酿酒酵母重组乙型肝炎病毒表面抗原流加补料发酵工艺 【技术领域】
本发明涉及微生物发酵领域。具体而言，本发明涉及利用酵母生产乙型肝炎表面抗原的发酵工艺。
背景技术
全世界受乙型肝炎影响的人群总数达20亿人，有3.5亿人为乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)携带者。感染乙型肝炎导致终身携带状态；发展的严重后遗症为肝硬化和原发性肝细胞肝癌。全世界乙型肝炎导致的死亡人数每年高达百万人。
中国属乙型肝炎高发地区，是世界肝炎大国，有六亿多人感染过乙型肝炎，HBsAg携带率达10％左右。其中有1,200万慢性肝炎病人失去或半失去劳动能力，终日挣扎在病痛中，并苦无良药，投医收效甚微，不少家庭因此而入贫困。每年有近100万人患急性乙型肝炎，约有25万人死于乙型肝炎有关的肝癌和肝硬化。
乙型肝炎病毒在1970年由Dane氏发现，通过电镜检查知道感染了乙型肝炎病毒的病人血清中有大量乙型肝炎病毒(HBV)颗粒，直径42-47nm，称为Dane氏颗粒，其血清浓度可高达1011/ml，因此病人血液具有极强的传染力。此外病人血液中还可检测到大量直径为22nm的球形和纤维型的亚病毒外壳蛋白(HBsAg)颗粒；它们不带病毒DNA，无传染性，血清浓度可高达1013/ml。
控制乙型肝炎主要依靠预防；乙型肝炎疫苗是预防乙型肝炎的最有效武器。通过从乙肝病人的血液中分离纯化HBsAg亚病毒颗粒，研制成功了第一代血源多肽乙型肝炎疫苗。后来应用最简单的真核细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为受体细胞，人们又成功地构建了DNA重组HBsAg工程菌株，它表达的HBsAg在酵母细胞的内质网上组装成为亚病毒颗粒；从而成为研制第二代基因重组多肽乙型肝炎疫苗的极好原料。
1986年美国FDA首次批准了Merck公司的酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗。1989年Smith Kline Beecham公司的另一酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗也得到FDA的批准。随后数年全世界相继研制成功数种酵母和CHO细胞重组乙型肝炎疫苗。到目前为止，世界上已有数以十亿计的人群接种了酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗，其有效性和安全性已得到充分肯定。儿童接种疫苗后，对乙型肝炎和丁型肝炎的免疫保护率达98％；而且它也是世界上第一个有效的抗癌疫苗，可有效地预防原发性肝细胞肝癌。初次免疫注射三针可保护五年以上，以后每五年加强注射一针，可终身保护。
目前，世界上大多采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae yeast)工程菌来生产生产重组的HBsAg。例如，在下列文献中就描述了这方面地内容：
美国专利5,013,650公开了一种利用酿酒酵母生产重组HBsAg的分批补料发酵工艺，用以增加外源蛋白的产量。所用啤酒酵母工程菌株的受体菌是亮氨酸营养缺陷型的；并且包含重组2μ质粒。该重组2μ质粒包含编码乙肝表面抗原的基因，该基因的5’端与半乳糖酶(GAL4)基因启动子和3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(GAPDH)可操作连接，3’端和乙醇脱氢酶I终止子可操作连接；所述重组2μ质粒还包含编码亮氨酸的基因，该基因的5’端和3’端分别与启动子和终止子可操作连接。该专利描述的分批补料发酵工艺要求：在不含半乳糖的培养基中流加葡萄糖，使细胞浓度生长至最大值；再通过离心、过滤或透析等方法，用半乳糖作为碳源的培养基置换掉原来的培养基，以此来诱导HBsAg的表达。而且该专利描述的是16升中试工艺，要在数百升生产工艺中完全置换培养基，使得葡萄糖浓度低于0.01％(W/V)很难实现，该专利的工艺基本上无实际生产应用价值。
美国专利6,232,111也公开了一种利用酿酒酵母生产重组HBsAg的分批发酵工艺，用以增加重组酵母表达HBsAg的产率。所用啤酒酵母工程菌是亮氨酸营养缺陷型的，并且包含重组2μ质粒。该重组2μ质粒包含与编码乙肝表面抗原的基因，该基因的5’端和3’端分别与3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子和乙醇脱氢酶I终止子可操作连接；所述重组2μ质粒还包含编码亮氨酸的基因，该基因的5’端和3’端分别与启动子和终止子可操作连接。该工艺包括如下步骤：
a)提供一定量酵母提取物用作试验；
b)测定此酵母浸出物中腺嘌呤的浓度；
c)若测定的腺嘌呤小于0.06克/42克干重，则调整腺嘌呤的浓度为0.06克/42克至0.10克/42克。
该专利通过对处于碳源浓度限制的条件下基础培养基酵母浸出物中腺嘌呤组份的批间差异进行调整，来调整分批发酵中细胞生长时相的生物量间的差异。
在目前的分批发酵工艺中存在的一个主要问题是，由于分批发酵的培养基含有天然酵母浸出粉、天然大豆蛋白胨和葡萄糖三种组份为一次性投料，生产过程中无法进行调节。其中特别以酵母浸出粉的品质对重组HBsAg生产率影响最大；即使高价购买进口原料，由于酵母浸出粉存在较大批间差异，导致不同发酵批次重组HBsAg生产率不稳定。有时虽然细胞浓度很高，而重组HBsAg的生产率却很低。二是分批发酵中，细胞的生长时相约为15-20小时；而在随后20-25小时的抗原表达时相，由于葡萄糖已耗尽，细胞停止生长，导致最终细胞浓度过低，也不利于提高重组HBsAg表达水平。
综上所述，有必要对现有的工艺进行改进，从而提高酿酒酵母生产重组HBsAg的产率。
【发明内容】
在利用含有非诱导型启动子的外源质粒的啤酒酵母工程菌生产乙肝表面抗原的方法中，本发明人发现重组HBsAg的生产率受到多因素的影响，其中生长发酵过程中啤酒酵母的生长速率是一个主要的因素。本发明人发现，在利用非诱导型启动子的重组酿酒酵母进行分批HBsAg的生产时，虽然细胞的生长和HBsAg表达是同时进行的，但仍可将生产发酵阶段分为两个时相：一个是以细胞的生长为主的生长时相，该时相自生产发酵开始后持续约10-20小时；另一个为以表达HBsAg为主的表达时相，该时相自上述生长时相后持续20-50小时或更长的时间。
本发明人经过深入细致的研究，发现无论是在生长时相还是在表达时相，酵母细胞的生长限制因素主要是腺嘌呤，因而终于设计出了新的表达时相流加补料发酵生产工艺，该工艺使单位发酵体积的重组HBsAg生产率在原来水平上显著地提高了数倍。通过低速流加补入腺嘌呤，一方面增加了菌体量，另一方面还保证了工程菌中重组质粒的保有率，从而提高了重组HBsAg的产量。在本发明流加补料工艺中，与腺嘌呤的流加速率相适应，同时低速补入碳源、氮源等物质，还可以更好控制酵母细胞的最适生长速率在0.01-0.03/hr之间。
具体而言，本发明提供一种利用啤酒酵母工程菌生产乙肝表面抗原(HBsAg)的方法，其中所述的啤酒酵母工程受体菌是ade(腺嘌呤)营养缺陷型细胞，其菌体呈粉红色；所述的啤酒酵母工程受体菌株还是亮氨酸营养缺陷型的，所述的啤酒酵母工程菌包含重组2μ质粒但不含天然的2μ质粒；所述重组2μ质粒包含与编码乙肝表面抗原的基因，该基因的5’端和3’端分别与分别与3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子和乙醇脱氢酶终止子可操作连接；所述重组2μ质粒还包含编码亮氨酸的基因，该基因的5’端和3’端分别与启动子和终止子可操作连接。该方法包括如下步骤：
1)所述啤酒酵母工程菌的种子培养步骤；
2)利用步骤1)制得的种子进行生产发酵的步骤；和
3)从步骤2)所得的发酵混合物中分离纯化出乙肝表面抗原的步骤；
该方法的特征在于，在上述在步骤2)中以腺嘌呤的重量计，以低于14mg/升·小时的速率向培养基中流加腺嘌呤、腺苷、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸或腺苷三磷酸，将酵母细胞的倍增时间控制为23.0-35.0小时。在下文中有时将腺嘌呤、腺苷、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸或腺苷三磷酸统称为含腺嘌呤的物质。
在本发明的方法中，优选以腺嘌呤的重量计，以低于10毫克/升·小时的速率流加腺嘌呤、腺苷、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸或腺苷三磷酸。更优选以腺嘌呤的重量计，以低于6毫克/升·小时的速率流加腺嘌呤、腺苷、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸或腺苷三磷酸。最优选以腺嘌呤的重量计，以低于2毫克/升·小时的速率流加腺嘌呤、腺苷、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸或腺苷三磷酸。
在本发明的方法中，其中腺嘌呤、腺苷、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸或腺苷三磷酸可以是以连续的流加方式添加到培养基中的。也可以以非连续的方式流加到培养基中。
为了延长生产发酵的时间并进一步提高乙肝表面抗原蛋白的表达量，在上述步骤2)中除了流加含腺嘌呤的物质外，还可以以低于1.0克/升·小时的速率向发酵混合物中流加补充酵母浸出粉、以低于0.8克/升·小时的速率向发酵混合物中流加补充大豆蛋白胨或以低于3.0克/升·小时的速率向发酵混合物中流加补充碳源，将酵母细胞的倍增时间控制为23.0-35.0小时。
在本发明中，所述的非诱导型启动子包括，但不限于，3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子。所述的与乙肝表面抗原基因可操作连接的终止子包括，但不限于，乙醇脱氢酶I终止子。
在本发明的方法中，可以在步骤2)开始后几个小时就添加含腺嘌呤的物质、酵母浸出粉、大豆蛋白胨和/或碳源。一般优选自生产发酵开始后12小时左右的时候添加，更优选在生产发酵开始后15小时左右的时候添加所述的酵母浸出粉、大豆蛋白胨或碳源，因为此时在基础培养基中的氮源、碳源和其他一些影响酿酒酵母生长的营养成分已经被消耗得差不多了。
在本发明的方法中，可以各种流加方式将含腺嘌呤的物质添加到酵母发酵混合物中。可以分批地将含腺嘌呤的物质流加到发酵混合物中。例如，在第一时间段以第一速率添加第一种含腺嘌呤的物质如腺嘌呤、腺苷、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸和/或腺苷三磷酸，然后再在第二时间段以和第一速率相同或不同的速率添加与第一种含腺嘌呤的物质相同或不同的第二种含腺嘌呤的物质如腺嘌呤、腺苷、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸、腺苷三磷酸中的任一种或几种的混合物。当然，第一速率和第二速率应低于14毫克/升·小时。也可以连续的方式以恒定的速度将含腺嘌呤的物质添加到发酵培养基中，还可以以连续的方式以变化的速率将含腺嘌呤的物质添加到发酵培养基中。从生产方便控制的角度考虑，优选以恒定速率连续流加的方式。
在本发明的方法中，可以各种流加方式将酵母浸出粉、大豆蛋白胨或碳源添加到酵母发酵混合物中。可以分批地将酵母浸出粉、大豆蛋白胨或碳源补加到发酵混合物中。例如，在第一时间段以第一速率添加酵母浸出粉，然后再在第二时间段以和第一速率相同或不同的速率添加酵母浸出粉。当然，第一速率和第二速率应低于1.0克/升·小时。同样，大豆蛋白胨或碳源也可以这种方式补加到发酵混合物中，只是应当将大豆蛋白胨的第一和第二补加速率控制在不超过0.8克大豆蛋白胨/升发酵混合物·小时的水平，将碳源的第一和第二的补加速率控制在低于3.0克碳源/升发酵混合物·小时的水平。也可以连续流加的方式将酵母浸出粉、大豆蛋白胨或碳源补加到发酵混合物中。并且，持续流加的方式是优选的，因为这样可使生产发酵的酵母有一个既有利于生长又有利于外源基因表达的环境。酵母浸出粉的持续流加速率最优选被控制低于0.5克/升·小时的范围内。大豆蛋白胨的持续流加速率被控制低于0.38克/升·小时的范围内。碳源的持续流加速率从0.1克/升·小时开始随时间递增至3.0克/升·小时，优选从1.1克/升·小时开始随时间递增至2.2克/升·小时。
在本发明的方法中对所述的碳源没有过多的限制，只要是能被所用的酿酒酵母工程菌用作生长所需的碳源即可，例如可以是葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、甘油，等等。但是，易于被酵母利用的单糖是优选的。
在本发明所用的酿酒酵母工程菌中所含的重组2μ质粒中，优选与亮氨酸基因可操作连接的启动子在3’端有缺失，使得含单拷贝重组质粒的亮氨酸缺陷型的啤酒酵母工程菌的亮氨酸表达水平是野生型啤酒酵母的5％左右。这样一来，在种子培养阶段也无需向培养基中另外添加外源的亮氨酸，只利用培养基的选择压力，使含有重组2μ质粒的所需工程菌被选择出来。
在本发明的方法中所述的啤酒酵母工程菌可以为单倍体菌株，也可以是二倍体菌株。在本发明的方法中所述的啤酒酵母工程菌可以为单倍体菌株，也可以是二倍体菌株。优选为单倍体菌株。作为用于本发明方法中的啤酒酵母工程菌的受体菌株包括，但不限于，啤酒酵母2150-2-3(MATa，adel，leu2-04，cir0)(参见，例如，由人民卫生出版社于1996年3月出版的由吴梧桐等编著的基因工程药物-基础与临床一书，第150-151页)，PF161(MATa，adel，leu2-04，cir0)(参见，例如，Valenzuela et.al.，1985，Biotechnology 3：317-320)和PF403(MATa/α，adel，leu2-04，cir0)(参见，例如，Cheryl A.Schulman et.al.，Journal of Biotechnology，21(1991)：109-126)。
带有质粒pHBS56-GAP347/33的啤酒酵母2150-2-3(MATa，adel，leu2-04，cir0)。在该菌株所含的质粒pHBS56-GAP347/33中，包含有LEU(亮氨酸)基因，该LEU基因的启动子的3′端缺失了29bp碱基序列，导致其亮氨酸表达水平下降，单拷贝质粒的亮氨酸表达水平只有野生株的5％。在生长发酵阶段，所用的培养基是不含亮氨酸的，因此在LEU的选择压力下，只有包含质粒拷贝数大于20的细胞才能在无亮氨酸的培养基中成活。
本发明优选在补加含腺嘌呤物质的同时在表达时相连续流加低浓度的天然酵母浸出粉和大豆蛋白胨，从而限定其中所含的亮氨酸浓度，使带有20个以上质粒拷贝的亮氨酸原养型细胞相对亮氨酸缺陷型细胞具有生长优势；从而实现了在发酵生产结束时，亮氨酸原养型细胞保有率达到或接近100％。
本发明的酿酒酵母重组HBsAg工程菌株受体菌中不带天然的2μ质粒，转化子中含有重组HBsAg的2μ质粒。但其对细胞的毒性随拷贝数增加而加剧；应用人工合成酵母氮基(YNB)作选择培养基，虽然可使亮氨酸原养型细胞保有率达到100％，但使细胞对高拷贝毒性的耐受性降低，最终导致细胞的平均拷贝数只能维持在20个左右。本发明采用连续流加低浓度的天然酵母浸出粉，其中含有的各种细胞因子有利于提高细胞对高拷贝毒性的耐受性；可使细胞中重组HBsAg的2μ质粒平均拷贝数增至100个以上(酿酒酵母细胞带有的天然2μ质粒拷贝数可达300个以上)；从而有利地提高了表面抗原的重量比生产率(HBsAg[μg]/细胞湿重[g])。
在本发明实施例中所使用的酿酒酵母重组HBsAg工程菌株表达盒的启动子为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，它为高强度的连续表达型启动子；其RNA的含量达细胞总RNA的5％。由于GAPDH为高强度的连续表达启动子的特性，采用延长生产发酵中表达时相周期，增大重组HBsAg的表达水平(HBsAg[μg]/升发酵混合物)；生产发酵周期由原来的40小时，逐步延长至52小时，64小时，直至72小时，乙型肝炎表面抗原的体积比生产率随时间延长，呈线性正比上升。
为检测酿酒酵母的生长情况，可利用本领域已知的技术在补料全过程检测发酵尾气中CO2和O2的摩尔浓度，保持呼吸商(RQ)≤1；这时碳源经氧化途径代谢，不积累乙醇；反之流加碳源浓度过大，呼吸商(RQ)>1，则碳源经酵解途径代谢而积累乙醇，不利细胞生长和表达。可采用Perkin-Elmer生产的气体分析仪，例如MAG 1200型分析仪对反应器排除的废气中CO2和O2水平进行分析，用于计算RQ值。
在本发明的实施例中使用的啤酒酵母工程菌为带有质粒pHBS56-GAP347/33的啤酒酵母2150-2-3(MATa，adel，leu2-04 cir0)，其构建过程请参见美国专利USSN 4,880,734和USSN 5,013,650。在该菌株所含的质粒pHBS56-GAP347/33中，包含有LEU(亮氨酸)基因，该LEU基因的启动子的3′端缺失了29bp碱基序列，导致其亮氨酸表达水平下降，单拷贝质粒的亮氨酸表达水平只有野生株的5％。在生长发酵阶段，所用的培养基是不含亮氨酸的，因此在LEU的选择压力下，只有包含质粒拷贝数大于20的细胞才能在无亮氨酸的培养基中成活。外源基因质粒pHBS56-GAP347/33是在2μ质粒中插入外源基因表达框架(由GAPDH启动子，HBsAgadw2基因，病毒终止序列和ADH1终止序列的复合终止子等三部分组成)；另外插入酿酒酵母LEU基因表达框架，作为转化子的选择标记。
酿酒酵母重组HBsAg工程菌株的发酵工艺方法为：将酵母贮存菌种接种至培养基中进行培养，通过四个生长阶段，逐步扩大细胞培养量。最后收获细胞，过滤浓缩，经破碎缓冲液洗涤，浓缩至35％(重量/体积比)，分装冷冻置-60℃保存备用。
附图说明：
图1是现有生产工艺中800升生产罐发酵工艺流程图。
图2是按照本发明的优选生产工艺中800升生产罐发酵工艺流程图。
图3是表明含腺嘌呤的物质是限制酿酒酵母工程菌生长的一个重要因素的图。其中，横坐标表示取样的时间，数字1表示在自发酵开始后31个小时时取样，数字2表示在自发酵开始后38个小时时取样，数字3表示在自发酵开始后48个小时时取样，数字4表示在自发酵开始后53个小时时取样；纵坐标表示测得的发酵培养液样品于660nm的的光密度值(OD660)。图3中的菱形表示对照组；正方形表示添加葡萄糖的实验组；三角形表示添加酵母浸出粉的实验组；乘号表示添加低浓度腺嘌呤的实验组；米字表示添加高浓度腺嘌呤的实验组。
具体实施方式的描述
申请人以下结合附图，以实施例的方式对本发明的方案作进一步的描述。但是，本发明的范围不受这些举例说明性的实施例的内容的限制。本发明实施例中采用的酿酒酵母工程菌株为2150-2-3(MATa，adel，leu2-04，cir0，含有质粒pHBS56-GAP347/33)，是从美国Merck公司通过技术转让取得的。该工程菌株的构建过程可参见美国专利4,880,734和美国专利5,013,650。
在下列实施例中，如无特别说明，所有的百分数均为重量体积比百分数。
实施例1
按照下表1所示的配方配制各种培养基，其中基本培养基的组成为酵母浸出粉1.65g/53ml、大豆蛋白胨1.925g/53ml、25％的葡萄糖3.75ml。其配制的方法为：称取DIFCO公司产酵母浸出粉1.65g，Sheffield公司产大豆蛋白胨1.925g，加入水溶解49.25ml定容(增加的酵母粉、腺嘌呤在这一步骤加入)。121℃，20分钟消毒。冷却后，加入121℃消毒20分钟的25％的葡萄糖3.75ml(增加的葡萄糖在这一步骤加入)。
以相同的接种量，将重组HBsAg工程菌株2150-2-3(MATa，adel，leu2-04，cir0)在下表1所示各种配方的培养基中在摇瓶中培养，31、38、48、53小时取样测660nm的OD值，数据总结在下表1中：
表1取样时间 基本培养基 (53毫升) 基本培养基 (53毫升) +25％葡萄糖 (2.2ml) 基本培养基 (53毫升) +酵母浸出 粉0.66g 基本培养基 (53毫升) +腺嘌呤8mg 基本培养 基(53毫 升)+腺嘌 呤18mg 31hr(1) 11.55 11.27 12.95 14.525 17.125 38hr(2) 12.54 11.7 14.4 16.38 18.9 48hr(3) 12.24 12.692 15.64 19.24 20.8 53hr(4) 13.25 13.26 16.55 19.58 22.45
将上表1中的菌体量的OD值随时间变化连线，结果如图3所示。该图3表明菌体生长量与腺嘌呤的含量正相关，与葡萄糖的增加与否无关，但与酵母浸出粉的添加有一定的相关性，这可能是酵母浸出粉中也含有腺嘌呤的缘故。
实施例2
基本上按照文献Cheryl A.Schulman et.al.，Journal ofBiotechnology，21(1991)：109-126)“Cell growth”部分所述的方法进行种子培养步骤。具体而言，将贮存的菌种解冻，接种于含有50毫升5XLEU选择性培养基的250毫升摇瓶中，于28℃以350rpm的转速培养18小时，然后平均转接到两个各含有500毫升5XLEU-选择性培养基的2升的摇瓶中，再于28℃以350rpm的转速培养18小时。所述5XLEU-选择性培养基的成分同文献Cheryl A.Schulman et.al.，JournalofBiotechnology，21(1991)：109-126)所述。
30升发酵罐连续补料培养采用YEPD培养基按如下方式进行：称量进口天然酵母浸出粉(DIFCO公司产品，商品货号为0127-01)371.2克(在发酵液中的含量为32克/升)，进口天然大豆蛋白胨(Sheffield公司的产品，商品货号为59022)417.6克(在发酵液中的含量为36克/升)，加水至9.9升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液700毫升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至6.0。接入按照上文所述培养成熟的种子1升。该整个生产发酵培养阶段均维持在28±1℃，以300rpm转速，以6升/分钟的通气量进行培养。培养至14小时，开始补料。补料装置采用中国河北省保定兰格公司生产的BT00-100M蠕动泵做传送动力，1.6mm的硅胶管做管道补入含葡萄糖、酵母浸出粉、大豆蛋白胨和腺嘌呤的混合溶液，酵母浸出粉的补入速度为0.26克/升·小时，大豆蛋白胨的补入速度为0.26克/升·小时，腺嘌呤的补入速度为1.6毫克/升·小时，葡萄糖的补入速度为1.2克/升·小时。培养至40小时结束发酵，收获湿细胞0.37公斤。如Cheryl A.Schulman(1991，出处同上文所述)所述，利用缺陷型培养基与完全培养基培养计数相比较的方法进行测定，测得亮氨酸原养型细胞保有率为100％；如Cheryl A.Schulman(1991，出处同上文所述)所述，按照定量电泳方法进行测定，测得细胞的平均外源基因质粒拷贝数在100个左右。用APV2000小型高压匀浆机在1000巴的条件下破碎两遍，用雅培酶联免疫分析试剂盒，按照厂商的指示，测得每升发酵液乙肝表面抗原(HBsAg)的含量为30.3mg。
实施例3
种子的培养步骤同实施例2。
按照下列方式进行生产发酵步骤，其中所用的材料的来源、补料装置、发酵温度、通气量、发酵罐的转速、测定亮氨酸原养型细胞保有率的方法、测定细胞的平均外源基因质粒拷贝数的方法以及测定每升发酵液中HBsAg含量的方法均与实施例2所描述的相同。
30升发酵罐连续补料培养：进口天然酵母浸出粉32克/升，进口天然大豆蛋白胨36克/升，加水至9.9升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液700毫升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至6.0。接入成熟的种子1升，培养至14小时，开始补料。补入含葡萄糖、酵母浸出粉、大豆蛋白胨和腺嘌呤的混合溶液，酵母浸出粉的补入速度为0.40克/升·小时，大豆蛋白胨的补入速度为0.20克/升·小时，腺嘌呤的补入速度为2.0毫克/升·小时，葡萄糖的补入速度为1.2克/升·小时。培养至52小时结束发酵，收获湿细胞0.36公斤。测定亮氨酸原养型细胞保有率为100％；细胞的平均外源基因质粒拷贝数在100个左右。用APV2000小型高压匀浆机在1000巴的条件下破碎两遍，用进口雅培酶联免疫分析法测得每升发酵液的HBsAg含量为54.78mg。
实施例4
种子的培养步骤同实施例2。
按照下列方式进行生产发酵步骤，其中所用的材料的来源、补料装置、发酵温度、通气量、发酵罐的转速、测定亮氨酸原养型细胞保有率的方法、测定细胞的平均外源基因质粒拷贝数的方法以及测定每升发酵液中HBsAg含量的方法均与实施例2所描述的相同。
30升发酵罐连续补料培养：进口天然酵母浸出粉32克/升，进口天然大豆蛋白胨36克/升，加水至9.9升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液700毫升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至6.0。接入用补料方式培养的种子1升，培养至14-15小时，开始补料。补入含葡萄糖、酵母浸出粉、大豆蛋白胨和腺苷三磷酸的混合溶液，酵母浸出粉的补入速度为0.50克/升·小时，大豆蛋白胨的补入速度为0.30克/升·小时，腺苷三磷酸的补入速度(按腺嘌呤的含量计算)为3.0毫克/升·小时，葡萄糖的补入速度为1.2克/升·小时至1.6克/升·小时递增。培养至64小时结束发酵，收获湿细胞0.5公斤。测定亮氨酸原养型细胞保有率为100％；细胞的平均外源基因质粒拷贝数在100个左右。用APV2000小型高压匀浆机在1000巴的条件下破碎两遍，用酶联免疫分析法测得每升发酵液的HBsAg含量为109.29mg。
实施例5
种子的培养步骤同实施例2。
按照下列方式进行生产发酵步骤，其中所用的材料的来源、补料装置、发酵温度、通气量、发酵罐的转速、测定亮氨酸原养型细胞保有率的方法、测定细胞的平均外源基因质粒拷贝数的方法以及测定每升发酵液中HBsAg含量的方法均与实施例2所描述的相同。
30升发酵罐连续补料培养：进口天然酵母浸出粉32克/升，进口天然大豆蛋白胨36克/升，加水至9.9升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液700毫升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至6.0。接入成熟的种子1升，培养至14小时，开始补料。补料装置采用兰格公司生产的两台BT00-100M蠕动泵做传送动力，1.6mm的硅胶管做管道。一台补入葡萄糖溶液，速度从1.2克/升·小时到2.4克/升·小时逐渐增加；另一台补入含酵母浸出粉、大豆蛋白胨和腺苷三磷酸的混合溶液，酵母浸出粉的补入速度为0.55克/升·小时，大豆蛋白胨的补入速度为0.35克/升·小时，腺苷三磷酸的补入速度(按腺嘌呤的含量计算)为4.0毫克/升·小时，葡萄糖的补入速度为从1.2克/升·小时至2.4克/升·小时递增。培养至72小时结束发酵，收获湿细胞0.57公斤。测定亮氨酸原养型细胞保有率为100％；细胞的平均外源基因质粒拷贝数在100个左右。用APV2000小型高压匀浆机在1000巴的条件下破碎两遍，用进口雅培酶联免疫分析法测得每升发酵液的HBsAg含量为149.04mg。
实施例6
种子的培养步骤同实施例2。
按照下列方式进行生产发酵步骤，其中所用的材料的来源、补料装置、发酵温度、通气量、发酵罐的转速、测定亮氨酸原养型细胞保有率的方法、测定细胞的平均外源基因质粒拷贝数的方法以及测定每升发酵液中HBsAg含量的方法均与实施例2所描述的相同。
30升发酵罐连续补料培养：进口天然酵母浸出粉32克/升，进口天然大豆蛋白胨36克/升，加水至9.9升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液700毫升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至6.0。接入成熟的种子1升，培养至14-15小时，开始补料。腺嘌呤的补入速度为14.0毫克/升·小时，葡萄糖的补入速度为1.2克/升·小时。补加腺嘌呤持续15小时。葡萄糖按原速率继续补加。培养至40小时结束发酵，收获湿细胞0.36公斤。测定亮氨酸原养型细胞保有率为100％；细胞的平均外源基因质粒拷贝数在100个左右。用APV2000小型高压匀浆机在1000巴的条件下破碎两遍，用进口雅培酶联免疫分析法测得每升发酵液的HBsAg含量为32mg。
实施例7
种子的培养步骤同实施例2。
然后将2升的种子转接到含有50升YEPD培养基的70升发酵罐中。70升发酵罐批发酵培养：进口天然酵母浸出粉1.6公斤，进口天然大豆蛋白胨1.8公斤，加水至45升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液3升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至5.0。接入成熟的种子2升。该整个生产发酵培养阶段均维持在28±1℃，以350rpm转速，以25升/分钟的通气量进行培养，培养18小时。
按照下列方式进行生产发酵步骤，其中所用的材料的来源、补料装置、发酵温度、通气量、发酵罐的转速、测定亮氨酸原养型细胞保有率的方法、测定细胞的平均外源基因质粒拷贝数的方法以及测定每升发酵液中HBsAg含量的方法均与实施例2所描述的相同。
800升发酵罐连续补料培养：进口天然酵母浸出粉14公斤，进口天然大豆蛋白胨19.25公斤，加水至400升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液35升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至6.0。接入成熟的种子50升。该整个生产发酵培养阶段均维持在28±1℃，以200rpm转速，以200升/分钟的通气量进行培养。培养至15小时，开始补料。补料装置采用Millipore公司生产的7549-60蠕动泵做传送动力，3.5mm的硅胶管做管道，一路补料补入葡萄糖溶液，速度从1.1克/升·小时到2.2克/升·小时逐渐增加；另一路补入含酵母浸出粉、大豆蛋白胨和腺嘌呤的溶液，酵母浸出粉的补入速度为0.32克/升·小时，大豆蛋白胨的补入速度为0.22克/升·小时，腺嘌呤的补入速度为1.8毫克/升·小时。培养至64小时结束发酵，收获湿细胞重38.5公斤。测定亮氨酸原养型细胞保有率为100％；细胞的平均外源基因质粒拷贝数在100个左右。每5小时检测一次发酵液中葡萄糖浓度，从第15小时后直至发酵结束，葡萄糖浓度均低于0.05(g/L)。用APV2000小型高压匀浆机在1000巴的条件下破碎两遍，用进口雅培酶联免疫分析法测得每升发酵液的HBsAg含量为138mg。
对比例1
种子的培养步骤同实施例2。
按照下列方式进行生产发酵步骤，其中所用的材料的来源、补料装置、发酵温度、通气量、发酵罐的转速、测定亮氨酸原养型细胞保有率的方法、测定细胞的平均外源基因质粒拷贝数的方法以及测定每升发酵液中HBsAg含量的方法均与实施例2所描述的相同。
30升发酵罐原批发酵工艺：进口天然酵母浸出粉32克/升，进口天然大豆蛋白胨36克/升，加水至9.9升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液700毫升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至6.0。接入成熟的种子1升，培养40小时。收获湿细胞0.18公斤。用APV2000小型高压匀浆机在1000巴的条件下破碎两遍，用进口雅培酶联免疫分析法测得每升发酵液乙肝表面抗原(HBsAg)的含量三批最高为6.35mg。
对比例2
种子的培养步骤同实施例2。
然后将2升的种子转接到含有50升YEPD培养基的70升发酵罐中。70升发酵罐批发酵培养：进口天然酵母浸出粉1.6公斤，进口天然大豆蛋白胨1.8公斤，加水至45升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液3升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至5.0。接入成熟的种子2升。该整个生产发酵培养阶段均维持在28±1℃，以350rpm转速，以25升/分钟的通气量进行培养，培养18小时。
按照下列方式进行800升发酵罐生产发酵步骤，其中所用的材料的来源、测定亮氨酸原养型细胞保有率的方法、测定细胞的平均外源基因质粒拷贝数的方法以及测定每升发酵液中HBsAg含量的方法均与实施例2所描述的相同。
800升发酵罐批发酵培养：进口天然酵母浸出粉14公斤，进口天然大豆蛋白胨19.25公斤，加水至530升，121℃，30分钟灭菌，冷却后，加灭菌过的25％的葡萄糖溶液35升，用灭菌过的9N磷酸溶液调pH至5.0。接入成熟的种子50升。该整个生产发酵培养阶段均维持在28+1℃，以200rpm转速，以200升/分钟的通气量进行培养。培养至40小时结束发酵，收获湿细胞重9公斤。测定亮氨酸原养型细胞保有率为100％；细胞的平均外源基因质粒拷贝数在100个左右。用APV2000小型高压匀浆机在1000巴的条件下破碎两遍，用进口雅培酶联免疫分析法测得每升发酵液的HBsAg含量为14mg。
试验例
采用Spectronic 20(Bausch and Lomb)，本发明人对流加补充酵母浸出粉、大豆蛋白胨和葡萄糖前和发酵结束时的酵母细胞A660下的光吸收值进行了测量，结果如下表2所示：
表2