说明书荸荠皮提取6,8-二甲基木犀草素的方法
技术领域
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种6,8-二甲基木犀草素的分离纯化方 法，特别是涉及一种从荸荠皮中提取分离6,8-二甲基木犀草素的方法。
背景技术
6,8-二甲基木犀草素(6,8-dimethylluteolin)，黄色晶体，化学名为6,8-二甲基 -5,7,3′,4′-四羟基黄酮，为木犀草素的C-甲基化衍生物。该类衍生物具有多种药理 活性，如抗氧化、抗菌、抗肿瘤等。6,8-二甲基木犀草素结构独特，自然界分布 少，相关文献很少，没有发现从天然植物中提取分离6,8-二甲基木犀草素的技术 介绍。荸荠(Eleocharis tuberosa)，又称马蹄，属莎草科多年生浅水草本植物荸荠 的地下球茎，我国大部分地区都有栽培。其中，广西荸荠产量占全国70％，贺州 荸荠产量占广西70％。据文献报道，荸荠有抗菌、抗肿瘤、防治呼吸道疾病、利 肠通便和利尿排淋等作用；临床上可用于治疗咽喉疼痛、痰热咳嗽、热病烦渴、 小便不利、痢疾等症。研究表明，荸荠的活性物质主要富集在果皮和果肉之间。 在荸荠加工过程中，被丢弃的荸荠皮质量约占新鲜荸荠质量的25％，资源非常丰 富。我们在研究中发现荸荠皮中含有6,8-二甲基木犀草素，但目前未见从荸荠皮 中提取分离该化合物的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于：提出一种荸荠皮提取6,8-二甲基木犀草素的方法。
6,8-二甲基木犀草素,其化学结构式如下：
本发明的荸荠皮提取6,8-二甲基木犀草素的方法，应用常规提取法和色谱 技术从荸荠皮中提取分离6,8-二甲基木犀草素，具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用；以重量计，称取荸荠皮粉末1份， 加入提取罐中，每次加入4-10份70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸 泡24h，浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物；
(2)以重量计，将提取物1份分散在5份水中制成悬浊液，用1-2倍水体 积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物；
(3)往萃取物中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍萃取物质量的聚酰胺拌样， 将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，以40-100％体积百分比的 甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％ 体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A；
(4)往粗品A中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍质量的聚酰胺拌样，将甲 醇挥发至干，转入聚酰胺色谱柱进行分离，用体积比为3:1-1:1的氯仿-甲醇溶液 洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有6,8-二甲基木犀草素的洗脱液，减压浓缩， 获得粗品B；
(5)以重量计，将粗品B1份溶于4-8份甲醇中，加入等甲醇体积的水制成 悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测， 收集合并含有6,8-二甲基木犀草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C；
(6)将所得粗品C经甲醇或乙醇重结晶纯化，干燥，获得含量达95％以上 的6,8-二甲基木犀草素产品。
所述步骤(3)中的所述的MCI柱规格为70×460mm，填充材料为MCI-gel CHP-20P，柱色谱条件为：柱压为80Psi，流动相流速为50mL/min，检测波长 为245nm；所述的流动相为40-100％体积百分比的甲醇水溶液。
所述步骤(4)中所述的聚酰胺规格为200-300目；所用洗脱液为体积比为 3:1-1:1的氯仿-甲醇溶液。
本发明与现有技术相比其有益效果是：设计科学合理，开辟了从天然植物中 提取分离6,8-二甲基木犀草素的新途径，分离效果好，产品纯度高，使一贯被视 为废弃物的荸荠皮变废为宝，所选用的层析材料MCI、聚酰胺和凝胶均可反复 使用，原料易得，资源丰富，生产成本低，可进行规模化生产，满足医药工业需 要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的荸荠皮提取6,8-二甲基木犀草素的方法，应用常规提取法和色谱 技术从荸荠皮中提取分离6,8-二甲基木犀草素，具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用。称取一定质量(g)的荸荠皮粉末 加入提取罐中，再加入4-10倍体积(mL)的70％体积百分比的丙酮水溶液，在 25℃下浸泡24h，浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物。
(2)将提取物(g)分散在5倍体积(mL)的水中制成悬浊液，用1-2倍水 体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物。
(3)往萃取物中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍萃取物质量的聚酰胺拌样， 将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，柱规格为70mm×460mm， 填充材料为日本三菱化学公司生产的MCI-gel CHP-20P，柱色谱条件为：柱压为 80Psi，流动相流速为50mL/min，检测波长为254nm，以40-100％体积百分比 的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，根据检测峰变化情况调节洗脱液浓度，按每份 500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗 脱液，减压浓缩，获得粗品A。
(4)往粗品A中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍质量的聚酰胺拌样，将甲 醇挥发至干，转入聚酰胺色谱柱进行分离，用体积比为3:1-1:1的氯仿-甲醇溶液 洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有6,8-二甲基木犀草素的洗脱液，减压浓缩， 获得粗品B。
(5)将粗品B(g)溶于4-8倍体积(mL)的甲醇中，加入等甲醇体积的水 制成悬浊液，用瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司生产的Sephadex LH-20 凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有6,8-二甲基木犀 草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C。
(6)将所得粗品C经甲醇或乙醇重结晶纯化，干燥，获得含量达95％以上 的6,8-二甲基木犀草素产品。
实施例1
将8kg新鲜荸荠皮粉末加入在提取罐中，加入32L 70％体积百分比的丙酮 水溶液，在25℃下浸泡24h，共浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩膏状， 获得提取物1.05kg。
将提取物加入5.0L水中制成浑浊液，用5.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取 液，减压浓缩，获得萃取物120g。
往萃取物中加入300mL甲醇溶解，用260g聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干， 装柱，连接MCI柱进行中压分离，用40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动 相梯度洗脱，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为 70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A 31g。
将粗品A溶于90mL甲醇中，加入60g聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入 聚酰胺柱进行分离，用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测， 收集合并含有6,8-二甲基木犀草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B 4.3g。
将粗品B溶于18mL的甲醇中，加入18mL水制成悬浊液，用Sephadex LH-20 凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有6,8-二甲基木犀 草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C 130mg。
将所得粗品C经甲醇重结晶纯化，干燥，获得含量95.4％的6,8-二甲基木犀 草素产品10mg。
实施例2
将8kg新鲜荸荠皮粉末加入在提取罐中，加入32L 70％体积百分比的丙酮 水溶液，在25℃下浸泡24h，共浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩膏状， 获得提取物1.05kg。
将提取物加入5.0L水中制成浑浊液，用5.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取 液，减压浓缩，获得萃取物120g。
往萃取物中加入300mL甲醇溶解，用260g聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干， 装柱，连接MCI柱进行中压分离，用40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动 相梯度洗脱，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为 70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A 31g。
将粗品A溶于90mL甲醇中，加入60g聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入 聚酰胺柱进行分离，用体积比为2.5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测， 收集合并含有6,8-二甲基木犀草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B 1.1g。
将粗品B溶于6.0mL的甲醇中，加入6.0mL水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有6,8-二甲 基木犀草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C 53mg。
将所得粗品C经乙醇重结晶纯化，干燥，获得含量97.5％的6,8-二甲基木犀 草素产品7mg。
实施例3
将8kg新鲜荸荠皮粉末加入在提取罐中，加入32L 70％体积百分比的丙酮 水溶液，在25℃下浸泡24h，共浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩膏状， 获得提取物1.05kg。
将提取物加入5.0L水中制成浑浊液，用5.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取 液，减压浓缩，获得萃取物120g。
往萃取物中加入300mL甲醇溶解，用260g聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干， 装柱，连接MCI柱进行中压分离，用40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动 相梯度洗脱，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为 70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A 31g。
将粗品A溶于90mL甲醇中，加入60g聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入 聚酰胺柱进行分离，用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测， 收集合并含有6,8-二甲基木犀草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B 3.4g。
将粗品B溶于15.0mL的甲醇中，加入15.0mL水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有6,8-二甲 基木犀草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C 150mg。
将所得粗品C经甲醇重结晶纯化，干燥，获得含量96.0％的6,8-二甲基木犀 草素产品15mg。
所得产品经1H-NMR、13C-NMR和ESIMS确认结构。波谱数据证实，所提 取纯化得到的是6,8-二甲基木犀草素，其化学结构式如下：
6,8-二甲基木犀草素，黄色晶体。1HNMR(400MHz,pyridine-d5)δ:6.99(s, H-3),7.94(s,H-2′),7.35(d,J＝8.2Hz,H-5′),7.61(d,J＝8.2Hz,H-6′),2.33(s,3H, CH3-6),2.49(s,3H,CH3-8),13.96(s,5-OH)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5)δ: 161.3(s,C-2),103.5(d,C-3),183.3(s,C-4),157.8(s,C-5),108.0(s,C-6),164.4(s,C-7), 105.0(s,C-8),153.6(s,C-9),102.7(s,C-10),123.4(s,C-1′),114.4(d,C-2′),147.9(s, C-3′),151.6(s,C-4′),117.1(d,C-5′),119.5(d,C-6′),9.0(q,CH3-6),8.9(q,CH3-8)； ESIMS(negative-ion mode)m/z 313[M–H]–。