培养：二级种子培养，OD₆₀₀测定为10时，用于发酵罐接种；
发酵罐准备：以BSM培养基为发酵培养基,添加微量元素PTM1母液，接种量2％～10％,pH4.0～7.5，发酵温度为25～37℃，DO维持20％以上。
菌体生长阶段：发酵培养基中甘油耗尽后，DO快速上升，随即进入补料生长阶段；
补料生长阶段：流加50％甘油，每升甘油中事先添加了12mL微量元素PTM1母液，初始流加速度为3.0～9.0mL/min；当DO低于20％时停止流加，待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段；
诱导产酶阶段：流加甲醇，每升甲醇中事先添加了12mL微量元素PTM1母液，初始流加速率为1.2～3.6mL/min，当DO低于20％时停止流加，待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至3.6～7.3mL/min，2h 后流加甲醇速率提高至7.3～10.9mL/min，诱导70～96h后发酵结束。
本发明的有益效果如下：
1、本发明中采用密码子优化、易错PCR及定点突变技术在体外对菊粉酶编码基因inuI进行定向进化,筛选出菊粉酶活性显著提高的突变体，突变体K_cat值为出发菌株菊粉酶的3.1倍。
2、本发明所述酶的制备过程易于实施且产酶效率高，30m³体系下发酵液酶活达60000-65000U/mL。
附图说明：
图1不同Mn²⁺浓度下的易错PCR；
其中，M-GeneRuler1kbDNALadder；1-对照；2-7：分别为不同Mn²⁺浓度下(0.05mmol/L,0.1mmol/L,0.15mmol/L,0.2mmol/L,0.25mmol/L,0.3mmol/L)的PCR产物
图2重组质粒的单酶切(NcoI)验证；
M-GeneRuler1kbDNALadder
图3以重组菌的基因组为模板进行的PCR验证；
其中，M-GeneRuler1kbDNALadder；1-3：三个不同重组菌的PCR验证。
具体实施方式：
实施例中涉及到的培养基配方(单位为w/v)如下：
(1)LB液体培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0。
(2)PDA培养基：马铃薯200g切小块，煮沸后再煮30min，纱布过滤后定容1L使用。使用时按葡萄糖20g/L，琼脂20g/L加入。
(3)YPD培养基：酵母膏1％,蛋白胨2％,葡萄糖2％，制作平板时加入琼脂粉2％。121℃高压灭菌20min。用于筛选G418抗性时加入G418至终浓度为0.25mg/mL～2.0mg/mL，即YPD-G418平板。
(4)MD培养基：无氨基酵母氮源1.34％，生物素4×10^-5％，葡萄糖2％，琼脂粉2％。
(5)BMGY培养基：酵母膏1％，蛋白胨2％，无氨基酵母氮源1.34％，生物素4×10^-5％，甘油1％，磷酸钾溶液100mmol/L。
(6)BMMY培养基：酵母膏1％，蛋白胨2％，无氨基酵母氮源1.34％，生物素4×10^-5％，甲醇0.5％，磷酸钾溶液100mmol/L。
(7)BMMYI培养基：BMMY培养基里加2％的菊芋和2％琼脂粉。
(8)BSM培养基：磷酸(85％)2.67％，硫酸钙0.118％，硫酸钾1.82％，硫酸镁0.727％，氢氧化钾0.413％，甘油4％。
实施例1：inuI基因的克隆及密码子优化
重组质粒的构建：采用TRNzol总RNA提取试剂提取黑曲霉NRRL3135的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA，然后分别以第一链cDNA为模板，以引物F1(SEQIDNO:6)和R1(SEQIDNO:7)进行PCR扩增出黑曲霉菊粉酶基因inuI。将PCR产物与质粒pPIC9K分别用EcoRI和NotI进行酶切、纯化，再进行连接，转化EscherichiacoliJM109感受态细胞。筛选阳性转化子，并提取其质粒进行酶切验证。再将酶切验证正确的重组质粒进行测序(序列SEQIDNO:1)，构建正确的重组质粒命名为pPIC9K-inuI。
密码子优化：以上述构建正确的重组质粒pPIC9K-inuI为基础，通过网站http://www.jcat.de/，优化菊粉酶编码基因的密码子组成，并通过全基因合成技术(牛丹丹等。应用与环境生物技术学报，2007,13(4)：515-518)，获得密码子优化的编码菊粉酶的新基因inuI’(序列SEQIDNO:2)，其氨基酸序列与SEQIDNO:3相同。将inuI’克隆入表达载体pPIC9K的EcoRI、NotI位点中，获得相应的重组表达质粒pHY-inuI’。
实施例2：利用易错PCR方法构建黑曲霉菊粉酶突变文库
在体外利用易错PCR技术向密码子优化的黑曲霉菊粉酶基因inuI’引入核苷酸突变(图1)。易错PCR的反应条件如下：


其中，引物F2(SEQIDNO:8)和R2(SEQIDNO:9)序列(5’-3’)分别为：
上游引物F2：CCGGAATTCCAGTCTAATGATTACCGTCCTTCATAC
下游引物R2：ATAAGAATGCGGCCGCTCATTCAAGTGAAACACTCCGC
PCR扩增条件：94℃3min；94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。
易错PCR扩增产物经DNA纯化回收试剂盒纯化后，用限制性内切酶EcoRI和NotI对其进行酶切，并与经过相应酶切的质粒pPIC9K进行连接，转化至E.coliJM109感受态细胞，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素LB固体培养基平板上。37℃、200rpm培养12h后，将转化子转移至LB液体培养基中培养，获得突变质粒,。
将突变质粒经限制性内切酶SalI线性化后，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。将转化液涂布于MD平板上，30℃培养2天，构成突变文库。
按照上述的方法，以突变体基因组为模板进行多轮易错PCR，构建突变文库。
实施例3：高酶活菊粉酶突变体的筛选
用灭菌牙签将MD平板上生长出的His⁺转化子复制到YPD和含有BMMYI平板的相同位置，同时将对照菌GS115/pPIC9K-inuI’(不经过易错PCR，制备过程同实施例2的产物)接种至BMMYI平板上。30℃培养2天，并保存生长好的YPD平板。
平板初筛：将突变菌株在BMMYI平板上诱导2～3天。平板上菌落周围的透明圈比对照菌GS115/pPIC9K-inuI’大的菌株为初筛目的突变菌株。
96孔板复筛：向1.8mL/孔(平底)的96孔板中加入300μLBMGY培养基，121℃灭菌20min。向其中接入保藏于YPD平板上的初筛目的菌株(同时接入GS115/pPIC9K-inuI’作对照)，30℃200r/min振荡培养至OD₆₀₀为2～6(约16～18h)。离心，弃上清，用900μLBMMY培养基重悬菌体，并加入1％(V/V) 甲醇诱导菊粉酶表达。此后每24h补加100μLBMMY培养基和1％(V/V)甲醇，诱导4天。将诱导表达96h的96孔板发酵液3000r/min离心10min，收集上清。根据实施例4的方法测定菊粉酶突变体的K_cat值，K_cat值比对照菌大的菌株为复筛目的菌株。
以易错PCR构建的突变文库为基础进行筛选，获得5株酶活明显提高的菌株，测定菊粉酶核苷酸序列，利用三联体密码子推测菊粉酶的氨基酸序列，菊粉酶突变体的氨基酸取代及K_cat值提高倍数如表1所示。
表1突变体的测序结果

实施例4：菊粉酶突变体的K_cat值测定
摇瓶发酵：将出发菌株以及各菊粉酶突变体菌株，接种至25mLBMGY培养基中，30℃震荡培养至OD₆₀₀为2～6(约16～20h)，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至OD₆₀₀为1，每隔24h添加0.5％的甲醇诱导表达，培养3～4天后，收集发酵上清液。
分离纯化：将突变菌株的发酵上清液经过30kDa超滤膜浓缩、DEAEsepharoseFF阴离子交换层析、Q-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和Sephadex^TM200PG凝胶过滤层析后得到纯化的突变菊粉酶活性组分。具体操作参考文献BoYuan,etal.ApplMicrobiolBiotechnol.2012,96:1517-1526.
测定方法：菊粉酶活力的测定方法为HPLC法：取酶液1mL加9mL2％菊芋(购买于sigma-Aldrich公司)溶液，在37℃、pH＝5.0的条件下，反应10min，取反应液0.5mL沸水浴加热10min灭活，用流动相进行适当稀释，用HPLC测 定低聚三糖(含果三糖和蔗果三糖)的生成量。查对低聚三糖(含果三糖和蔗果三糖)标准曲线并计算，获得菊粉酶的酶活及动力学参数K_cat。
酶活力单位定义：在37℃、pH＝5.0的条件下，1mL酶液在1h内水解菊芋果聚糖产生1μmol的三糖(含果三糖和蔗果三糖)定义为一个酶活力单位(U)。
实施例5：定点突变组合菊粉酶突变体的基因突变位点
经过多轮易错PCR进行突变文库构建，得到包含有氨基酸突变位点的5个突变菌株(见实施例3)。为了考察其中某一个突变及各突变的组合对菊粉酶突变株活力的影响，对这些突变位点进行定点突变组合(用TaKaRa公司的MutanBESTKit进行定点突变)，获得多个菊粉酶突变体。
将含有上述突变位点组合的基因与载体pPIC9K连接，电转化毕赤酵母GS115，以获得菊粉酶的高效分泌表达。以与实施例3相同的方法测定菊粉酶突变体的K_cat值。各突变体酶的组合位点及其K_cat提高的倍数如表2所示。
运用易错PCR方法，通过多轮重组和定点突变，获得活力提高的菊粉酶突变体。其中，突变体的验证分别见图2和图3。在突变体的氨基酸序列中，包含氨基酸突变Asn42Gly、Thr102Ser、Thr204Ser、Pro338Ala、Ser469Leu以及上述氨基酸两个、三个或四个突变的组合；以转换数K_cat表示，菊粉酶突变体的酶活较出发菌株得到了提高.
表2突变体的测序结果及其K_cat提高的倍数


其中，以102位和204位氨基酸发生突变的组合(突变体2-1)K_cat最高，改造效果最好，其氨基酸序列为：SEQIDNO:5，2个突变氨基酸在序列表中用粗体和下划线显示，该突变体对应的核苷酸序列为：SEQIDNO:4。
实施例6：菊粉酶突变体2-1生产菌株25L发酵系统发酵工艺和酶的制备工艺的建立
甘油管接种YPD平板，30℃培养40h；单菌落接种于含有30mLYPD液体培养基的250mL三角瓶中，30℃培养温度下200r/min摇床培养40h，菌悬液为一级种子；5mL上述菌悬液接种二级种子培养基(液体YPD)，500mL三角瓶装液量100mL，30℃培养温度下200r/min摇床培养16h，OD₆₀₀测定为10时，600mL用于发酵罐接种；
发酵罐准备：按照11L初始装液量配制发酵培养基(BSM)，氨水调节pH至5.0,搅拌充分后，121℃30min灭菌。同时准备补料瓶等。并配制50％甘油5.5L用于补料。
接种：接种时，将600mL种子悬液和131.59mL微量元素PTM1母液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，pH维持5.0。DO维持20％以上。
菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。
补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12mL微量元素PTM1母液)。初始流加速度为5.0mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段。
诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12mL微量元素PTM1母液)。初始流加速率为2.6mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至5.8mL/min。2h后流加甲醇速率提高至10.0mL/min。诱导96h后发酵结束，发酵结束后，发酵液酶活水平达到60000U/mL。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液，添加适量食 品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型菊粉酶成品。
实施例7：30m³体系下菊粉酶的制备
将实施例6的工艺调整为30m³发酵体系对应的比例，同步换算补料速率和甲醇流加速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体，经补料生长阶段后，诱导产酶。
菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。
补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12mL微量元素PTM1母液)。初始流加速度为4.0mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段。
诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12mL微量元素PTM1母液)。初始流加速率为2.0mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至4.3mL/min。2h后流加甲醇速率提高至8.0mL/min。诱导75h后发酵结束。
发酵结束后，发酵液酶活水平达到65000U/mL。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液，添加辅助制剂后精滤制备菊粉酶液体成品。