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1、10申请公布号CN104312975A43申请公布日20150128CN104312975A21申请号201410499649222申请日20140925C12N5/095201001G01N33/6820060171申请人中国人民解放军第三军医大学第一附属医院地址400038重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号72发明人姚小红吴海波卞修武戴建武74专利代理机构北京元本知识产权代理事务所11308代理人黎昌莉54发明名称一种胶质瘤干细胞的体外三维培养模型及应用57摘要本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型及应用。所述体外三维培养模型的制备按照如下步骤进行。
2、将三维胶原支架置于DMEM培养基中浸泡624小时后取出，去除三维胶原支架上黏附的多余的DMEM得预处理三维胶原支架，将预处理三维胶原支架置于细胞培养板中，将成球的胶质瘤干细胞种植于预处理三维胶原支架中，于37静置26小时后，加入内皮培养基，37培养24天，即得到用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型。该体外三维培养模型各种操作过程均在室温下进行，可在原位进行各种染色，包括免疫组化、免疫荧光染色；可进行电镜检测；可直接消化后进行RTPCR及WESTERNBLOT检测。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图。
3、3页10申请公布号CN104312975ACN104312975A1/1页21一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，其特征在于，所述体外三维培养模型的制备按照如下步骤进行将三维胶原支架置于DMEM培养基中浸泡624小时后取出，去除三维胶原支架上黏附的多余的DMEM得预处理三维胶原支架，将预处理三维胶原支架置于细胞培养板中，将成球的胶质瘤干细胞种植于预处理三维胶原支架中，于37静置26小时后，加入内皮培养基，37培养24天后，即得到用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型；所述内皮培养基为添加有2胎牛血清、青霉素100U/ML和链霉素100U/ML的EBM培养基。2根据权利要。
4、求1所述的一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，其特征在于，所述三维胶原支架的材料为型胶原，孔径直径为300500M。3根据权利要求1所述的一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，其特征在于，所述成球的胶质瘤干细胞的制备方法为胶质瘤细胞用含10胎牛血清的DMEM培养基培养23天后将培养基吸弃，加入PBS清洗后吸弃，重复PBS清洗23次，然后加入10ML胶质瘤干细胞培养基进行培养，此后每天采用半换液方式添加新的胶质瘤干细胞培养基培养57天即可成球，得到成球的胶质瘤干细胞。4根据权利要求13任一项所述的一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，其特征在于，所述胶。
5、质瘤细胞为胶质瘤细胞株U87或原代胶质瘤细胞091214。5根据权利要求4所述的一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，其特征在于，所述胶质瘤细胞为绿色荧光蛋白标记的胶质瘤细胞。6根据权利要求1所述的一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，其特征在于，将成球的胶质瘤干细胞种植于预处理三维胶原支架中，于37静置4小时。7根据权利要求1所述的一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，其特征在于，加入内皮培养基，37培养3天。8三维胶原支架在制备用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型中的应用，其特征在于，所述三维胶原支架的材料为型胶原，孔径直径为300500。
6、M。权利要求书CN104312975A1/4页3一种胶质瘤干细胞的体外三维培养模型及应用技术领域0001本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型及应用。背景技术0002肿瘤的生长和远隔病灶的形成有赖于血液供应，经典的血管生成理论认为，当实体肿瘤长至12MM3时，需诱导生成新的血管来获取血供，否则肿瘤就会停止生长。随着对肿瘤生物学研究的不断深入，近些年人们还发现肿瘤细胞还可以通过自身变形、围绕形成管腔，以一种独立于内皮细胞依赖性血管的血管拟态VASCULOGENICMIMICRY，VM方式构筑肿瘤微循环。自1999年MANIOTIS等报道了恶性黑色素瘤。
7、中存在一种肿瘤新的微循环模式血管生成拟态VASCULOGENICMIMICRY,VM后，人们在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌和胶质瘤等肿瘤中证实了VM的存在。神经胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤，已研究证实了胶质瘤中也存在血管生成拟态现象，而且与胶质瘤患者预后相关。胶质瘤干细胞在胶质瘤血管生成拟态现象中可能起着主要的作用。0003血管生成拟态与传统肿瘤血管生成途径不同，它不依赖机体血管内皮细胞的增生，因此，在研究血管拟态形成的细胞和分子机制时，要求体外培养的细胞通过自身变形形成管样结构。但是在体外二维培养过程中，当细胞密度达到一定数量时，细胞突起间极易相互连接，从而形成所谓的“管样。
8、结构”，但该结构并非由细胞形成的管样结构，不能真实反映体内血管拟态的结构。因此，需寻找一种细胞培养模型可以模拟体内血管拟态的结构。0004目前常用的研究血管新生的体外模型是MATRIGEL胶三维培养模型。但MATRIGEL胶实质是一种基质胶，仅为细胞培养提供基质，而非真正意义的三维培养体系。此外，由于MATRIGEL胶自身的原因，在研究过程中发现其存在以下缺点1MATRIGEL胶在常温处于胶冻样，操作必须在4以下的低温环境中进行，这会对细胞造成损伤；2由于细胞在二维培养的某些细胞表型与三维培养不同，因此在研究VM时想要找到一种可以进行原位检测的细胞培养模型，但MATRIGEL胶不易溶解、本底易。
9、于着色等原因，不能在该培养模型原位进行检测。目前，MATRIGEL胶仅用来验证细胞是否在一定的处理条件下可以形成管样结构，这在很大程度上限制了体外血管拟态的研究进展。因此，在肿瘤体外血管拟态研究中，亟需建立一种适合研究血管拟态的体外三维培养模型。发明内容0005目前应用在制备3D细胞培养的主要材质包括天然有机物和无机大分子聚合物，天然有机物有胶原、壳聚糖、葡萄糖氨基聚糖类、藻酸盐、丝心蛋白、琼脂糖、淀粉；无机大分子聚合物有PGA聚乙醇酸、PLA聚乳酸、PLC聚己内酯、POE聚原酸酯及其多相聚合支架如PLGA等。本申请的发明人在研究过程中预料不到的发现，采用三维胶原支架为胶质瘤干细胞的细胞培养支。
10、架，在体外培养可得到一个新的、有效的体外三维培养模型，制备过程中各种操作过程均在室温下进行，该体外三维培养模型可排除在MATRIGEL胶上由于说明书CN104312975A2/4页4细胞突起连接形成的管样结构，可在原位进行各种染色，包括免疫组化、免疫荧光染色；可进行电镜检测；可直接消化后进行RTPCR及WESTERNBLOT检测，使用方便快捷，为体外血管拟态的研究提供了一种重要的工具，基于上述发现，从而完成了本发明。0006因此，本发明的目的在于提供一种用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，具体的，所述体外三维培养模型的制备按照如下步骤进行0007将三维胶原支架置于DMEM培养基中浸。
11、泡624小时后取出，去除三维胶原支架上黏附的多余的DMEM预处理三维胶原支架，将预处理三维胶原支架置于细胞培养板中，将成球的胶质瘤干细胞种植于预处理三维胶原支架中，于37静置26小时后，加入内皮培养基，37培养24天，即得到用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型。所述内皮培养基的配制为EBM培养基LONZA，CC3156，2胎牛血清GIBCO，10099133，青霉素PENICILLIN，100U/ML，链霉素STREPTOMYCIN，100U/ML。0008优选的，在上述的方法中，将成球的胶质瘤干细胞种植于预处理三维胶原支架中，于37静置4小时。0009优选的，在上述的方法中，加入内。
12、皮培养基，37培养3天。0010优选的，所述三维胶原支架的材料为型胶原，孔径直径为300500M。0011优选的，所述成球的胶质瘤干细胞的制备方法为胶质瘤细胞U87细胞株或原代胶质瘤细胞091214用含10胎牛血清GIBCO，10099133的DMEM培养基GBICO培养23天后将培养基吸弃，加入PBS购自北京中杉金桥生物技术有限公司清洗后吸弃，重复PBS清洗23次，然后加入10ML干细胞培养基进行培养，此后每天采用半换液方式添加新的干细胞培养基，培养57天即可成球，得到成球的胶质瘤干细胞。所述胶质瘤干细胞培养基配方为DMEM/F12INVITROGEN，CA，USA，BFGF10NG/ML，。
13、PEPROTECH，NJ，USA，EGF10NG/ML，PEPROTECH，NJ，USA，B27150，INVITROGEN，CA，USA，PENICILLIN100U/ML，STREPTOMYCIN100U/ML。0012进一步，所述胶质瘤细胞为U87细胞株或原代胶质瘤细胞091214。0013优选的，所述胶质瘤细胞为绿色荧光蛋白标记的胶质瘤细胞。0014本发明还提供了三维胶原支架在制备用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型中的应用，所述三维胶原支架的材料为型胶原，孔径直径为300500M。0015有益效果本发明采用三维胶原支架为胶质瘤干细胞的细胞培养支架，在体外培养可得到一个新的、。
14、有效的用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，制备过程中各种操作过程均在室温下进行；得到的该体外三维培养模型与现有的MATRIGEL胶培养模型相比，三维胶原支架培养细胞过程操作简单，各种操作过程均在室温下进行，细胞在三维胶原支架上形成的管样结构更为可信，可排除在MATRIGEL胶上由于细胞突起连接形成的管样结构。三维胶原支架培养细胞形成VM可在原位进行各种染色，包括免疫组化、免疫荧光染色；可进行电镜检测；可直接消化后进行RTPCR及WESTERNBLOT检测，使用方便快捷。附图说明0016图1胶质瘤干细胞在三维胶原支架和培养皿中二维培养的结果图A三维胶原支架；B扫描电镜显示三维胶原支架。
15、的超微结构；C、EU87和原代胶质瘤细胞091214的细胞说明书CN104312975A3/4页5球在干细胞培养基中形成干细胞细胞球；D、F扫描电镜显示胶质瘤干细胞在三维胶原支架中生长。0017图2胶质瘤干细胞在三维胶原支架中的分化现象A和B为扫描电镜显示胶质瘤干细胞在与三维胶原支架接触处出现分化现象箭头所示；C为RTPCR显示干细胞在三维胶原支架中干性基因表达下调。0018图3胶质瘤干细胞在不同三维培养条件下的生长方式A为采用MATRIGEL胶培养；B为采用三维胶原支架培养。0019图4胶质瘤干细胞在三维胶原支架中形成管样结构的HE染色、免疫荧光染色及电镜扫描观察结果。0020图5胶质瘤干细。
16、胞在三维胶原支架中形成管样结构的WESTERNBLOT检测结果。具体实施方式0021所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。0022本发明实施例中，DMEM培养基GIBCO，10胎牛血清GIBCO，10099133。0023胶质瘤干细胞培养基配方为DMEM/F12INVITROGEN，CA，USA，BFGF10NG/ML，PEPROTECH，NJ，USA，EGF10NG/ML，PEPROTECH，NJ，USA，B27150，INVITROGEN，CA，U。
17、SA，PENICILLIN100U/ML，STREPTOMYCIN100U/ML。0024三维胶原支架的材料由型胶原组成，孔径直径为300500M，三维胶原支架在扫描电镜下呈网孔状的三维结构如图1A和图1B。0025PBS购自北京中杉金桥生物技术有限公司。0026所述胶质瘤细胞为U87细胞株和原代胶质瘤细胞091214。U87细胞株来自ATCC，VA，USA。原代胶质瘤细胞091214来自第三军医大学第三附属医院神经外科住院病人胶质瘤切除标本。0027实施例1GFPU87及GFP091214成球实验0028在100MM培养皿内，将用绿色荧光标记的U87GFPU87用含10胎牛血清GIBCO，1。
18、0099133的DMEM培养基培养3天后，将培养皿内的培养基吸弃，加入5MLPBS清洗后吸弃，重复2次；加入10ML干细胞培养基，以后每天采用半换液方式添加新的干细胞培养基，57天即可成球，得到成球的GFPU87，用于传代和实验用。0029按照上述方法培养绿色荧光标记的原代胶质瘤细胞091214GFP091214得到成球的GFP091214，用于传代和实验用。0030实施例2胶质瘤干细胞的体外三维培养模型的建立0031将三维胶原支架用DMEM浸泡过夜，取出用滤纸将支架上黏附的多余的DMEM吸除，将支架放置于六孔板内，将实施例1中成球的GFPU87和GFP091214细胞分别种植于胶原支架，37。
19、孵箱内静置4小时后，加入5ML干细胞培养基培养3天，同时以实施例1培养皿内培养的GFPU87和GFP091214细胞球作为对照，扫描电镜观察结果显示，胶质瘤干细胞在胶原支架内呈三维立体方式生长，如图1D和图1F所示，培养皿内培养的GFPU87和GFP091214细胞球的结构如图1C和图1E所示。说明书CN104312975A4/4页60032采用RTPCR检测干性基因的表达情况，结果显示，与二维培养实施例1的方法相比三维胶原支架培养的干细胞的干性基因OCT4，SOX2及NANOG表达下调，如图2C；电镜结果显示与胶原支架接触处的细胞出现了明显的分化，如图2A和图2B。0033实施例3三维胶原支。
20、架与MATRIGEL胶培养模型的比较0034将三维胶原支架用DMEM浸泡过夜，取出用滤纸将支架上黏附的多余的DMEM吸除，将支架放置于六孔板内，将实施例1中形成的GFP091214细胞球分别接种在三维胶原支架和MATRIGEL胶上，37孵箱内静置4小时后，内皮培养基培养3天后，激光共聚焦显微镜显示胶质瘤干细胞在MATRIGEL胶和三维支架均可见管样结构形成。在三维胶原支架中可见由细胞形成三维管样结构，而在MATRIGEL胶形成的管样结构主要由细胞突起形成，结果如图3所示。0035实施例4利用三维胶原支架培养胶质瘤干细胞形成的管样结构细胞表达血管拟态相关蛋白的检测0036将三维胶原支架用DMEM。
21、浸泡过夜，取出用滤纸将支架上黏附的多余的DMEM吸除，将支架放置于六孔板内，将实施例1中制备的成球的GFPU87和GFP091214细胞分别种植于三维胶原支架，37孵箱内静置4小时后，用内皮培养基培养3天后；用镊子取出后放入10福尔马林固定20MIN，将上述支架制成10M的冰冻切片后，进行HE染色及免疫荧光染色，如图4所示，发现细胞在三维胶原支架形成管样结构，且这些细胞高表达血管拟态相关蛋白，取出支架放入2戊二醛固定并送电镜室制片，扫描电镜观察发现，细胞在支架内可形成管样结构，HE染色显示，胶质瘤干细胞在内皮细胞培养下，在胶原支架中形成管样结构。免疫荧光染色显示形成管样结构的细胞高表达血管拟态。
22、相关蛋白VECADHERIN，LAMININ，同时保持胶质瘤细胞标记物GFAP。扫描电镜SEM显示管样结构是由瘤细胞构成的。将支架直接放入蛋白提取液中，进行WESTERNBLOT检测，进一步证实，细胞高表达CD133，VECADHERIN，LAMININ，VEGFR2，如图5所示。0037从实施例24可以看出，与MATRIGEL胶相比，三维胶原支架培养细胞过程操作简单，各种操作过程均在室温下进行，细胞在三维胶原支架上形成的管样结构更为可信，可排除在MATRIGEL胶上由于细胞突起连接形成的管样结构。三维胶原支架培养细胞形成VM可在原位进行各种染色，包括免疫组化、免疫荧光染色；可进行电镜检测；可直接消化后进行RTPCR及WESTERNBLOT检测。与现有的培养模型相比，具有显著的进步性。0038最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。说明书CN104312975A1/3页7图1图2说明书附图CN104312975A2/3页8图3图4说明书附图CN104312975A3/3页9图5说明书附图CN104312975A。