说明书一种检测非整倍体杂交子代植株的分子标记引物及非整倍体杂交子代植株的检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测非整倍体杂交子代植株的染色体组成方法，属于生物技术 中植物遗传育种领域。
背景技术
对染色体数目变异(多倍化和非整倍化)的利用是植物遗传改良的重要途径， 不同的染色体数目和染色体组成可以产生具有显著表型性状变异的个体材料。烟草 (Nicotiana)单体系列、曼陀罗(Datura stramonium)三体系列等高等植物染色体 非整倍性变异经典案例，均在株形或果实形态等方面表现出明显变异。因此，非整 倍体育种是植物遗传改良的重要领域。
为分析多倍体和非整倍体的染色体组成，传统的染色体带型分析、荧光原位杂 交(Fluorescent in situ Hybridization,FISH)等核型分析方法被广泛采用(Dilkova M, Jellen EN,Forsberg RA.C-banded karyotypes and meiotic abnormalities in germplasm derived from interploidy crosses in Avena.Euphytica,2000,111(3):175–184；Xiong Z, Gaeta RT,Pires JC.Homoeologous shuffling and chromosome compensation maintain genome balance in resynthesized allopolyploid Brassica napus.Proc.Natl.Acad.Sci. USA,2011,108(19):7908–7913；Zhang H,Bian Y,Gou X,et al.Persistent whole-chromosome aneuploidy is generally associated with nascent allohexaploid wheat. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,110(9):3447–3452)。然而，传统核型分析方法操作 繁琐、技术难度大，对操作者染色体制片及分析水平要求较高，且耗时长、成本高、 效率低，不利于大规模群体的高通量分析，尤其对于染色体数目多、形态相似、个 体较小、特异探针缺乏的木本植物染色体而言，更是难以通过传统核型分析方法区 别不同染色体的差异。
近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展，阵列比较基因组原位杂交(array comparative genome hybridization,aCGH)(Hughes TR,Roberts CJ,Dai H,et al. Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.Nature Genet., 2000,25(3):333–337)、单核苷酸多态性基因型分析(SNP genotyping)(Rauch A, Rüschendorf F,Huang J,et al.Molecular karyotyping using an SNP array for genomewide genotyping.J.Med.Genet.,2004,41(12):916–922)等分子核型分析技术 逐渐成熟，并已在大麦、玉米等作物基因型分型研究中有所应用(Close TJ,Bhat PR, Lonardi S,et al.Development and implementation of high-throughput SNP genotyping in barley.BMC Genom.2009,10:582；Beló A,Beatty M K,Hondred D,et al.Allelic genome structural variations in maize detected by array comparative genome hybridization.Theor.Appl.Genet.,2010,120(2):355–367)。然而，高昂的检测成本限 制了上述新兴分子核型分析技术的广泛应用。因此，开发一种成本低廉、操作便捷、 检测效率高、可靠性强的核型分析技术对于林木个体染色体组成分析，推动非整倍 体遗传改良具有重要价值和实践意义，可望显著推动林木染色体工程育种研究进展。
SSR(Simple Sequence Repeat)是一种基于DNA长度多态性的分子标记技术， 其在动植物基因组中随机分布，呈共显性遗传，在遗传和物理图谱的构建、基因定 位、遗传多样性和物种进化分析、亲缘关系鉴定、DNA指纹图谱构建和分子标记辅 助育种等方面广泛应用，尤其可实现对复等位位点变化情况的共显性检测。目前， 基于基因组序列和EST序列已开发出大量杨树SSR标记引物(Yin TM,Zhang XY, Gunter LE,et al.Microsatellite primer resource for Populus developed from the mapped sequence scaffolds of the Nisqually-1genome.New Phytologist,2009,181(2):498–503； Du FK,Xu F,Qu H,et al.Exploiting the transcriptome of Euphrates Poplar,Populus euphratica(Salicaceae)to develop and characterize new EST-SSR markers and construct an EST-SSR database.PloS One,2013,8(4):e61337)，并且均可定位于杨属19个不同 的连锁群(染色体)，为创新杨树非整倍体植株检测方法提供了可能。
发明内容
本发明的目的是针对现有关于非整倍体杂交子代植株的染色体检测技术存在的 技术缺陷，提供一种检测非整倍体杂交子代植株的分子标记引物及其应用和检测非 整倍体杂交子代的方法，本发明方法的检测成本低、易操作、检测速度快、检测结 果准确、可靠性强，且适用于大规模群体材料分析的杨树非整倍体植株染色体构成 测定方法。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种检测非整倍体杂交子代植株的分 子标记引物，所述分子标记引物为SSR引物。
其中，所述分子标记引物的碱基序列为SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
特别是，所述序列为SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4的分子标记引物与杨树Ⅰ号染色体上标记位点碱基序列相对应；所述序列号 为SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6的分子标记引物与杨树VIII号染色体上标记位点 碱基序列相对应；所述序列号为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的分子标记引物 与杨树X号染色体上标记位点碱基序列相对应。
本发明另一方面提供一种上述分子标记引物在检测非整倍体杂交子代植株中的 应用。
其中，所述的非整倍体杂交子代植株来源于不同倍性体植株间的杂交。
特别是，所述非整倍体杂交子代植株选择杨树非整倍体杂交子代植株。
其中，所述杨树非整倍体杂交子代植株的父本是三倍体银中杨(Populus alba×P. berolinensis‘Yinzhong’)、三倍体毛白杨(P.tomentosa)或三倍体青杨杂种；母本是 毛新杨(P.tomentosa×P.bolleana)、银腺杨(P.alba×P.glandulosa)或青杨派树种。
特别是，所述父本选择三倍体银中杨；母本选择二倍体毛新杨。
本发明再一方面提供一种非整倍体杂交子代植株的检测方法，包括如下步骤： (1)利用流式细胞术初步确定杂交子代植株的倍性水平和染色体数目；(2)提取的 疑似非整倍体杂交子代植株以及杂交双亲植株的幼嫩叶片的DNA；(3)以提取的 DNA分别为模板，以分子标记引物为PCR扩增引物，分别进行PCR扩增；(4)将 PCR扩增产物分别进行毛细管荧光电泳检测，对获得的等位基因峰的数目和高度进 行辨认，确认杂交子代植株的等位基因的组成情况，如果位于染色体上的标记位点 数目超出或少于根据流式细胞术检测结果初步评估的杂交子代植株的倍性水平和染 色体数目，则可确定该植株为非整倍体植株，具有超数或少数的该条染色体。
其中，步骤(3)中所述的分子标记引物是SSR引物。
特别是，所述的分子标记引物的碱基序列为SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2； SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7 或SEQ ID NO：8所示。
尤其是，所述序列为SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4的分子标记引物与杨树Ⅰ号染色体上标记位点碱基序列相对应；所述序列号 为SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6的分子标记引物与杨树VIII号染色体上标记位点 碱基序列相对应；所述序列号为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的分子标记引物 与杨树X号染色体上标记位点碱基序列相对应。
其中，所述的非整倍体杂交子代植株来源于不同倍性体植株间的杂交。
特别是，所述杂交非整倍体子代植株选择杨树非整倍体杂交子代植株。
尤其是，所述杨树非整倍体杂交子代植株的父本是三倍体银中杨(Populus alba ×P.berolinensis‘Yinzhong’)、三倍体毛白杨(P.tomentosa)或三倍体青杨杂种，优 选为三倍体银中杨；母本是毛新杨(P.tomentosa×P.bolleana)、银腺杨(P.alba×P. glandulosa)或青杨派树种，优选为二倍体毛新杨。
本发明的分子标记引物的分子标记位点靠近着丝粒位置，父母本有差异且呈共 显性分离。以提取的疑似非整倍体杂交子代植株以及杂交双亲的幼嫩叶片的DNA 为模板，以分子标记引物为PCR扩增引物，分别进行PCR扩增；将PCR扩增产物 分别进行毛细管荧光电泳检测，对获得的等位基因峰的数目和高度进行辨认，以双 亲的基因为参照，结合流式细胞术测定结果，比较杂交子代植株等位基因的组成情 况，如果位于某条染色体上的标记位点数目超出或少于根据流式细胞术检测结果预 判的子代植株倍性水平和染色体数目，则可确定该植株为非整倍体植株，具有超数 或少数的该条染色体。
共显性分子标记可反映出等位基因在杂交子代中的分离情况，结合荧光标记分 析，可以开展等位基因的基因型分型。对于已知染色体定位的共显性分子标记(如 SSR标记)而言，通过选择靠近着丝粒的标记位点，有效减少同源重组的影响，可 以利用基因型分型结果推测对应染色体的组成。通过对相关分子标记引物数据库结 合电泳检测筛选，可以得到定位于不同染色体、靠近着丝粒位置、父母本有差异且 呈共显性分离的分子标记引物。
常规的二倍体间杂交极少见非整倍体的产生，而以多倍体作为亲本，利用多倍 体植株减数分裂过程不规律性染色体分离所形成的非整倍性配子杂交，较易获得非 整倍体植株。
本发明以三倍体‘银中杨’为父本，与母本二倍体‘毛新杨’杂交，通过引物 筛选并结合毛细管荧光电泳检测，得到了位于杨树I号、VIII号和X号染色体，靠 近着丝粒位置，父母本有差异且呈共显性分离的4对SSR引物。
本发明利用荧光标记的共显性分子标记位点分析，结合流式细胞术，对植物杂 交子代的染色体组成进行辨识，从而检测杨树非整倍体植株的存在，并进一步测定 染色体构成。本发明方法对于植物非整倍体遗传分析、分子标记技术方法判别以及 指导非整倍体育种等具有重要的理论和应用价值。
附图说明
图1引物U16扩增双亲及杂交子代DNA后的毛细管电泳图谱；
图2引物U21902扩增双亲及杂交子代DNA后的毛细管电泳图谱；
图3引物PMGC-2607扩增双亲及杂交子代DNA后的毛细管电泳图谱；
图4引物LG-10-1788扩增双亲及杂交子代DNA后的毛细管电泳图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明具体实施方式的试验材料选择如下：
以三倍体银中杨为父本，二倍体毛新杨为母本，进行控制授粉后获得的全同胞 子代群体，随机选取其中8株作为本发明具体实施方式的杂交子代待检测植株(分 别命名为PG1-8)。
实施例1
1、初步检测杂交子代植株的倍性水平
取50mg待测子代植株幼嫩叶片，置于冰上，加入1mL冷藏的细胞核分离缓 冲液，其中，细胞核分离缓冲液为45mM MgCl2·6H2O，20mM MOPS，30mM sodium citrate，0.5％Triton X-100，1％PVP-10，pH 7.0；接着用单面刀片迅速剁60s成碎片， 包含细胞核的分离缓冲液经40μm孔径纱网过滤后，向滤液中加入浓度为50μg/mL PI(Propidium Iodide，碘化丙啶染色溶液)溶液，混合均匀，其中PI溶液中含有 RNA酶，PI溶液中RNA酶的浓度为50μg/mL，然后在冰浴中孵育染色30min，然 后使用流式细胞仪(德国Partec公司，型号：CyFlow PA流式细胞仪)进行细胞核 DNA含量分析。
以双亲(即父本、母本)的细胞核作为对照。分析结果见表1。
表1基于流式细胞检测的杂交子代植株倍性预测结果
2、提取父本、母本、杂交子代的DNA
按照植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化公司)说明书步骤，分别提取杂 交双亲银中杨和毛新杨，以及待检测子代植株(PG1-8)的基因组DNA。
3、引物筛选
基于设定的标记要求，通过筛选，选择标记位点的物理位置靠近着丝粒，父母 本有差异且呈共显性分离分子标记引物，位于杨树1号染色体上的2对引物(表1) 进行实例分析，来源于Du等(2013)建立的EST-SSR数据库(U系列引物)。
表1适用于‘毛新杨’ב银中杨’子代I号染色体数目鉴定的SSR引物
此处给出物理位置主要是为了便于识别该标记位点与着丝粒的相对位置。
本发明对于引物的筛选也并非只选择了位于1号染色体上的，只是这里以1号 染色体作为实例1。
4、PCR扩增及毛细管荧光电泳分析
4-1、分别采用U16和U21902引物对杂交亲本的DNA进行PCR扩增以及对 扩增后的产物进行毛细管荧光电泳，分析杂交双亲植株的基因型：
其中，引物筛选的程序为：通过PCR反应程序(94℃预变性5min，94℃变性 30s，适宜温度退火45s，72℃延伸45s，进行30个循环后，72℃继续延伸10分钟) 得到PCR产物，在产物中加入4μL Loading Buffer(每100mL含溴酚蓝0.15g，二 甲苯青0.25g，蔗糖35g)混匀，取1.5μL经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染 后观察，在其中筛选出父母本之间存在共显性分离的引物。
对筛选出来符合要求的引物组合，配制包含2μL 10×Taq Buffer+，0.5U Taq DNA Polymerase(BioMed)，200mmol/L dNTPs(BioMed)，10-20ng模板DNA，0.4pmol M13F序列标记的上游引物，荧光标记的M13F序列和下游引物各1.6pmol的20μ LPCR反应体系。其中，对M13F序列进行修饰的荧光标记分为FAM，HEX，ROX， TAMRA(睿博兴科公司)4种，以便在同一试验中检测多个引物。配制好的反应体 系经由如下PCR反应：94℃预变性5min，94℃变性30s，适宜温度退火45s，72℃ 延伸45s，进行30个循环；94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸45s，进行8个 循环；72℃继续延伸10分钟。PCR反应产物送至睿博兴科公司进行毛细管电泳检测， 检测结果如下：
4-1-1)利用引物U16扩增的母本‘毛新杨’DNA，在171bp及174bp处有2 个峰谱，命名为AB型；父本‘银中杨’在171bp、177bp和180bp处有3个峰值， 命名为A’CD型。峰谱所在位置代表该引物扩增片段的大小，峰的高低则代表该片 段相对荧光强度，即相对DNA含量，检测结果如图1所示：
图A1为母本二倍体‘毛新杨’的毛细管荧光电泳结果图，在171bp及174bp 处有2个峰谱，分别定义为等位基因A和B，故母本基因型为AB；由于母本‘毛 新杨’为二倍体，其减数分裂正常，形成单倍性配子，杂交后为子代提供1份等位 基因，即将为子代提供171bp或174bp峰谱中的1份。
图A2为父本三倍体‘银中杨’的毛细管荧光电泳结果图，在171bp、177bp 和180bp处有3个峰值，其中171bp的峰值与母本重合，分别定位为等位基因A’、 C和D，故父本基因型为A’CD；
4-1-2)利用引物U21902扩增的母本‘毛新杨’DNA，在271bp及280bp处有 2个峰谱，命名为FG型；父本‘银中杨’在268bp和271bp处有2个峰值，其中 271bp的峰高为268bp峰高的约二倍，因此命名为EF’F’型。峰谱所在位置代表该引 物扩增片段的大小，峰的高低则代表该片段相对荧光强度，即相对DNA含量，检 测结果如图2所示：
图B1为母本二倍体‘毛新杨’的毛细管荧光电泳结果图，在271bp及280bp 处有2个峰谱，分别定义为等位基因F和G，故母本基因型为FG；由于母本‘毛新 杨’为二倍体，其减数分裂正常，形成单倍性配子，杂交后为子代提供1份等位基 因，即将为子代提供271bp或280bp峰谱中的1份。
图B2为父本三倍体‘银中杨’的毛细管荧光电泳结果图，在268bp和271bp 处有2个峰值，分别定义为等位基因E和F’，其中271bp的峰高为268bp峰高的约 二倍，结合‘银中杨’为三倍体，应具有3个等位基因进行综合分析，定义父本基 因型为EF’F’；
4-2、分别采用U16和U21902引物对杂交子代植株的DNA进行PCR扩增以 及对扩增后的产物进行毛细管荧光电泳，其中，PCR反应程序与毛细管荧光电泳与 步骤4-1)相同，分析确定每株植株的基因型，分析结果如下：
4-2-1)以引物U16进行PCR扩增后进行毛细管荧光电泳检测的结果如图1中 A3-10所示：
图A3-A10分别为8株不同杂交子代植株(PG1-8号子代植株)的基因型，依 次为AA’C、BCD、AA’CD、A’BDD、A’BCC、AC、BCD、AD。
图A3为杂交子代PG1的毛细管荧光电泳结果图，在171bp及174bp处有2个 峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份171bp峰谱(1份等位 基因A)，父本提供了1份171bp峰谱(1份等位基因A’)和1份174bp峰谱(1份 等位基因C)，因此可确定PG1的基因型为AA’C；
图A4为杂交子代PG2的毛细管荧光电泳结果图，在174bp、177bp及180bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份174bp峰谱(1 份等位基因B)，父本提供了1份177bp峰谱(1份等位基因C)和1份180bp峰谱 (1份等位基因D)，因此可确定PG2的基因型为BCD；
图A5为杂交子代PG3的毛细管荧光电泳结果图，在171bp、177bp及180bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份171bp峰谱(1 份等位基因A)，父本提供了171bp峰谱(1份等位基因A’)、177bp峰谱(1份等位 基因C)和180bp峰谱(1份等位基因D)各1份，因此可确定PG3的基因型为AA’CD；
图A6为杂交子代PG4的毛细管荧光电泳结果图，在171bp、174bp及180bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份174bp峰谱(1 份等位基因B)，父本提供了1份171bp峰谱(1份等位基因A’)和2份180bp峰谱 (2份等位基因D)，因此可确定PG4的基因型为A’BDD；
图A7为杂交子代PG5的毛细管荧光电泳结果图，在171bp、174bp及177bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份174bp峰谱(1 份等位基因B)，父本提供了1份171bp峰谱(1份等位基因A’)和2份177bp峰谱 (2份等位基因C)，因此可确定PG5的基因型为A’BCC；
图A8为杂交子代PG6的毛细管荧光电泳结果图，在171bp及177bp处有2个 峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份171bp峰谱(1份等位 基因A)，父本提供了1份177bp峰谱(1份等位基因C)，因此可确定PG6的基因 型为AC；
图A9为杂交子代PG7的毛细管荧光电泳结果图，在174bp、177bp及180bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份174bp峰谱(1 份等位基因B)，父本提供了177bp峰谱(1份等位基因C)和180bp峰谱各1份(1 份等位基因D)，因此可确定PG7的基因型为BCD；
图A10为杂交子代PG8的毛细管荧光电泳结果图，在171bp及180bp处有2 个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份171bp峰谱(1份等 位基因A)，父本提供了1份180bp峰谱(1份等位基因D)，因此可确定PG8的基 因型为AD。
4-2-2)以引物U21902进行PCR扩增后进行毛细管荧光电泳检测的结果如图2 B3-10所示：
图B3-B10分别为8株不同杂交子代植株(PG1-8号子代植株)的基因型，依 次为EF’G、EF’G、EFF’F’、F’F’F’G、EF’F’G、EF、EF’G、EF。
图B3为杂交子代PG1的毛细管荧光电泳结果图，在268bp、271bp及280bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份280bp峰谱(1 份等位基因G)，父本提供了268bp峰谱(等位基因E)和271bp峰谱(等位基因F’) 各1份，因此可确定PG1的基因型为EF’G；
图B4为杂交子代PG2的毛细管荧光电泳结果图，在268bp、271bp及280bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份280bp峰谱(1 份等位基因G)，父本提供了268bp峰谱(等位基因E)和271bp峰谱(等位基因F’) 各1份，因此可确定PG2的基因型为EF’G；
图B5为杂交子代PG3的毛细管荧光电泳结果图，在268bp及271bp处有2个 峰谱，其中271bp峰高约为268bp峰高的3倍，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可 知母本提供了1份271bp峰谱(1份等位基因F)，父本提供了1份268bp峰谱(1 份等位基因E)和2份271bp峰谱(2份等位基因F’)，因此可确定PG3的基因型为 EFF’F’；
图B6为杂交子代PG4的毛细管荧光电泳结果图，在271bp及280bp处有2个 峰谱，其中271bp峰高约为280bp峰高的3倍，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可 知母本提供了1份280bp峰谱(1份等位基因G)，父本提供了3份271bp峰谱(3 份等位基因F’)，因此可确定PG4的基因型为F’F’F’G；
图B7为杂交子代PG5的毛细管荧光电泳结果图，在268bp、271bp及280bp 处有3个峰谱，其中271bp峰高均约为其他二者的2倍，与父母本双亲峰谱及峰高 比较，可知母本提供了1份280bp峰谱(1份等位基因G)，父本提供了1份268bp 峰谱(1份等位基因E)和2份271bp峰谱(2份等位基因F’)，因此可确定PG5的 基因型为EF’F’G；
图B8为杂交子代PG6的毛细管荧光电泳结果图，在268bp及271bp处有2个 峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份271bp峰谱(1份等位 基因F)，父本提供了1份268bp峰谱(1份等位基因E)，因此可确定PG6的基因 型为EF；
图B9为杂交子代PG7的毛细管荧光电泳结果图，在268bp、271bp及280bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份280bp峰谱(1 份等位基因G)，父本提供了268bp峰谱(1份等位基因E)和271bp峰谱(1份等 位基因F’)各1份，因此可确定PG7的基因型为EF’G；
图B10为杂交子代PG8的毛细管荧光电泳结果图，在268bp及271bp处有2 个峰谱，且两者峰高相当，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份271bp 峰谱(1份等位基因F)，父本提供了1份268bp峰谱(1份等位基因E)，因此可确 定PG8的基因型为EF。
5、检测结果分析
结合流式细胞术的杂交子代植株倍性水平的初步检测结果，推断杂交子代植株 的倍性，结果如表2，其中：
杂交子代PG1号植株为疑似三倍体，其I号染色体数为三条，符合预期；PG2 号植株为超过三倍体的疑似非整倍体，其I号染色体数为三条，超数染色体可能为 其他染色体，可以利用位于其他染色体上的标记引物可进一步明确其染色体构成； PG3号植株为疑似四倍体，其I号染色体数为四条，符合预期，并且包含父本的所 有等位基因，表明父本可能产生了未减数配子；PG4号植株为超过四倍体的疑似非 整倍体，其I号染色体数为四条，超数染色体可能为其他染色体，通过利用位于其 他染色体上的标记引物可进一步明确其染色体构成；PG5号植株为疑似四倍体，其 I号染色体数为四条，符合预期，并且包含父本的所有等位基因，表明父本可能产生 了未减数配子；PG6号植株为疑似超过二倍体的非整倍体，其I号染色体树为两条， 表明I号染色体并非超数染色体；PG7号植株为超过二倍体的非整倍体，其I号染 色体数为三条，是其中1条超数染色体；PG8号植株为疑似二倍体，其I号染色体 数为两条。
实施例2
1、初步检测杂交子代植株的倍性水平
与实施例1相同。
2、提取父本、母本、杂交子代的DNA
与实施例1相同。
3、引物筛选
基于设定的标记要求，通过筛选，选择标记位点的物理位置靠近着丝粒，父母 本有差异且呈共显性分离分子标记引物，位于杨树VIII号染色体上的引物 PMGC-2607(见表3)进行实例分析，来源于国际杨树基因组协会数据库 (http://web.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm)。
4、PCR扩增及毛细管荧光电泳分析
4-1、采用PMGC-2607引物对杂交亲本的DNA进行PCR扩增以及对扩增后的 产物进行毛细管荧光电泳，其中，PCR反应程序与毛细管荧光电泳与实施例1中的 步骤4-1)相同，分析杂交双亲植株的基因型，结果如图3的C1-2所示：
利用引物PMGC-2607扩增的母本‘毛新杨’DNA，在149bp及167bp处有2 个峰谱，命名为BD型；扩增父本‘银中杨’DNA，在143bp、163bp处有2个峰值， 结合‘银中杨’为三倍体，应具有3个等位基因进行综合分析，认为143bp峰谱含 有2份等位基因，因此命名为AAC型。峰谱所在位置代表该引物扩增片段的大小， 峰的高低则代表该片段相对荧光强度，即相对DNA含量；
图C1为母本二倍体‘毛新杨’的毛细管荧光电泳结果图，在149bp及167bp 处有2个峰谱，分别定义为等位基因B和D，故母本基因型为BD；由于母本‘毛 新杨’为二倍体，其减数分裂正常，形成单倍性配子，杂交后为子代提供1份等位 基因，即将为子代提供171bp或174bp峰谱中的1份。
图C2为父本三倍体‘银中杨’的毛细管荧光电泳结果图，在143bp和163bp 处有2个峰值，分别定义为等位基因A和C，结合‘银中杨’为三倍体，应具有3 个等位基因进行综合分析，认为143bp峰谱含有2份等位基因，定义父本基因型为 AAC。
4-2、采用PMGC-2607引物对杂交子代植株的DNA进行PCR扩增以及对扩增 后的产物进行毛细管荧光电泳，其中，PCR反应程序与毛细管荧光电泳与实施例1 中的步骤4-1)相同，分析确定每株植株的基因型，测定结果如图3的C3-10所示：
图C3-C10分别为8株不同杂交子代植株(PG1-8号子代植株)的基因型，依 次为AAD、AABC、AACD、AAAAB、AACD、B、D、BC。
图C3为杂交子代PG1的毛细管荧光电泳结果图，在143bp及167bp处有2个 峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份167bp峰谱(1份等位 基因D)，父本提供了2份143bp峰谱(2份等位基因A)，因此可确定PG1的基因 型为AAD；
图C4为杂交子代PG2的毛细管荧光电泳结果图，在143bp、149bp及163bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份149bp峰谱(1 份等位基因B)，父本提供了2份143bp峰谱(2份等位基因A)和1份163bp峰谱 (1份等位基因C)，因此可确定PG2的基因型为AABC；
图C5为杂交子代PG3的毛细管荧光电泳结果图，在143bp、163bp及167bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份167bp峰谱(1 份等位基因D)，父本提供了2份143bp峰谱(2份等位基因A)和1份163bp峰谱 (1份等位基因C)，因此可确定PG3的基因型为AACD；
图C6为杂交子代PG4的毛细管荧光电泳结果图，在143bp及149bp处有2个 峰谱，其中143bp峰高约为149bp峰高的2倍，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可 知母本提供了1份149bp峰谱(1份等位基因B)，父本提供了4份143bp峰谱(4 份等位基因A)，因此可确定PG4的基因型为AAAAB；
图C7为杂交子代PG5的毛细管荧光电泳结果图，在143bp、163bp及167bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份167bp峰谱(1 份等位基因D)，父本提供了2份143bp峰谱(2份等位基因A)和1份163bp峰谱 (1份等位基因C)，因此可确定PG5的基因型为AACD；
图C8为杂交子代PG6的毛细管荧光电泳结果图，仅在149bp处有1个峰谱， 与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知该峰谱由母本提供(1份等位基因B)，而父本 没有提供等位基因，因此可确定PG6的基因型为B；
图C9为杂交子代PG7的毛细管荧光电泳结果图，在167bp处有1个峰谱，与 父母本双亲峰谱及峰高比较，可知该峰谱由母本提供(1份等位基因D)，而父本没 有提供等位基因，因此可确定PG7的基因型为D；
图C10为杂交子代PG8的毛细管荧光电泳结果图，在149bp及163bp处有2 个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份149bp峰谱(1份等 位基因B)，父本提供了1份163bp峰谱(1份等位基因C)，因此可确定PG8的基 因型为BC。
5、检测结果分析
结合流式细胞术的杂交子代植株倍性水平的初步检测结果，推断杂交子代植株 的倍性，结果如表2，其中：
杂交子代PG1号植株为疑似三倍体，其VIII号染色体数为三条，符合预期； PG2号植株为超过三倍体的疑似非整倍体，其VIII号染色体数为四条，表明VIII 号染色体是其中的1条超数染色体；PG3号植株为疑似四倍体，其VIII号染色体数 为四条，符合预期；PG4号植株为超过四倍体的疑似非整倍体，其VIII号染色体数 为五条，表明VIII号染色体是其中的1条超数染色体；PG5号植株为疑似四倍体， 其VIII号染色体数为四条，符合预期；PG6号植株为疑似超过二倍体的非整倍体， 其VIII号染色体树可能为1条，低于预期，可能是由于该引物位点上发生了缺失或 者发生了染色体的缺失；PG7号植株为超过二倍体的非整倍体，其VIII号染色体数 可能为1条，低于预期，可能是由于该引物位点上发生了缺失或者发生了染色体的 缺失；PG8号植株为疑似二倍体，其VIII号染色体数为两条，符合预期。
实施例3
1、初步检测杂交子代植株的倍性水平
与实施例1相同。
2、提取父本、母本、杂交子代的DNA
与实施例1相同。
3、引物筛选
基于设定的标记要求，通过筛选，选择标记位点的物理位置靠近着丝粒，父母 本有差异且呈共显性分离分子标记引物，位于杨树X号染色体上的引物LG-10-1788 (见表3)进行实例分析，来源于Yin等(2009)的报道。
表3适用于‘毛新杨’ב银中杨’子代VIII号、X号染色体数目鉴定的SSR引物
4、PCR扩增及毛细管荧光电泳分析
4-1、采用LG-10-1788引物对杂交亲本的DNA进行PCR扩增以及对扩增后的 产物进行毛细管荧光电泳，其中，PCR反应程序与毛细管荧光电泳与实施例1中的 步骤4-1)相同，分析杂交双亲植株的基因型，结果如图4的D1-2所示：
利用引物LG-10-1788扩增的母本‘毛新杨’DNA，在204bp及214bp处有2 个峰谱，命名为EG型；扩增父本‘银中杨’DNA，在200bp及210bp处有2个峰 值，其中210bp的峰高约为200bp峰高的二倍，命名为DFF型；峰谱所在位置代表 该引物扩增片段的大小，峰的高低则代表该片段相对荧光强度，即相对DNA含量；
图D1为母本二倍体‘毛新杨’的毛细管荧光电泳结果图，在204bp及214bp 处有2个峰谱，分别定义为等位基因E和G，故母本基因型为EG；由于母本‘毛 新杨’为二倍体，其减数分裂正常，形成单倍性配子，杂交后为子代提供1份等位 基因，即将为子代提供204bp或214bp峰谱中的1份。
图D2为父本三倍体‘银中杨’的毛细管荧光电泳结果图，在200bp及210bp 处有2个峰值，分别定义为等位基因D和F，其中210bp的峰高为200bp峰高的约 二倍，结合‘银中杨’为三倍体，应具有3个等位基因进行综合分析，故父本基因 型为DFF。
4-2、采用LG-10-1788引物对杂交子代植株的DNA进行PCR扩增以及对扩增 后的产物进行毛细管荧光电泳，其中，PCR反应程序与毛细管荧光电泳与实施例1 中的步骤4-1)相同，分析确定每株植株的基因型，测定结果如图4的D3-10所示：
图D3-D10分别为8株不同杂交子代植株(PG1-8号子代植株)的基因型，依 次为DEF、FFG、DEFF、DEF、DFFG、DG、DFG、FG。
图D3为杂交子代PG1的毛细管荧光电泳结果图，在200bp、204bp及210bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份204bp峰谱(1 份等位基因E)，父本提供了200bp峰谱(等位基因D)和210bp峰谱(等位基因F) 各1份，因此可确定PG1的基因型为DEF；
图D4为杂交子代PG2的毛细管荧光电泳结果图，在210bp及214bp处有2个 峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份214bp峰谱(1份等位 基因G)，父本提供了2份210bp峰谱(2份等位基因F)，因此可确定PG2的基因 型为FFG；
图D5为杂交子代PG3的毛细管荧光电泳结果图，在200bp、204bp及210bp 处有3个峰谱，其中210bp峰高均约为其他两个峰高的2倍，与父母本双亲峰谱及 峰高比较，可知母本提供了1份204bp峰谱(1份等位基因E)，父本提供了1份200bp 峰谱(1份等位基因D)和2份210bp峰谱(2份等位基因F)，因此可确定PG3的 基因型为DEFF；
图D6为杂交子代PG4的毛细管荧光电泳结果图，在200bp、204bp及210bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份204bp峰谱(1 份等位基因E)，父本提供了200bp峰谱(等位基因D)和210bp峰谱(等位基因F) 个1份，因此可确定PG4的基因型为DEF；
图D7为杂交子代PG5的毛细管荧光电泳结果图，在200bp、210bp及214bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份214bp峰谱(1 份等位基因G)，父本提供了1份200bp峰谱(1份等位基因D)和2份210bp峰谱 (2份等位基因F)，因此可确定PG5的基因型为DFFG；
图D8为杂交子代PG6的毛细管荧光电泳结果图，在200bp及214bp处有2个 峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份214bp峰谱(1份等位 基因G)，父本提供了1份200bp峰谱(1份等位基因D)，因此可确定PG6的基因 型为DG；
图D9为杂交子代PG7的毛细管荧光电泳结果图，在200bp、210bp及214bp 处有3个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份214bp峰谱(1 份等位基因G)，父本提供了200bp峰谱(等位基因D)和210bp峰谱(等位基因F’) 各1份，因此可确定PG7的基因型为DFG；
图D10为杂交子代PG8的毛细管荧光电泳结果图，在210bp及214bp处有2 个峰谱，与父母本双亲峰谱及峰高比较，可知母本提供了1份214bp峰谱(1份等 位基因G，父本提供了1份210bp峰谱(1份等位基因F)，因此可确定PG8的基因 型为FG。
5、检测结果分析
结合流式细胞术的杂交子代植株倍性水平的初步检测结果，推断杂交子代植株 的倍性，结果如表2，其中：
杂交子代PG1号植株为疑似三倍体，其X号染色体数为三条，符合预期；PG2 号植株为超过三倍体的疑似非整倍体，其X号染色体数为三条，表明超数染色体可 能为其他染色体，通过利用位于其他染色体上的标记引物可进一步明确其染色体构 成；PG3号植株为疑似四倍体，其X号染色体数为四条，符合预期；PG4号植株为 超过四倍体的疑似非整倍体，其X号染色体数可能为三条，表明该染色体可能发生 了缺失或者该引物位点发生了缺失；PG5号植株为疑似四倍体，其X号染色体数为 四条，符合预期；PG6号植株为疑似超过二倍体的非整倍体，其X号染色体树为2 条，表明超数染色体可能为其他染色体，通过利用位于其他染色体上的标记引物可 进一步明确其染色体构成；PG7号植株为超过二倍体的非整倍体，其X号染色体数 为3条，该染色体是其中1条超数染色体；PG8号植株为疑似二倍体，其X号染色 体数为两条，符合预期。
表2 I号、VIII号和X号染色体上引物毛细管电泳检测结果
综上，我们可以推断各子代植株I、VIII和X号染色体的组成情况(表4)。其 中，PG1为疑似三倍体，其I、VIII和X号染色体数均为3条；PG2为超过三倍体 的疑似非整倍体，其I和X号染色体数为3条，VIII号染色体为4条；PG3为疑似 四倍体，其I、VIII和X号染色体数均为4条；PG4为超过四倍体的疑似非整倍体， 其I号染色体为4条，VIII号染色体为5条，X号染色体数可能为3条；PG5为疑 似四倍体，其I、VIII和X号染色体数均为4条；PG6为疑似超过二倍体的非整倍 体，其I和X号染色体树均为2条，VIII号染色体可能为1条；PG7为超过二倍体 的非整倍体，其I和X号染色体数均为3条，VIII号染色体可能为1条；PG8为疑 似二倍体，其I、VIII和X号染色体数均为2条。
表4待测子代的I、VIII和X染色体组成情况表