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1、10申请公布号CN104169438A43申请公布日20141126CN104169438A21申请号201380013675322申请日2013020161/593,82920120201USC12Q1/6820060171申请人简探针公司地址美国加利福尼亚州72发明人J卡尔森R波尔纳ST布伦塔诺74专利代理机构北京市嘉元知识产权代理事务所特殊普通合伙11484代理人张永新54发明名称非对称发夹靶标捕获低聚物57摘要本发明提供改善的茎环靶标捕获低聚物以及使用方法。此类靶标捕获低聚物具有形成环的靶标结合片段，所述环在形成茎的茎片段的侧面。所述茎片段是不等长的。在不存在靶核酸但提供良好靶标灵敏度。
2、的情况下，此类探针显示出很少结合至或不结合至固定化探针。所述探针尤其可用于多种检测方法，其中存在检测多个靶核酸例如，检测靶基因的多个多态性形式的多个靶标捕获低聚物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014091286PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0244992013020187PCT国际申请的公布数据WO2013/116774EN2013080851INTCL权利要求书3页说明书23页序列表4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书23页序列表4页附图3页10申请公布号CN104169438ACN104169438A1/3页2。
3、1一种捕获靶核酸的方法，所述方法包括使被怀疑包含所述靶核酸的样品与靶标捕获低聚物和固定化探针接触；所述靶标捕获低聚物包含第一和第二发夹茎片段，所述第一和第二发夹茎片段的长度差异为与靶核酸互补的靶标结合片段侧面的至少两个核碱基单元，所述靶标捕获低聚物采取发夹茎环的形式，所述茎通过所述第一和第二发夹茎片段的分子内杂交形成，并且所述靶标结合片段构成所述环；所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与所述第一或第二发夹茎片段互补的片段；其中如果所述样品包含所述靶核酸，则所述靶核酸杂交至所述靶标结合片段打断所述第一和第二发夹茎片段的所述分子内杂交，使得所述第一或第二发夹片段杂交至所述固定化探针上的所。
4、述互补片段，形成载体结合的捕获杂交体；并且如果所述样品不包含所述靶核酸，则所述第一和第二片段保持以茎进行分子内杂交。2根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标存在于所述样品中。3根据权利要求1或2所述的方法，还包括从所述样品分离所述载体结合的捕获杂交体。4根据权利要求3所述的方法，其中所述接触在第一温度下，然后是低于所述第一温度的第二温度下进行。5根据权利要求4所述的方法，其中所述第一温度在所述第一和第二茎片段之间形成的双链以及所述靶标结合片段和所述靶核酸之间形成的双链的所述解链温度之间，并且所述第二温度低于所述第一和第二茎片段形成的所述双链以及所述第二茎片段和所述固定化探针之间形成的双链的所述。
5、解链温度。6根据权利要求4或5所述的方法，其中所述分离在所述第二温度下进行。7根据权利要求16中任一项所述的方法，还包括从所述捕获杂交体释放所述靶核酸。8根据权利要求17中任一项所述的方法，还包括检测所述靶核酸。9根据权利要求8所述的方法，还包括对所述靶核酸测序。10根据权利要求19中任一项所述的方法，其中所述靶标捕获低聚物是具有与不同的靶标互补的不同靶标结合片段的多个靶标捕获低聚物中的一者。11根据权利要求10所述的方法，其中所述多个靶标捕获低聚物包含至少十个靶标捕获低聚物。12一种包含第一和第二茎片段的靶标捕获低聚物，所述第一和第二茎片段的长度差异为与靶核酸互补的靶标结合片段侧面的至少两个。
6、核碱基，其中在杂交条件下在不存在所述靶核酸情况下，所述靶标捕获低聚物形成茎环，所述第一和第二茎片段的分子内杂交形成所述茎，并且所述靶标结合片段形成所述环；以及在存在所述靶核酸的情况下，所述靶标结合片段杂交至所述靶核酸，打断所述第一和第二茎片段的所述分子内杂交，产生能够杂交至互补的固定化探针的所述第一茎片段。13根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一茎片段包含至少15个核碱基单元，并且所述第二茎片段包含至少五个核碱基单元。14根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第二茎片段的长度为所述第一权利要求书CN104169438A2/3页3茎片段长度的3961。15根据权利要求12所。
7、述的靶标捕获低聚物，其中所述第一茎片段和所述第二茎片段的长度差异为至少5个核碱基单元。16根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一和第二茎片段的长度差异为至少9个核碱基单元。17根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一和第二茎片段的长度差异为515个核碱基单元。18根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一片段具有1726个核碱基单元，并且所述第二片段具有716个核碱基单元。19根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一片段具有1824个核碱基单元，并且所述第二片段具有715个核碱基单元，并且所述第一片段比所述第二片段长至少7个核碱基单元。20根据权利要求1。
8、2所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一和第二茎片段分别占据所述靶标捕获低聚物的所述5和3末端，并且所述第一茎片段与所述固定化探针互补。21根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一和第二茎片段包括POLYA和POLYT核碱基单元的互补片段。22根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一片段包含POLYA片段，并且所述第二茎片段包含POLYT片段。23根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一或第二茎片段包含T05A1040。24根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一茎片段包含T05A1040，并且所述第二茎片段包含A05T1040，其中所述第一茎片段比所述第二。
9、茎片段长。25根据权利要求14所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一茎片段的所述A1040比所述第二茎片段的所述T1040长515个核苷酸。26根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述第一茎片段包含A1540，并且所述第二茎片段包含T1030。27根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述靶标结合片段和靶核酸之间形成的双链的所述解链温度大于所述第一和第二茎片段之间形成的双链的解链温度，其大于所述第一茎片段和所述固定化探针之间形成的双链的所述解链温度。28根据权利要求12所述的靶标捕获低聚物，其中所述靶标结合片段包含至少一个甲氧基核碱基。29一种根据权利要求111中任一项所述的方法，其中所。
10、述靶标捕获低聚物是权利要求1228定义的任何所述靶标捕获低聚物。30一种包含任何前述权利要求定义的靶标捕获低聚物和固定化探针的试剂盒，所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与所述第一或第二发夹茎片段互补的片段。31根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述第一和第二发夹片段的较长者包含POLYA，所述第一和第二发夹片段的较短者包含POLYT，并且所述固定化探针片段包含POLYT，所述POLYT的长度在所述第一和第二发夹探针的所述POLYA和POLYT片段之间。权利要求书CN104169438A3/3页432一种包含任一项前述权利要求定义的靶标捕获低聚物、固定化探针和靶核酸的反应混合物，所述。
11、固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与所述第一或第二发夹茎片段互补的片段，并且所述靶核酸杂交至所述靶标捕获低聚物的所述靶标结合片段。权利要求书CN104169438A1/23页5非对称发夹靶标捕获低聚物0001相关专利申请的交叉引用0002本专利申请是提交于2012年2月1日的61/593,829的正式申请，该专利申请出于所有目的全文以引用方式并入本文。背景技术0003样品中核酸的检测用于诊断、治疗、法庭、农业、食品科学应用和其他领域。一种用于纯化靶多核苷酸的技术通常用于诊断过程，其涉及将靶核酸捕获在固相载体上。固相载体在靶核酸纯化过程的一个或多个洗涤步骤期间保持靶核酸。捕获的靶核酸序列。
12、可通过各种方法分析。一种此类方法使用杂交至靶序列的核酸探针。探针可设计为检测不同靶序列，诸如具有微生物、病毒、人类基因、植物或动物基因和/或病原性病症特征的那些靶序列。得益于捕获的靶核酸的另外分析技术包括核酸的扩增测定、微阵列、测序测定、质谱测定。0004靶核酸可使用同时杂交结合靶核酸和固定至固相载体的核酸的靶标捕获低聚物捕获。靶标捕获低聚物将靶核酸连接至固相载体，生成包含结合的靶核酸的复合物。标记探针可杂交至结合的靶标，未结合的标记探针可从固相载体洗掉参见STABINSKY，美国专利NO4,751,177。0005靶标捕获低聚物的变型已有所描述，其中在靶标不存在的情况下捕获探针以茎环结构存在。
13、，并且在靶核酸存在的情况下，靶核酸结合至环部分，打开茎并且使得环的一个臂能够结合固定化探针参见US20060068417。此类构造可用于在靶标捕获低聚物结合至其靶核酸之前降低靶标捕获低聚物杂交固定化探针的能力。发明内容0006本发明提供包含第一和第二茎片段的靶标捕获低聚物TACO，所述片段的长度差异为与靶核酸互补的靶标结合片段侧面的至少两个核碱基。在杂交条件下，在不存在靶核酸的情况下，靶标捕获低聚物形成茎环，第一和第二茎片段的分子内杂交形成茎，并且靶标结合片段形成环；并且在存在靶核酸的情况下，靶标结合片段杂交至靶核酸，打断第一和第二茎片段的分子内杂交，产生能够杂交至互补的固定化探针的第一茎片段。
14、。在一些TACO中，第一茎片段包含至少15个核碱基单元，并且第二茎片段包含至少五个核碱基单元。在一些TACO中，第二茎片段的长度为第一茎片段的长度的3961。在一些TACO中，第一茎片段和第二茎片段的长度差异为至少5个核碱基单元。在一些TACO中，第一和第二茎片段的长度差异为至少9个核碱基单元。在一些TACO中，第一和第二茎片段的长度差异为515个核碱基单元。在一些TACO中，第一片段具有1726个核碱基单元，并且第二片段具有716个核碱基单元。在一些TACO中，第一片段具有1824个核碱基单元，第二片段具有715个核碱基单元，并且第一片段比第二片段长至少7个核碱基单元。在一些TACO中，第一。
15、和第二茎片段分别占据靶标捕获低聚物的5和3末端，并且第一茎片段与固定化探针互补。在一些TACO中，第一和第二茎片段包含POLYA和POLYT核碱基单元的互补片段。在一些TACO中，第一片段包含POLYA片段，并且第二茎片段包含POLYT片段。在一些TACO中，第一或第说明书CN104169438A2/23页6二茎片段包含T05A1040。在一些TACO中，第一茎片段包含T05A1040，并且第二茎片段包含A05T1040，其中第一茎片段比第二茎片段长。在一些TACO中，第一茎片段的A1040比第二茎片段的T1040长515个核苷酸。在一些TACO中，第一茎片段包含A1540，并且第二茎片段包含。
16、T1030。在一些TACO中，靶标结合片段包含至少一个甲氧基核碱基。0007本发明还提供包含上述定义的靶标捕获低聚物和固定化探针的试剂盒，所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与第一或第二发夹茎片段互补的片段。在一些试剂盒中，第一和第二发夹片段的较长者包含POLYA，第一和第二发夹片段的较短者包含POLYT，并且固定化探针片段包含POLYT，POLYT的长度在第一和第二发夹探针的POLYA和POLYT片段之间。0008本发明还提供捕获靶核酸的方法。此类方法包括使被怀疑包含靶核酸的样品与靶标捕获低聚物和固定化探针接触；靶标捕获低聚物包含第一和第二发夹茎片段，所述片段的长度差异为与靶核酸互。
17、补的靶标结合片段侧面的至少两个核碱基单元，靶标捕获低聚物采取发夹茎环的形式，茎通过第一和第二发夹茎片段的分子内杂交形成，并且靶标结合片段构成环；固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与第一或第二发夹茎片段互补的片段；其中如果样品包含靶核酸，则靶核酸杂交至靶标结合片段打断第一和第二发夹茎片段的分子内杂交，使得第一或第二发夹片段杂交至固定化探针上的互补片段，形成载体结合的捕获杂交体；并且如果样品不包含靶核酸，则第一和第二片段保持以茎进行分子内杂交。本专利申请中上述或别处公开的任何靶标捕获低聚物可以此类方法使用。0009在一些方法中，靶标存在于样品中。一些方法还包括从样品分离载体结合的捕获杂交体。
18、。在一些方法中，接触在第一温度下然后在低于第一温度的第二温度下进行。在一些方法中，第一温度在第一和第二茎片段之间形成的双链以及靶标结合片段和靶核酸之间形成的双链的解链温度之间，并且第二温度低于第一和第二茎片段形成的双链以及第二茎片段和固定化探针之间形成的双链的解链温度。在一些方法中，分离在第二温度下进行。一些方法还包括从捕获杂交体释放靶核酸。一些方法还包括检测靶核酸。一些方法还包括对靶核酸测序。在一些方法中，靶标捕获低聚物是具有与不同靶标互补的不同靶标结合片段的多个靶标捕获低聚物中的一者。在一些方法中，所述多个靶标捕获低聚物包括至少十个靶标捕获低聚物。0010本发明还提供包含任何前述权利要求定。
19、义的靶标捕获低聚物、固定化探针的反应混合物，所述固定化探针包含具有探针的载体，所述探针包含与第一或第二发夹茎片段互补的片段和杂交至靶标捕获低聚物的靶标结合片段的靶核酸。附图说明0011图1示出了在捕获条件中和在不存在其杂交的靶核酸的情况下各种靶标捕获低聚物的构造。黑色圆圈以及方格突起分别表示捕获珠和固定化探针。在此类条件下非对称靶标捕获低聚物在发夹构造中示出，而线性靶标捕获低聚物保持线性构造。在这些条件下，线性靶标捕获低聚物的第一茎能够与固定化探针杂交；然而，非对称靶标捕获低聚物的第一茎不杂交。0012图2示出了在捕获条件下和在存在其杂交的靶核酸的情况下非对称靶标捕获低聚物的各种构造。在该图示。
20、中，与靶核酸相比，存在过量的非对称靶标捕获低聚物。结合至说明书CN104169438A3/23页7靶核酸的非对称靶标捕获低聚物在打开非发夹构造中示出，从而暴露其与固定化探针结合的第一茎。闭合发夹构造中示出的非对称靶标捕获低聚物具有其第一茎结合的并且不结合固定化探针的第二茎。0013图3示出了实例2中得到的结果的图解。0014图4示出了实例1中得到的结果的图解。0015定义0016核酸是指包含核苷酸或类似物的多聚化合物，所述核苷酸或类似物具有连接在一起形成聚合物的含氮杂环碱基或碱基类似物，所述聚合物包括常规RNA、DNA、RNADNA混合物或其类似物。0017含氮杂环碱基可称为核碱基单元。核碱基。
21、单元可以是常规DNA或RNA碱基A、G、C、T、U、碱基类似物如肌苷、5硝基吲唑等等THEBIOCHEMISTRYOFTHENUCLEICACIDS536,ADAMSETAL,ED,11THED,1992核酸的生物化学，第536页，ADAMS等人编辑，第11版，1992年；VANAERSCHOTTETAL,1995,NUCLACIDSRES2321436370VANAERSCHOTT等人，1995年，核酸研究，第23卷，第21期，第43634370页、咪唑4甲酰胺NAIRETAL,2001,NUCLEOSIDESNUCLEOTIDESNUCLACIDS,20477358NAIR等人，2001年。
22、，核苷、核苷酸、核酸，第20卷，第47期，第735738页、嘧啶或嘌呤衍生物例如改性嘧啶碱6H,8H3,4二氢嘧啶并4,5C1,2噁嗪7酮有时称为结合A或G的“P”碱基和改性嘌呤碱N6甲氧基2,6二氨基嘌呤有时称为结合C或T的“K”碱基、次黄嘌呤HILLETAL,1998,PROCNATLACADSCIUSA958425863HILL等人，1998年，美国国家科学院院刊，第95卷，第8期，第42584263页；LINANDBROWN,1992,NUCLACIDSRES2019514952LIN和BROWN，1992年，核酸研究，第20卷，第19期，第51495152页、2氨基7脱氮杂腺嘌呤与C。
23、和T配对；OKAMOTOETAL,2002,BIOORGMEDCHEMLETT121979OKAMOTO等人，2002年，生物有机和药物化学通讯，第12卷，第1期，第9799页、N4甲基脱氧鸟苷、4乙基2脱氧胞苷NGUYENETAL,1998,NUCLACIDSRES2618424958NGUYEN等人，1998年，核酸研究，第26卷，第18期，第42494258页、4,6二氟苯并咪唑和2,4二氟苯核苷类似物KIOPFFERENGELS,2005,NUCLEOSIDESNUCLEOTIDESNUCLACIDS,24576514KIOPFFER和ENGELS，2005年，核苷、核苷酸、核酸，第2。
24、4卷，第57期，第651654页、嵌二萘官能化LNA核苷类似物BABUWENGEL,2001,CHEMCOMMUNCAMB2021145BABU和WENGEL，2001年，化学通讯剑桥，第20卷，第21142115页；HRDLICKAETAL,2005,JAMCHEMSOC12738132939HRDLICKA等人，2005年，美国化学会志，第127卷，第38期，第1329313299页、脱氮杂或氮杂改性嘌呤和嘧啶、5或6位具有取代基的嘧啶和2、6或8位具有取代基的嘌呤、2氨基腺嘌呤NA、2硫尿嘧啶SU、2氨基6甲基氨基嘌呤、O6甲基鸟嘌呤、4硫代嘧啶、4氨基嘧啶、4二甲基肼嘧啶和O4烷基嘧啶。
25、美国专利NO5,378,825；WO93/13121；GAMPERETAL,2004,BIOCHEM43311022436GAMPER等人，2004年，生物化学，第43卷，第31期，第1022410236页以及形成无氢键的双链DNA的疏水核碱基单元BERGERETAL,2000,NUCLACIDSRES281529114BERGER等人，2000年，核酸研究，第28卷，第15期，第29112914页。多种衍生化和改性核碱基单元或类似物可商购获得例如，弗吉尼亚州斯特林GLEN说明书CN104169438A4/23页8RESEARCH公司GLENRESEARCH,STERLING,VA。0018连。
26、接至糖的核碱基单元可称为核碱基单元或单体。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖或类似化合物，例如具有2甲氧基或2卤化物取代。核苷酸和核苷是核碱基单元的例子。本文所述的任何方法和探针可用核苷酸实施。0019核碱基单元可通过多种键或构象连接，包括磷酸二酯、硫代磷酸酯或甲基磷酸酯键、肽核酸键PNA；NIELSENETAL,1994,BIOCONJCHEM5137NIELSEN等人，1994年，生物缀合物化学，第5卷，第1期，第37页；PCTNOWO95/32305和锁核酸LNA构象，其中具有双环呋喃糖单元的核苷酸单体以RNA模拟糖构象锁定VESTERETAL,2004,BIOCHEMISTRY43421。
27、323341VESTER等人，2004年，生物化学，第43卷，第42期，第1323313241页；HAKANSSONWENGEL,2001,BIOORGMEDCHEMLETT1179358HAKANSSON和WENGEL，2001年，生物有机和药物化学通讯，第11卷，第7期，第935938页或核酸链中此类键的组合。核酸可包括一种或多种“非碱性”残基，即主链的一个或多个位置不包括含氮碱基美国专利NO5,585,481。0020核酸可以仅包括常规RNA或DNA糖、碱基和键，或可包括常规组分和取代二者例如，具有2O甲基键的常规RNA碱基，或常规碱基和类似物的混合物。包含PNA、2甲氧基或2氟代RNA。
28、或影响总电荷、电荷密度或杂交复合物包括包含带电键例如，硫代磷酸酯或中性基团例如，甲基磷酸酯的低聚物的空间结合的结构，可影响核酸形成的双链的稳定性。0021核酸及其组分核苷酸可以D或L型存在。D型是天然型。L核酸是D核酸的对映体形式。核酸残基中的立体异构来源是形成核酸的每个单体单元的糖部分。除每个单体单元糖部分的立体异构之外，D和L核酸及它们的单体单元非常相似。因此例如L核酸的糖部分可连接至天然DNA或RNA中存在的相同核碱基单元即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，或这些核碱基单元的任何多种已知类似物。L核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖或类似化合物例如，具有2甲氧基或2卤化物取代。糖部。
29、分可通过D核酸中的糖磷酸二酯键或通过任何用于D核酸的类似键连接，诸如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯键或肽核酸键。0022掺杂至少常规核碱基单元即，A、C、G、T和U的L核苷酸可以适于固相合成的亚磷酰胺形式商购获得例如，美国怀俄明州CHEMGENES公司CHEMGENESCORPORATIONWILMINGTON,USA。L核酸可使用与D核酸所用相同的固相合成过程从L核苷酸合成例如，ABI合成仪和标准合成方案。L核苷酸也可通过常规连接循环连接至D核苷酸参见HAUSERETAL,NUCLEICACIDSRESEARCH,2006,VOL34,NO18510151112006HAUSER等人，核酸研究，20。
30、06年，第34卷，第18期，第51015111页，2006年，从而允许合成一条为D核酸形式片段而另一条为L核酸形式片段的嵌合核酸。0023L核酸根据与D核酸类似的原理彼此杂交例如，形成WATSONCRICK或HOOGSTEIN键，并且与D核酸杂交体具有类似的稳定性。L核酸形成的双链是左手螺旋，而D核酸形成的则是右手螺旋。虽然L核酸可彼此杂交，如实例中进一步示出，L核酸尤其是POLYA或POLYTL核酸不能与POLYA或POLYTD核酸的互补片段杂交。0024除非语境中另外指明，未详细指明D型或L型时提及核酸或核苷酸包括两种可能性中的任何一者或两者。然而，语境可表明仅意指D核酸或核苷酸。例如，无。
31、论是否指说明书CN104169438A5/23页9明，天然存在的核酸可理解为仅包含D核苷酸，通过此类核酸形成合适双链的探针的片段亦如此。0025低聚物可包含称为一组低聚物的“随机聚合物”序列，所述低聚物的总长度和其他特性基本上相同，但其中至少一部分低聚物通过随机掺入不同碱基特定的长度而合成，例如DNA低聚物中所有四种标准碱基A、T、G和C的随机分选，或大低聚物预定部分几个碱基U和G的随机分选。所得的低聚物实际上为一组其成员的有限数量通过长度和组成随机部分例如，一组包含使用2种不同碱基合成的6个核苷酸随机序列的低聚物中的2EXP6低聚物的碱基数量确定的低聚物。0026核酸的互补性意指核酸的一个链。
32、中的核苷酸序列，由于其核碱基基团的取向，通过氢键结合至相对核酸链上的另一个序列。DNA中互补碱基通常为A与T和C与G，RNA中为C与G和U与A。互补性可为完美的或基本的/充分的。两条核酸之间的完美互补意指两条核酸可形成其中双链中的每个碱基通过WATSONCRICK配对键合至互补碱基的双链。“基本”或“充分”互补意指一条链中的序列与相对链中的序列不完全和/或完美互补，但两条链上的碱基之间存在充分键合，在一组杂交条件下例如，盐浓度和温度形成稳定的杂交复合物。此类条件可使用序列和标准数学计算预测杂交链的TM，或使用常规方法通过经验确定TM来预测。TM是指两条核酸链之间形成一组杂交复合物50变性的温度。
33、。在低于TM的温度下，杂交复合物的形成是优选的，而在高于TM的温度下，杂交复合物中链的解链或分离是优选的。可通过使用例如TM815041GC估计溶于1MNACL水溶液的已知GC含量的核酸的TM，但其他已知TM计算考虑核酸结构特性。0027“杂交条件”是指其中一条核酸链通过互补链相互作用和氢键键合至第二核酸链生成杂交复合物的累积环境。此类条件包括包含核酸的水或有机溶液的化学组分及它们的浓度例如，盐、螯合剂、甲酰胺，以及混合物的温度。其他因素诸如温育时间长度或反应室尺寸可有助于环境例如，SAMBROOKETAL,MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL,2SUPNDED。
34、,PP190191,947951,11471157COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,COLDSPRINGHARBOR,NY,1989SAMBROOK等人，分子克隆实验室手册，第2版，第190191、947951、11471157页，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港，1989年。0028靶标捕获低聚物与靶核或靶核酸特异性结合意指靶标捕获低聚物的第一片段中的单个确定序列和靶核酸上的完全或基本互补片段之间结合形成稳定双链。可检测到此类结合比缺乏单个确定靶标捕获低聚物序列完全或基本互补的片段的样品中其他核酸的结合更强信号或解链温度更高。靶标捕获低聚物与靶核酸的非特异性结合。
35、意指靶标捕获低聚物可结合不与单个确定靶标捕获低聚物序列完全或基本互补的片段共有的一组靶序列。这可通过例如使用捕获探针的第一片段中的随机序列实现。0029缺乏核酸之间的结合可以不易与缺乏基本互补但与所考虑的核酸长度相同的随机选择的核酸对之间存在的非特异性结合区别的结合表示。0030“分离”或“隔离”或“纯化”是指从复合混合物诸如样品移除一种或多种组分。优选地，分离、隔离或纯化步骤从其他样品组分移除至少70、优选地至少90以及更优选地约95的靶核酸。分离、隔离或纯化步骤可任选地包括另外的洗涤步骤，以移除非靶标样品组分。至少X是指在X至100的范围内，包括所有整数和小数例如，70、825说明书CN1。
36、04169438A6/23页10等。0031捕获杂交体的“释放”是指使捕获杂交体的一种或多种组分彼此分离，诸如从捕获探针分离靶核酸和/或从固定化探针分离靶标捕获低聚物。靶核酸链的释放从捕获杂交体的其他组分分离靶标，使靶标可结合检测探针。捕获杂交体的其他组分可保持结合，例如靶标捕获低聚物结合捕获载体上的固定化探针，而不影响靶标检测。0032提及一系列值还包括范围内的整数和范围内整数定义的子范围。0033转录介导扩增TMA是可在小于一小时的时间内扩增RNA或DNA靶标十亿倍的基于核酸的等温方法。TMA技术使用两个引物和两个酶RNA聚合酶和逆转录酶。一个引物包含RNA聚合酶的启动子序列。在扩增的第一。
37、步骤中，该引物杂交至靶标RNA的预定位点。逆转录酶通过从启动子引物的3末端延伸生成靶标RRNA的DNA拷贝。所得的RNADNA双链中的RNA被逆转录酶的RNASE酶活性降解。然后，第二引物结合至DNA拷贝。DNA的新链通过逆转录酶从该引物的末端合成，生成双链DNA分子。RNA聚合酶识别DNA模板中的启动子序列并且启动转录。每个新合成的RNA扩增子再进入TMA过程并且作为新一轮复制的模板。0034逆转录酶PCRRTPCR包括三个主要步骤。第一步骤是逆转录RT，其中RNA使用逆转录酶逆转录为CDNA。RT步骤可在与PCR相同的管内进行使用40和50之间的温度，取决于所用的逆转录酶的特性。下一步涉及。
38、在为或约为95的温度下DSDNA的变性，使得两条链分离，并且引物可在低温下再次结合并开始新链反应。然后，降低温度直到其达到退火温度，所述退火温度可根据一组所用的引物、它们的浓度、探针及其浓度如果使用以及阳离子浓度而变化。通常使用比引物对的最低TM低约5的退火温度例如，为或约为60。RTPCR利用一对引物，它们分别与CDNA的两条链中的一条的序列互补。PCR扩增的最终步骤是使用DNA聚合酶，优选地热稳定TAQ聚合酶通常在为或约为72下从引物延伸DNA，该酶在该温度下的工作状态最佳。每个温度下的温育长度、温度改变和循环数通过可编程的热循环仪控制。0035实时聚合酶链式反应也称为定量实时聚合酶链式反。
39、应QPCR/QPCR/QRTPCR或动力学聚合酶链式反应KPCR，是基于PCR的实验室技术，其用于扩增和同时定量靶标DNA分子。其允许DNA样品中一个或多个特异性序列的同时检测和定量当归一化为DNA输入或另外的归一化基因时，为拷贝的绝对数或相对数。具体实施方式0036I概述0037本专利申请提供改善的茎环靶标捕获低聚物以及使用方法。如发明背景中所讨论，US20060068417中描述的茎环靶标捕获低聚物具有减少空靶标捕获低聚物结合至固定化探针的优点。然而，此类探针由于在靶核酸可结合捕获探针之前打开茎环结构的障碍，也可具有减少靶标检测的灵敏度的缺点。本发明的茎环靶标捕获低聚物在不存在靶核酸但提供。
40、改善的靶标灵敏度的情况下，保持很少结合至或不结合至固定化探针的优点。所述改善源于靶标捕获低聚物的臂形成不等长的茎。虽然机制的理解对于本发明的实施不是必须的，但据信臂的不等长使探针的环部分更易于结合靶核酸，从而增加灵敏度。本发明的发夹环探针尤其可用于多种检测方法，其中存在检测多个靶核酸例如，检测靶基因的说明书CN104169438A107/23页11多个多态性形式的多个靶标捕获低聚物。0038II靶标捕获低聚物0039本发明的靶标捕获低聚物可再分为至少三个片段，第一和第二茎片段侧面的核酸靶标结合片段。靶标结合片段被构造成特异性或非特异性结合至靶核酸参见US6,110,678和WO2008/016。
41、988。第一和第二茎片段被构造成彼此结合，并且茎片段中的一者可任意称为第一茎片段，其也被构造成结合至固定化探针。第一和第二茎片段通过分子内杂交形成茎环结构来彼此结合，其中第一和第二茎片段形成茎，靶标结合片段形成环。茎环结构有时也称为发夹环。在不存在靶的情况下，茎环结构在低于其解链温度的杂交条件下形成，并且靶标捕获低聚物可称为失活的。当存在靶核酸时，其结合至靶标结合环片段，使茎片段分离或保持分离，从而通过允许第一片段杂交至固定化探针的互补片段来活化靶标捕获低聚物。靶标捕获低聚物可提供已经形成的茎环结构，或提供分离的茎或分子的混合组，其中一些形成茎，但另一些不形成茎。在提供时无论靶标捕获低聚物的形。
42、式如何，当靶标捕获低聚物置于低于其解链温度的杂交条件下时，茎环结构可在使用中形成。0040靶标捕获低聚物可以如下构造表示ABC，其中A和C为被构造为形成双链茎的不等长的第一和第二茎片段，并且B为被构造为形成单链环部分的靶标结合片段。在该式中，A或C中的任何一者可视为探针的5末端。0041在一些捕获探针中，第一茎片段包含至少15个核碱基单元，并且第二茎片段包含至少5个核碱基单元。在一些捕获探针中，第二茎片段为第一茎片段的长度的3961。在一些捕获探针中，第一和第二茎片段长度差异为至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核碱基单元，例如差异为515个核碱基单元，并且优选地至少7个。
43、核碱基单元。在一些捕获探针中，第一茎片段具有1726个核碱基单元，并且第二茎片段具有716个核碱基单元。在一些捕获探针中，第一茎片段具有1725个核碱基单元，并且第二茎片段为715个核碱基单元，并且第一茎片段比第二茎片段长至少7个核碱基单元。形成靶标捕获低聚物的第一和第二茎片段的核碱基长度的一些具体例子包括以第一片段的长度第二片段的长度列出A187至1811的长度范围；B219至2112的长度范围；C2010的长度；以及D2410至2415的长度范围。核碱基单元提供的范围包括构成该范围的所有整数；意指例如A为长度为18个核碱基单元的第一片段，以及长度为7个、8个、9个、10个或11个核碱基单元。
44、的第二片段。在一些探针中，第一茎片段具有1540个核碱基单元，并且第二茎片段具有1030个核碱基单元。优选地，此类捕获探针中的第一茎片段比第二茎片段长至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核碱基单元，更优选地至少7个核碱基单元。0042在一些捕获探针中，第一和第二茎片段的较长者占据靶标捕获低聚物的5末端，并且被构造成结合至捕获探针上的互补片段。在其他捕获探针中，第一和第二茎片段的较长者占据探针的3末端和/或第一和第二茎片段的较短者被构造成结合至固定化探针的互补片段。0043靶标捕获反应期间存在的不同双链的相对解链温度的例子通过讨论茎双链和靶标结合片段靶核酸双链示出。所述第一。
45、和第二茎片段之间形成的双链的解链温度优选地低于靶标结合片段和靶核酸之间形成的双链的解链温度。茎片段相对较低的解链温度可通过将第一和第二茎片段设计为包含POLYA和POLYT核碱基单元的互补片段，其中靶标结说明书CN104169438A118/23页12合片段和靶核酸双链包括至少一些G和C核苷酸来获得。换句话讲，如果第一茎片段包含POLYA，则第二茎片段包含POLYT，或反之亦然。优选地，被构造成结合至固定化探针上的互补片段的第一茎片段包含POLYA，并且第二茎片段包含POLYT。然后第一茎片段的POLYA片段可杂交至固定化探针上的POLYT片段。在一些探针中，第一片段包含A1540即，15至4。
46、0个A的均聚物，第二片段包含T1030即，1030个T的均聚物。在一些此类探针中，第一茎片段比第二茎片段长至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核碱基单元，优选地长至少7个核碱基单元。其中T用于取代A以及反之亦然的反向构造也是可能的。0044被构造成结合第二茎片段的第一茎片段也被构造成结合至固定化探针。第一茎片段包括与固定化探针中存在的核酸基本并且优选地完全互补的核酸。例如，如果第一片段包括POLYA均聚物，则固定化探针的核酸包括POLYT均聚物。第一茎片段和固定化探针之间形成的双链的解链温度优选地小于第一茎片段和第二茎片段之间所形成的解链温度。在其他条件都相同的情况下，第。
47、一和第二茎片段之间形成的双链的解链温度通常高于第二茎片段和固定化探针之间形成的双链的解链温度，因为前面的双链来自分子内杂交，后面的来自分子间杂交。不同的解链温度可另外地或作为另外一种选择通过例如使固定化探针中的POLYT均聚物比第二茎片段中的短来实现。0045任选地，固定化探针的第一和第二茎片段和固定化探针中第一茎片段的互补片段可以是L核酸，如共同待审的专利申请PCT/US2011/052050中所描述。因为L核酸仅杂交至其他L核酸，L核酸的使用还可增加所需靶核酸捕获的特异性。对于此类捕获探针，固定化探针还具有与捕获探针的第一片段互补的L核酸片段。0046靶标捕获低聚物的靶标结合片段通常设计为。
48、结合所关注的靶核酸序列。任选地，靶标结合片段具有2O甲基键或增强结合的其他改性结构。在一些捕获探针中，靶标结合片段设计为结合至具体靶核酸中的片段，并且不结合至缺乏样品中存在的该片段的其他核酸或至少基本上减小亲合力。在其他捕获探针中，靶标结合片段设计为结合至一类靶核酸例如，任何DNA分子，并且不必基本上区分该类中单个靶核酸例如，使用随机序列。过量的靶标捕获低聚物构造成使得靶标结合片段不结合非靶标物质，从而活化靶标捕获低聚物。因此，非活性构造中过量的靶标捕获低聚物不与固定化探针形成双链，导致捕获污染的核酸和/或导致捕获效率下降。0047对于结合至所关注的具体靶核酸序列的靶标结合片段，靶标结合片段可。
49、设计为包括与靶核酸的对应片段基本上并且优选地完全互补的核酸。此类第一片段的核酸优选地包括至少6个、10个、15个或20个核碱基单元例如，核苷酸。例如，核酸可包含1050个、1040个、1030个或1525个与靶核酸中对应的核苷酸互补的核碱基单元例如，核苷酸。此处如本专利申请别处所述，邻接核酸序列的范围全部为整数，包括限定该范围的或在该范围内的所有整数。0048对于捕获一组相关靶分子的靶标捕获低聚物例如，患者样品中的病毒RNA组，其中分子由于存在突变而彼此不同，靶标结合片段优选地设计为与该组不同成员中相对保守的靶片段互补。0049对于非特异性结合至类别中的不同序列无必要的基本区别的核酸的靶标结合片段，靶标结合片段可包括所有四种标准DNA碱基鸟嘌呤G、胞嘧啶C、腺嘌呤A和胸说明书CN104169438A129/23页13腺嘧啶T或所有四种标准RNA碱基G、C、A和尿嘧啶U构成的随机聚合物序列参见US2008/0286775。随机序列还可包括一个或多个碱基类似物例如，肌苷、5硝基吲哚或随机聚合物序列中的非碱性位置。此类随机聚合物序列可包含聚K碱基的一个或多个序列，即G和U或T碱基的随机混合物例如，参见WIPOHANDBOOKONINDUSTRIALPROPERTYINFORMATIONANDDOCUMENTAT。