杂交瘤细胞表达基因工程尿激酶原的制备方法 技术领域
本发明涉及基因工程尿激酶原的制备方法，特别是涉及使用杂交瘤细胞表达尿激酶原的工业化大规模生产的方法。
背景技术
尿激酶原，也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂，是尿激酶的前体，其对被纤维蛋白吸附的纤溶酶原的亲和力显著高于对游离的纤溶酶原的亲和力，作用位置主要位于血栓形成区域，因而具有较高的特异性溶血栓作用，可作为溶解血栓的药物，在安全性上较目前广泛使用的尿激酶和链激酶有显著进步。中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、草地贪夜蛾卵巢细胞(sf9昆虫细胞)等真核表达系统现已应用于尿激酶原的制备。与上述表达系统相比，杂交瘤细胞作为一种骨髓瘤细胞-肾细胞杂合真核细胞株，同时具有了表达量高和表达蛋白接近天然构象的特点，更适合用于尿激酶原的表达。但现有的使用杂交瘤细胞表达尿激酶原的技术，如钱锋等在SP2/0细胞内表达尿激酶原的技术(钱锋等，生物工程学报，2000，16(3)：349-352)，一方面均采用在培养基中添加小牛血清至0.5％-5％终浓度的低血清灌注培养，存在使尿激酶原转化为尿激酶这一缺点，另一方面由于培养条件等原因，表达水平只达到50IU/106细胞天，无法满足大规模生产的需要。
发明内容
为了解决杂交瘤细胞表达基因工程尿激酶原制备过程中有血清培养导致尿激酶原转化为尿激酶和无血清培养细胞存活率和表达量低的问题，本发明提供一种用杂交瘤细胞制备尿激酶原的工业化生产方法，该方法包括：将包含尿激酶原cDNA序列地质粒转染杂交瘤细胞和筛选高表达尿激酶原的杂交瘤细胞工程细胞株；培养尿激酶原工程细胞株；和工程细胞株培养上清的纯化，其中所述培养尿激酶原工程细胞株是将尿激酶原工程细胞株先用有血清培养至足够量后，转入生物反应器内，接种细胞密度2-4×105个/毫升，并降低胎牛血清浓度至原胎牛血清浓度的5～15％继续培养，待细胞密度上升到2-2.5×106个/毫升后开始无血清灌注培养，通过调节灌注量来始终确保细胞密度不低于1×106个/毫升，并收集培养上清。本发明采用了上述有血清、低血清和无血清灌注培养三个连续的培养阶段，所收集的培养上清含尿激酶原工程细胞株在无血清培养阶段下的表达产物，从而在很大程度上避免了尿激酶原转化为尿激酶，减少了后续分离尿激酶的分离成本。
此外，本发明还在前述的制备尿激酶原的方法的基础上，提供了一种直接利用前述方法中经过有血清、低血清和无血清灌注培养三个阶段的培养后得到的尿激酶原工程细胞株进行尿激酶原的制备方法，包括：将前述方法中经有血清、低血清和无血清灌注培养后制得的尿激酶原工程细胞株冻存，使用时先用有血清培养基复苏，随后用无血清培养基扩大培养至足够细胞量后，转入生物反应器，接种细胞密度2-4×105个/毫升，并继续采用无血清培养基培养，当细胞密度上升到2-2.5×106个/毫升后，开始用无血清培养基灌注，通过调节灌注量来始终确保细胞密度不低于1×106个/毫升；和工程细胞株培养上清的纯化。
由于本发明在上述制备方法中采用了更优化的尿激酶原细胞株连续培养工艺，使得尿激酶原得到高效表达，在生物反应器内培养上清中的含量达到1.5万IU/ml，表达水平2000IU/106细胞.天，显著优于钱锋等获得的50IU/106细胞.天表达水平。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方式，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明的范围。
图1为本发明构建包含尿激酶原cDNA序列的质粒的pBKH质粒图谱。
图2为本发明实施例4中尿激酶原日产量-连续培养天数曲线。
图3为本发明实施例4中逐日收集的培养上清SDS-PAGE电泳图谱。
图4为本发明获得的尿激酶原纯品SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施方式
以下将结合说明书附图，对本发明提供的杂交瘤细胞表达基因工程尿激酶原的制备方法做详细描述。
本发明的制备方法流程为(1)构建含尿激酶原cDNA序列的中间质粒；(2)电穿孔法转染杂交瘤细胞得到工程细胞；(3)MTX加压扩增获得高表达的工程细胞株；(4)将尿激酶原工程细胞株用有血清培养基培养后经低血清培养过度，转入无血清灌注培养；(5)从培养上清中纯化制得尿激酶原纯品。
本发明特定实施方案中所用的杂交瘤细胞株为Sp2/0-Ag14，保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号CRL-1581。该细胞株由BALB/c小鼠的脾细胞和P3X63Ag8骨髓瘤细胞融合而成，可悬浮培养，不分泌免疫球蛋白，本领域技术人员主要用其制备单克隆抗体，而本发明利用其对外源蛋白表达效率高、易于大规模悬浮培养的特点制备尿激酶原。本领域技术人员亦可采用FO细胞株(ATCC保藏编号CRL-1646)或其他类似的杂交瘤细胞株。
本发明所用尿激酶原cDNA序列从人前列腺癌细胞株PC3中经RT-PCR获取。该前列腺癌细胞株保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号CRL-1435。当然也可以从其他细胞株中获取尿激酶原cDNA序列，如Hep-3类表皮癌细胞(中国专利CN 1042181A)。RT-PCR可采用Promega、Roche等公司的逆转录PCR试剂盒，反应条件参考试剂盒使用说明。
本发明优选的中间质粒pBKH如图1所示，1为金属硫蛋白启动子，2为SV40启动子/增强子，3为二氢叶酸还原酶基因片段，4为SV40polyA序列，5为polyA序列，6为含细菌复制起点和β-lactanmase基因的pBR322质粒片段构成。其中SV40启动子/增强子负责启动二氢叶酸还原酶基因片段的转录和表达，用于MTX加压扩增和细胞株的筛选。β-lactanmase基因片段内含氨苄青霉素抗性基因，用于质粒的筛选。金属硫蛋白启动子和ployA之间可插入尿激酶原cDNA序列，由金属硫蛋白启动子控制其表达。本领域技术人员已从鳟鱼、牛、啮齿类动物等分离获得金属硫蛋白启动子，其具有高表达效率和对金属离子的亲合力，曾用于含金属废水的处理，在本发明中作为表达尿激酶原的启动子，并推荐啮齿类动物(小鼠)源的启动子序列。上述基因片段序列均在Genbank中公开，本领域技术人员可根据Genbank中序列合成得到，亦可根据表达细胞系密码子偏爱性进一步加以修饰。有关中间质粒的操作，如用T4连接酶连接嵌入尿激酶原cDNA片段、涂布含氨苄青霉素的LB培养基平板、挑选平板上长出的克隆、微量碱法抽提质粒、电穿孔法转染细胞等，均按Sambrook等著的《分子克隆实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)所述进行。
转染后的细胞用DMEM培养基培养，用溶圈法或S2444法测定培养上清中尿激酶原活性，测试操作参照Runge所述(Runge M.S，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，84：7659-7662)。选择上清中尿激酶原活性高的细胞株。用DMEM培养基培养，逐渐增加MTX浓度，选择在4000-5000nM MTX下仍正常生长的细胞株，即为工程细胞株，置液氮罐保存。
本发明通过对细胞生长状况的观察，认定细胞对无血清培养基的适应能力，首先与细胞密度的高低密切相关。在高细胞密度下，细胞能较快适应无血清培养环境，并维持对尿激酶原的高效表达。在低细胞密度下，细胞较为脆弱，无法在无血清环境下持续生长。只有在特定时段进行低血清-无血清培养基置换，才能实现长时间无血清连续灌注培养。其次与血清含量递减速度有关。将在有血清条件下培养的细胞直接转入全无血清环境中，细胞的存活率将显著下降，而通过有血清-低血清-无血清的逐步转换过程，对细胞的生长无显著影响。其中有血清培养一般在细胞复苏后在细胞培养瓶内进行，低血清培养和无血清培养一般在生物反应器内进行，以满足工业化大批量生产的需要。所用的培养基可从GIBCO、HyClone等公司购得。典型的操作是将工程细胞株从液氮罐取出后，在细胞培养瓶内用添加8-15％胎牛血清的RPMI-1640培养基或添加0.8-1.5％胎牛血清的HSFM培养基逐级扩大培养，随后转入无泡通气结构的生物反应器，细胞接种密度2-4×105个/毫升，控制温度37℃，溶氧45-55％，搅拌转速60-110rpm，换用添加0.8-1.2％胎牛血清的RPMI-1640培养基或添加0.1-0.3％胎牛血清的HSFM培养基低血清培养。当细胞密度上升到2-2.5×106个/毫升后，开始用不添加胎牛血清的HSFM培养基灌注培养，并添加抑肽酶，通过调节灌注量，始终确保细胞密度不低于1×106个/毫升。收集培养上清，过滤，除去细胞碎片置2-8℃环境中保存。
由于经上述培养过程后的细胞株已能适应无血清环境，并能保持这种特性。将已能适应无血清环境的细胞株置液氮冻存，可作为后续培养时的种子细胞株使用。此时无须再通过有血清-低血清-无血清的逐步转换过程，而可以直接将经上述培养过程后冻存的尿激酶原工程细胞株经有血清培养基复苏后，在细胞培养瓶内无血清培养至一定量后，转入生物反应器内，并进一步用无血清培养基增高细胞密度，即可进行无血清灌注培养。这明显地将提高了生产效率。典型的操作是将经过有血清-低血清-无血清灌注培养三个逐步转换过程培养的工程细胞株按常规操作置液氮中冻存。使用时从液氮罐取出，用添加0.8-1.5％胎牛血清的HSFM培养基复苏，随后在细胞培养瓶内用未添加胎牛血清的HSFM培养基进行无血清扩大培养至足够量后，转入无泡通气结构的生物反应器，接种细胞密度2-4×105个/毫升，控制pH为7.20±0.10，搅拌速度70rpm，温度为37℃，溶氧为45％-75％，继续用HSFM培养基培养。等到反应器细胞密度达到2×106个/毫升后，开始用HSFM培养基进行灌注培养，通过调节灌注量，始终确保细胞密度不低于1×106个/毫升。收集培养上清，过滤，除去细胞碎片，置2-8℃保存。
由于杂交瘤细胞无细胞壁，对剪切力敏感，所以推荐使用采用无泡通气系统的生物反应器。在本发明实施例中使用的是B.Braun公司的Spin Impeller悬浮培养生物反应器。本领域有经验的技术人员亦可从其他公司获得类似的生物反应器。基于现有的经验，在2.5L-14L生物反应器规模上，连续培养时间约1-2个月，尿激酶原表达量超过2000国际单位/106个细胞.天。
由于尿激酶原极易转化为尿激酶，所以细胞表达上清的纯化一方面要去除培养基和细胞正常代谢产物，另一方面要去除尿激酶。对于本发明的上清纯化方法，可以使用已有的公开技术，如Xue Y等提供的由Zn2+选择性沉淀、免疫亲合层析、苯甲脒亲合层析组成的三步纯化流程(Xue Y，et al，Chin J Biotechnol，1997；13(4)：233-238)，或张正光等描述的由CM-径向离子交换、微孔玻璃吸附、S-200凝胶色谱、对氨基苯甲脒亲合色谱组成的四步纯化方案(CN1164536A)等。本发明优选下述的三步纯化工艺，首先采用强阳离子交换填料捕获培养上清中的尿激酶原，并去除内毒素和主要杂蛋白，随后用苯甲脒亲合填料去除尿激酶，最后用分子筛填料精制。在特定实施方案中，将工程细胞培养上清用冰醋酸调pH至4.8后，上样于SP Sepharose FF层析柱，1M醋酸钠溶液线性梯度洗脱，收集主峰，调pH至7.5后，上样于Benzamidine Sepharose 4FF层析柱，用pH7.5的磷酸缓冲液平衡柱床，收集穿过峰。将穿过峰上样于Superdex 75 prep grade层析柱，上样量3毫升样品/100毫升填料，收集主峰，置-20℃保存。此即纯品尿激酶原。上述三种填料均购自Amersham Biosciences公司。本领域技术人员亦可从Bio-Rad、BioSepare、Applied Biosystems等公司获得类似的填料代替。
下面使用具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
【实施例1】中间质粒pKHB的构建
在含氨苄青霉素的LB培养基内培养带有pBR322质粒的大肠杆菌(质粒购自Promega公司)，碱裂解法抽提质粒，酶切后琼脂糖电泳回收细菌复制起点和β-lactanmase基因片段，T4连接酶接入pRL-SV40质粒(Promega公司)SV40polyA下游，代替pRL-SV40质粒原有的pUC来源的细菌复制起点和β-lactanmase基因片段，得到质粒pBR-SV40。将二氢叶酸还原酶基因片段(来源于小鼠)插入pBR-SV40质粒SV40启动子和SV40polyA之间，代替原有Rluc基因片段，并用T4连接酶连接，得到质粒pBR-SV-dhfr。用大肠杆菌按常规操作扩增质粒，抽提后在细菌复制起点和SV40启动子之间插入金属硫蛋白启动子及polyA序列(来自小鼠)，T4连接酶连接，得到中间质粒pKHB。
【实施例2】Sp2/0-Ag14-proUK细胞株的获得
在细胞培养瓶内培养PC3细胞至5×106个，用PBS缓冲液洗涤一次后，用RNAgentsTotal RNA Isolation System(Promega公司)抽提RNA。将所获得的RNA溶解于水中，终浓度0.4微克/微升。用Access RT-PCR System(Promega公司)逆转录扩增尿激酶原cDNA片段。反应混合物经48℃45分钟逆转录和94℃2分钟灭活后，经25次循环扩增(每循环94℃1分钟、65℃1分钟、72℃1.5分钟)，接72℃延长7分钟。扩增产物走1％琼脂糖电泳，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收1.4kbp大小的扩增片段。pBKH质粒酶切线性化后，在金属硫蛋白启动子下游用T4连接酶嵌入所回收的尿激酶原cDNA片段，涂布含氨苄青霉素的LB培养基平板。挑选长出的阳性克隆，微量碱法抽提质粒，与Sp2/0-Ag14细胞混合后，电穿孔法转化。转化后的细胞先用DMEM培养基培养，24小时后改用含100nMMTX的DMEM培养基培养，一周后在显微镜下将生长的克隆转移至24孔板中继续培养，用溶圈法测定培养上清中尿激酶原活性。选择表达尿激酶原的细胞株，先在含100nM MTX的DMEM培养基培养，每隔5天增加一次MTX浓度，经200nM、500nM、800nM、1000nM、2000nM，直至5000nM。选择在5000nM MTX下仍正常生长的细胞株，即为Sp2/0-Ag14-proUK工程细胞株，置液氮罐保存。
【实施例3】Sp2/0-Ag14-proUK细胞株的培养与尿激酶原制备
将Sp2/0-Ag14-proUK工程细胞株从液氮罐取出后，在细胞培养瓶内用添加10％胎牛血清的RPMI-1640培养基逐级扩大培养后，转入5L悬浮培养生物反应器(B.Braun公司)，控制温度37℃，溶氧50％，搅拌转速80rpm。接种细胞密度控制在3×105个/毫升，并换用添加0.8％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。当细胞密度上升到2×106个/毫升后，开始用不添加胎牛血清的HSFM培养基灌注培养，并添加抑肽酶，通过调节灌注量，始终确保细胞密度不低于1×106个/毫升，可连续培养30天以上。当不添加胎牛血清的HSFM培养基灌注超过2个罐体积后，开始收集培养上清，过滤，除去细胞碎片，置4℃环境中保存。用溶圈法测定，培养上清中尿激酶原含量达到1.5万IU/ml，表达水平2000IU/106细胞.天。
将Sp2/0-Ag14-proUK工程细胞培养上清用冰醋酸调pH至4.8后，上样于SP Sepharose FF层析柱，1M醋酸钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱下的尿激酶原，调pH至7.5后，上样于Benzamidine Sepharose 4FF层析柱，用pH7.5的磷酸缓冲液平衡柱床，收集穿过峰。将穿过峰上样于Superdex 75 prep grade层析柱，上样量3毫升样品/100毫升填料，收集主峰，置-20℃保存。此即纯品尿激酶原。按《中国生物制品规程(2000年版)》规定操作，非还原SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，上样量10微克，纯度大于95％。溶圈法测定比活，比活达到12万IU/mg以上。
【实施例4】适应无血清培养的Sp2/0-Ag14-proUK细胞株的保存、培养与尿激酶原制备
将在实施例3中经有血清-低血清-无血清三个阶段培养、已能适应无血清培养条件的细胞株于细胞培养瓶内，用HSFM无血清培养基培养传代后，收集细胞，用添加5％胎牛血清、10％二甲基亚砜的HSFM培养基重悬，分装于NUNC公司细胞冻存管中，置液氮中冻存，标明“Sp2/0-Ag14-proUK工程细胞株(适应无血清)”。
将Sp2/0-Ag14-proUK工程细胞株(适应无血清)从液氮罐取出后，用添加1％胎牛血清的HSFM培养基复苏，随后在细胞培养瓶内用HSFM无血清培养基逐级扩大培养至足够量后，接种5升Spin Impeller悬浮培养生物反应器(B.Braun公司)，细胞接种密度3×105个/ml，继续用HSFM无血清培养基培养，并加抑肽酶，控制pH为7.20±0.10，搅拌速度70rpm，温度为37℃，溶氧为45％-75％。细胞密度达到2×106个/ml后，开始用HSFM无血清培养基灌注，通过调节灌注量，始终确保细胞密度不低于1×106个/毫升，收集培养上清，过滤除去细胞碎片，置4℃保存。整个表达过程可连续1.5～2个月左右，每日表达曲线见图2，培养上清电泳结果见图3 SDS-PAGE电泳图谱，上清表达水平平均为1.5万IU/ml，其中左起第1条带是分子量标准(中科院上海生化所，低分子量标准品)；左起第2、3、4、5、6、7条带依次为全无血清培养后第5、7、11、14、30、41天时的培养上清。
将Sp2/0-Ag14-proUK工程细胞(适应无血清)培养上清用冰醋酸调pH至4.8后，上样于SP Sepharose FF层析柱，1M醋酸钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱下的尿激酶原，调pH值至7.5，上样于Benzamidine Sepharose 4FF层析柱，用pH7.5的磷酸缓冲液平衡柱床，收集穿过峰。将穿过峰上样于并上样于Superdex 75 prep grade层析柱，上样量3毫升样品/100毫升填料，线性流速20-30厘米/小时，收集主峰，置-20℃保存。此即纯品尿激酶原。按《中国生物制品规程(2000年版)》规定操作，非还原SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，上样量10微克，纯度大于95％，其SDS-PAGE电泳图谱如图4所示，其中左起第1条带是分子量标准(中科院上海生化所，低分子量标准品)，左起第2条带是纯化后获得的尿激酶原。溶圈法测定比活，比活达到12万IU/mg以上。