土槿乙酸衍生物及其药物组合及在抗肿瘤抗真菌用途 本发明属于药物，涉及某些具有与天然的和合成的土槿乙酸衍生物及其药物组合，其在抗肿瘤、抗病毒、抗真菌活性药学中的用途。
土槿皮，又叫土荆皮、金钱松、水松皮、荆树皮，来源为松科植物金钱松Pseudolarix amabilis(Nelson)Regd.[P.kaempferi Gord]的根皮和近根树皮。土槿皮性辛，温。有毒，止痒杀虫。最早见于清代赵学敏的《本草纲目拾遗》，是指四川以外的地区所产的木槿之皮，用于治疗癣症。自50年代以来土槿皮发展成抗真菌药物，主要用于治疗手脚癣、神经性皮炎、湿疹、癞痢头等(中药材，1994.02.15；17(2)：15～19)。其中的土槿酸，有抑制我国常见的致病真菌作用(中华皮肤科杂志，1960，8：18)。后来，经硅胶柱层析进一步分离得土槿甲酸(1)、土槿乙酸(2)和土槿丙酸(3)等。其中土槿乙酸(pseudolaric acid B)是主要成分，分子式C23H30O8，结构式为2.(化学学报，1982，40，447).此外尚有土槿甲酸苷和土槿乙酸苷。药理研究表明土槿总酸有抑制我国常见致病真菌的作用。
R1 R2 R3
1.CH3 COCH3 H
2.COOCH3 COCH3 H
3.COOH COCH3 H
4.COOH H H
5.CH3 H H
6.CH3 COCH3 CH3
7.COOCH3 H CH3
8.CH3 H CH3
目前临床上应用较多的有抗真菌抗生素，如灰黄霉素、制菌霉素、两性霉素B、克念霉素等；水杨酸类如水杨酸、水杨酰胺和化学合成的抗真菌唑类药物，如克霉唑、咪康唑、益康唑、酮康唑、伊康唑、氟康唑等。其中尤以唑类药物发展迅速，肟康唑、芬康唑、的康唑、异康唑、联苯苄唑等先后出现，此外还合成了亲脂性的新型唑类抗真菌药，但上述药物多不同程度地存在毒性或刺激性较大的缺点，限制了其临床应用，因此，人们将目光转向了天然产物。
本发明的一方面提供了通式(I)化合物
其中Y分别独立地表示O或NH；R1独立地表示甲基或COXR’，其中X独立地表示O或NH，R’独立地表示H，烷基；链烯基；芳基(未取代的或1个、2个独立地选自氯、溴、氟、甲氧基、硝基芳烷基)；杂环基；杂环烷基；goniotriol。)，R3分别独立地表示H，烷基，链烯基，芳基(未取代的或1个、2个独立地选自氯、溴、氟、甲氧基、硝基芳烷基)，杂环基，杂环烷基，goniotriol。R2表示H，烷基，烷基酰基，芳基烷酰基，芳基酰基，杂环基酰基，链烯基酰
基，芳基(未取代的或1个、2个独立地选自氯、溴、氟、甲氧基、
硝基芳烷基)酰基。
当该化合物为已知的土槿乙酸及甲酸单体时的抗真菌，抗病
毒，抗肿瘤活性。
本发明还包括应用式(I)化合物治疗肿瘤，病毒和真菌。
可以用药学上适用的碱成盐。本发明化合物的医药上允许的盐的制造方法。以使用将在有机合成化学领域中通常使用的方法进行适当组合后形成的组合物。
本发明还包括一个应用式(I)地药物组合物，或多种药物赋形剂的药物组合物。具体讲，如可以碱性溶液对含有游离的本发明化合物的溶液成盐。
将本发明化合物作为抗肿瘤制剂或抗真菌制剂使用时的药剂形态可以选择各种形态，例如片剂、胶囊、散剂、颗粒制剂、液体制剂等，将本发明化合物作为口服抗肿瘤制剂或抗真菌制剂使用时的药剂形态，可以选择各种形态，例如片剂、胶囊、散剂、颗粒制剂、液体制剂等。
将本发明化合物作为非口服制剂等.可以选择各种形态如注射剂，外用的霜剂，栓剂，液体制剂等。赋形制剂一般含有0.1～100重量％、最好含有1～100重量％的有效成分。
本发明化合物的实际理想的给药量可以根据使用的化合物的种类、配合的组合物的种类、适用的频度以及可以治疗的疾病的部位和患者确定。
本发明化合物可以按以下方式提取，分离，合成。实例：土槿乙酸呋喃-2甲酯(A)的合成
土槿皮10kg，粉碎成粗粉，用95％乙醇渗漉，所得浸膏用乙醚或苯提取，蒸去溶剂后得1.6kg提取物。经柱硅胶层析，收集7∶3石油醚-乙醚流分，经多次柱层析得土槿皮乙酸7.2g，在石油醚-乙醚中重结晶得柱状晶m.p.127.3-128.5℃(文献127-128℃)和混合物A(主要成分是土槿皮甲酸)。IR(KBr)cm-1：3550(COOH)，2950，1700(C＝O)，1220.
土槿乙酸0.35g(0.9mmol)溶于100ml无水CH2Cl2中，依次加入糠醇2.4g(24mmol)，DCC 1.9g(30mmol)及催化量DMAP，室温搅拌24h。反应物经硅藻土过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析(乙醚∶石油醚1∶1)，得无色固体100.29g，收率68.85％.乙醚-石油醚中重结晶，无色柱晶，mp.117-118℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δppm：1.62(3H，s，C11Me)；1.95(3H，d，J＝1.2Hz，C16Me)；2.12(3H，s，OCOCH3)；1.62-2.12，2.61-3.28(11H，m，CH)；3.71(3H，s，C19OCH3)；5.13(2H，s，C’-H2O)；5.86(1H，d，J＝15.9Hz，C13-H)，6.35(1H，d，J＝2.1，C’4-H)，6.35(1H，d，J＝2.1，C’6-H)6.51(1H，dd，J＝3.6 15.9Hz，C14-H)，7.14-7.19(2H，m，C8-H；C15-H 3’，5’-H)，7.42(1H，d，d J＝0.6，0.6Hz，5’-H).C28H32O9[α]16D-35.1(EtOH，c 0.11)，元素分析：M：512.55。计算值％：C 65.61 H 6.29；实测值％：C，H溶解性：可溶于甲醇、二甲基亚砜等有机溶剂，溶于水。酸性、中性、碱性物质的区别：碱性物质薄层层析Rf值：0.67，展开溶剂：乙醚∶石油醚(2∶1)本发明的式(1)化合物在作为抗肿瘤制剂或抗病毒制剂或抗真菌制剂可以使用。例1
材料 RPMI1640培养基为GIBCO公司产品，Hoechst33342和碘化丙啶(PI)均为Sigma公司产品，胎牛血清为中国医学科学院血液学研究所生产。琼脂糖和溴化乙锭(EB)为Sigma公司产品，细胞系K562细胞系由协和医科大学基础所馈赠，常规培养于10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基中37℃，5％CO2温育24h传代，取对数生长期细胞用于实验。
细胞凋亡的诱导 实验组细胞分别经1×10-4mol/L，1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L土槿乙酸处理，另设对照组不加土槿乙酸继续培养30h，收集细胞作凋亡细胞检测。
用Hoechst33342/PI荧光双染法检测细胞凋亡比例。
DNA电泳分析 收集2×106个细胞，PBS洗涤，按常规方法提取DNA，溶于30ulTE中；1％琼脂糖凝胶(含0.5ug/ml溴化乙啶)，电压50v，电泳4h后，紫外灯下拍照。
倒置光显微镜观察 K562细胞为悬浮生长，细胞呈圆形，土槿乙酸在1×10-4M～1×10-6M的浓度范围内用药19h，可见细胞体积缩小，细胞变为椭圆形，杆状，亚铃形，细胞内颗粒增多，细胞密度下降，并有膜包凋亡小体形成。
荧光显微镜观察 经荧光双染法，可见对照组细胞核均匀一致，被hoechst33342染成兰色荧光。连续培养40h后，可见有40％以上细胞核染色质凝集、边移，出现多个染色质凝集小体，被hoechst33342染成兰色荧光。
MTT法测定结果 结果见(表1)所示。不同浓度土槿乙酸处理细胞48h，明显抑制K562细胞生长，抑制率呈浓度依赖关系，其IC50值是5×10-5M。
表1土槿乙酸作用K562细胞48h后的抑制率组别 药物浓度(mol/L) A570 抑制(％)空白组 0.359±0.019对照组 1.430±0.062实验组 5×10-4 0.580±0.044* 79.37
1×10-4 0.743±0.081* 64.15
5×10-5 0.794±0.105* 59.38
1×10-5 1.019±0.089* 38.38
5×10-6 1.170±0.052* 24.28
1×10-6 1.179±0.069* 23.44
5×10-7 1.286±0.094 13.45
1×10-7 1.330±0.098 9.34*与对照组比较P＜0.01.DNA琼脂糖凝胶电泳分析 凋亡细胞典型的生化改变之一是核酸分子被核酸内切酶在核小体之间切成180bp左右及其倍数的DNA片段组成的“DNAladder”。1×10-5M和1×10-6M两种浓度土槿乙酸处理K562细胞，在40h时出现清晰的“DNA ladder”。例2
参照文献方法将对数生长期细胞稀释成1×104cell/ml，立即接种于96孔培养板，0.1ml/孔，然后在实验孔中加入含不同浓度的培养基，每浓度平行3孔，对照组加等体积容剂，置37℃CO2培养箱培养96小时，离心(1000rpm，20min)，弃上清液，每孔加0.2ml新鲜配制的0.2mg/ml MTT的无血清培养基，37℃继续培养4小时，再离心，倾出血清后，0.2ml DEIMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型超声震荡器震荡5min混匀，在MR700型酶标仪上测定570nm处的光密度，计算抑制肿瘤细胞生长率IC50化合物A对A2780的抑制率为3.12×10-5mol/L，K562细胞的抑制率为7.15×10-5mol/L。化合物A的抗真菌活性红色毛癣菌(BMU-16467)，须癣毛癣菌(BMU-16466，ATCC-28185)，白色念珠菌(BMU-16443，ATCC-11006)1实验方法
参照试管稀释法进行试验。2结果
菌株 MIC(mg/ml) MFC(mg/ml)
红色毛癣菌(BMU-16467) 18.8 22.6
须癣毛癣菌(BMU-16466，ATCC- 45.3 49.5
28185)
白色念球菌(BMU-16443，ATCC- 73.6 95.2
11006)