取代的3-吡啶基-4-芳基吡咯及治疗和预防相关疾病的方法 发明的领域
本发明涉及新的取代的3-吡啶基-4-芳基吡咯，以及它们在治疗和预防疾病方面的用途，使用所述化合物治疗和/或预防的疾病包括炎症和与AIDS有关的疾病。发明的背景TNF-α和p38-相关的疾病
炎症的细胞素如TNF-α是通过激酶的活化作用产生的。这种激酶包括细胞素抑制的抗炎药物结合蛋白(CSBP)/p38激酶，分裂素-活化蛋白(MAP)激酶族地丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。炎症细胞素在许多炎症疾病(1)，神经变性疾病(10)及与AIDS有关的疾病(11-14)中起很重要的作用。尽管如p38这样的激酶的准确作用机理还不清楚，但是p38和TNF-α的产生及与TNF-α受体相关的信号反应是有联系的(6)。
关节炎是炎症疾病最好的实例，因此是这方面最集中的炎症疾病。关节炎使数百万人受害，并且能够伤害人体的任何关节。其症状范围从受害关节的中等疼痛和发炎到严重和衰弱性疼痛和发炎。虽然该疾病主要和衰老的成年人有关，但是也不完全限于成年人。
最普通的风湿性关节炎的治疗方法包括使用非甾体抗炎药物(NSAID’s)，以便减轻症状。尽管普遍使用NSAID’s，许多患者不能忍受在长期治疗该疾病中必须的剂量，另外，NSAID’s仅仅能够减轻疾病的症状，不能解决根本问题。
当患者对NSAID’s没有反应时，经常使用其它药物如氨甲喋呤，金盐，D-青霉胺和去氢可地松。这些药物也有很大的毒性，其作用机制也不清楚。TNF-α的单克隆抗体和白细胞介素1β(1L-1β)的受体拮抗剂在小范围的人群临床试验中显示出能够减轻风湿性关节炎的症状(2)。
除了基于蛋白质的疗法以外，有小分子药物能够抑制上述细胞素的产生，并且在动物风温性关节模型中显示有活性(3)，在这些小分子药物中SB 203580被证明在脂多糖(LPS)-刺激的人单核细胞系中具有减少TNF-α和1L-1β产生的效果。IC50为50-100nM(4)。
除了体外试验以外，SB 203580能够在大鼠和小鼠体内抑制炎症细胞素的产生，IC50为15-25mg/kg(5)。SB 203580通过抑制CSBP/p38激酶的活性减少了炎症细胞素的产生，IC50为200nM(6)。由于SB203580的口服活性及在动物模型中显示的效力，研究者建议有如此活性的化合物能够作为治疗风湿性关节炎的有效治疗剂(5)。
吡啶基吡咯及类似物作为细胞素抑制剂和高血糖拮抗剂已经被制备(7)，特别是作为1L-1β，TNF-α和其它细胞素的抑制剂。芳基吡咯(8)和三芳基吡咯(9)作为细胞素抑制剂也已经制备。
最近发现CSBP/p38的作用和各种神经变性疾病及AIDS相关的疾病有关系。对于神经变性疾病，已经证明p38在确定细胞是否存活或经过神经元的有计划的细胞死亡或细胞凋亡中起作用(10，11)。
与AIDS有关，卡波济肉瘤相关的疱疹病毒HHV8能够编码G蛋白-偶合的受体，后者活化p38，曾经建议引起肿瘤发生和血管生成的这种活化作用导致卡波济肉瘤(12)。缺少临床有效的药物
一般而言，关节炎(特别是风湿性关节炎)以及其它炎症疾病和与AIDS有关的疾病的宿主因受到疾病的折磨全都遭受严重的伤亡。因此对于使用小分子药物治疗上述疾病是极需要的。但是至今还没有确定并显示在临床上对人有效的药物。发明的概述
本发明提供以下结构式的化合物或其药学上可接受的盐：其中：
(a)R1选自以下一组基团：(i)氢，(ii)C1-5烷基，(iii)取代或未取代C1-5烷基氨基，(iv)含-N的C1-5烷基杂环基，杂环选自噻唑烷，哌啶，吗啉，哌嗪，硫代吗啉，吡咯烷，噻嗪，吡咯和咪唑，(v)苯基，(vi)独立地以一个或一个以上的C1-5烷基，氨基，取代的氨基，硝基氰基，和砜基取代的苯基和(vii)吡啶；
(b)R2选自以下一组基团：(i)氢，(ii)(CH2)3OH，(iii)取代或未取的C1-5烷基苯基和(iv)含-N的C1-5烷基杂环基，杂环选自噻唑烷，哌啶，吗啉，哌嗪，硫代吗啉，吡咯烷，噻嗪，吡咯和咪唑；
(c)R3是独立地选自一个或一个以上的以下一组的取代基：氢，卤素，甲氧基，硝基，三氟甲基，羟基，二甲基氨基和甲基亚砜基；和
(d)X是C或N。
本发明还提供以下结构式的第二个化合物或其药学上可接受的盐：其中：
(a)R1选自以下一组基团：(i)氢，(ii)C1-5烷基，(iii)取代或未取代C1-5烷基氨基(iv)含-N的C1-5烷基杂环基，杂环选自噻唑烷，哌啶，吗啉，哌嗪，硫代吗啉，吡咯烷，噻嗪，吡咯和咪唑，(v)苯基，(vi)独立地以一个或一个以上的C1-5烷基，氨基，取代的氨基，氰基，硝基和砜基取代的苯基和(vii)吡啶；
(b)R2选自以下一组基团：(i)氢，(ii)(CH2)3OH，(iii)取代或未取代C1-5烷基苯基，和(iv)含-N的C1-5烷基的杂环基，杂环选自噻唑烷，哌啶，吗啉，哌嗪，硫代吗啉，吡咯烷，噻嗪，吡咯和咪唑；
(c)R4是取代或未取代的杂环基，它们选自吡啶，嘧啶，呋喃或噻吩；
(d)X是C或N。
本发明进一步提供含有本发明化合物和药学上可接受载体的药物组合物。
本发明还提供一种治疗方法，使接受治疗者的疾病通过减少适当的细胞中TNF-α产生和/或p38活性而得到改善，该方法包括用治疗有效量的本发明的药物组合物对接受治疗者给药。
最后本发明还提供一种预防治疗者炎症反应的方法，包括用预防有效量的本发明的药物组合物对接受治疗者给药，在预期引起接受治疗者炎症反应的事先或随后给药。发明的详细说明
本发明提供新的取代的3-吡啶基-4-芳基吡咯，这种化合物在治疗通过减少TNF-α产生和/或p38活性能够得到改善的疾病方面具有意想不到的用途，因此可以用于治疗炎症疾病如风湿性关节炎及与AIDS相关的疾病。
具体地说，本发明提供具有以下结构式的第一个化合物或其药学上可接受的盐：其中
(a)R1选自以下一组基团：(i)氢，(ii)C1-5烷基，(iii)取代或未取代C1-5烷基氨基(iv)含-N的C1-5烷基杂环基，杂环选自噻唑烷，哌啶，吗啉，哌嗪，硫代吗啉，吡咯烷，噻嗪，吡咯和咪唑，(v)苯基，(vi)独立地以一个或一个以上的C1-5烷基，氨基，取代的氨基，氰基，硝基和砜基取代的苯基和(vii)吡啶；
(b)R2选自以下一组基团：(i)氢，(ii)(CH2)3OH，(iii)取代或未取代C1-5烷基苯基和(iv)含C1-5烷基的N-杂环基，它们选自噻唑烷，哌啶，吗啉，哌嗪，硫代吗啉，吡咯烷，噻嗪，吡咯和咪唑；
(c)R3是独立地选自一个或一个以上的以下一组的取代基：氢，卤素，甲氧基，硝基，三氟甲基，羟基，二甲基氨基和甲基亚砜基；
(d)X是C或N。
在第一个化合物的实施方案中：
(a)R1选自以下一组基团：(i)氢，(ii)C1-5烷基，(iii)取代或未取代C1-5烷基氨基，(iv)含-N的C1-5烷基杂环基，杂环选自哌啶，吗啉和吡咯烷，和(v)取代的苯基，取代基选自氨基，取代的氨基，硝基和氰基；
(b)R2选自氢和(CH2)3苯基；
(c)R3选自以下一组基团：卤素，硝基和三氟甲基；和
(d)X是C。
在优选的实施方案中，第一个化合物选自表1所示的一组化合物。表1
本发明还提供以下结构式的第二个化合物或其药学上可接受的盐：
(a)R1选自以下一组基团：(i)氢，(ii)C1-5烷基，(iii)取代或未取代C1-5烷基氨基，(iv)含-N的C1-5烷基杂环基，杂环选自噻唑烷，哌啶，吗啉，哌嗪，硫代吗啉，吡咯烷，噻嗪，吡咯和咪唑，(v)苯基，(vi)独立地以一个或一个以上的C1-5烷基，氨基，取代的氨基，氰基，硝基和砜基取代的苯基和(vii)吡啶；
(b)R2选自以下一组基团：(i)氢，(ii)(CH2)3OH，(iii)取代或未取代C1-5烷基苯基，(iv)含-N的C1-5烷基杂环基，杂环选自噻唑烷，哌啶，吗啉，哌嗪，硫代吗啉，吡咯烷，噻嗪，吡咯和咪唑；
(c)R4是取代或未取代的杂环基，它们选自吡啶，嘧啶，呋喃或噻吩；并且
(d)X是C或N。
在第二个化合物的一个实施方案中：
(a)R1选自以下一组基团：(i)C1-5烷基，(ii)取代或未取代C1-5烷基氨基，(iii)取代或未取代的C1-5烷基杂环氨基，(iv)苯基和(v)独立地以一个或一个以上的氨基，取代的氨基，硝基和氰基取代的苯基；
(b)R2选自氢和(CH2)3苯基；并且
(c)X是C。
本发明的化合物能够以游离碱被分离出来，并且使用，它们也能够以药学上可接受的盐分离出来并且使用，所述盐的实例包括氢溴酸盐，氢碘酸盐，盐酸盐，高氯酸盐，硫酸盐，马来酸盐，富马酸盐，苹果酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，苯甲酸盐，扁桃酸盐，甲基磺酸盐，羟乙基磺酸盐，苯磺酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，2-萘酸盐，对甲苯磺酸盐，环己烷磺酸盐和葡糖二酸盐。本发明也提供一种药物组合物，它含有一种本发明的化合物和药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的，包括但是不限于约0.01到约0.1M，并且优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％的食盐水。所述药学上可接受的载体可以是水溶液或非水溶液，悬浮液或乳液。非水溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可以注射的有机酯类如油酸乙酯。水溶性载体包括水，乙醇，醇/水溶液，甘油，乳液或悬浮液，包括食盐水和缓冲介质。口服载体可以是酏剂，糖浆，胶囊，片剂等。典型的固体载体是惰性物质如乳糖，淀粉，葡萄糖，甲基纤维素，硬脂酸镁，磷酸二钙，甘露糖醇等。非肠道给药的载体包括氯化钠溶液，林格氏右旋葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸化的林格氏右旋葡萄糖和固定油。静脉给药载体包括流体和营养补充剂，电解质补足剂，例如以林格氏右旋葡萄糖为基础的物质。也可以有防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂，抗氧剂，螯合剂，惰性气体等。需要时所有载体可以和崩解剂，稀释剂，成粒剂，润滑剂，黏合剂等混合，使用本领域的常规技术。
本发明进一步提供一种治疗方法，该方法使接受治疗者通过减少适当细胞中的TNF-α和/或p38活性能够使疾病得到改善，该方法包括对接受治疗者用治疗有效量的本发明药物组合物给药。
在一个实施方案中，疾病是炎症疾病；在另一实施方案中，疾病是与AIDS相关的疾病。使用本发明的药物组合物治疗的疾病的例子，没有特别的限制，包括风湿性关节炎，骨质疏松，骨节炎，过敏性炎症，牙周病，肠炎，败血性休克，胰岛素依赖型糖尿病，非胰岛素依赖型糖尿病，恶病质，肺纤维化，重症肌无力，节段性回肠炎，肝炎，初期胆管硬化，急性胰腺炎，同种移植排斥，恶性胶质病，脱发，牛皮癣，局部缺血，充血性心脏衰竭，心瓣再狭窄，动脉粥样硬化，红斑狼疮，肾炎，急性感染性多神经炎，病毒性心肌炎，HIV复制，HIV感染中的T-细胞衰竭，由于神经元炎症引起的识别性缺陷，多发性硬化症，中风，神经疼，HIV痴呆和阿尔兹摩病。在优选的实施方案中，疾病是风温性关节炎。
本文中的术语“接受治疗者”，没有特别限制，是指任何动物或人工改良的动物，它们有通过减少适当细胞中的TNF-α产生和/或p38的活性能够得到治疗的疾病。在优选的实施方案中，接受治疗者是指人。
本文术语“适当的细胞”作为实例包括分泌或能够分泌TNF-α的细胞和其中p38被活化的细胞，适当的细胞的实例，没有特别限制，包括单核细胞，巨噬细胞，T淋巴细胞，成纤细胞，树突细胞，郎格尔汉斯细胞，枯否细胞和星型神经胶质细胞。
能够用各种本领域技术人员公知的方法使用本发明的药物组合物进行给药，本发明的化合物能够以例如静脉给药，肌内给药，口服给药和皮下给药。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物以口服给药。另外，给药也包括对接受治疗者在适当的周期内多次按剂量给药。给药的方式可根据常规的方法确定。
本文中使用的药物组合物的“治疗有效剂量”是停止，恢复或减缓疾病进程的足够数量；药物组合物的“预防有效剂量”是防止，例如消除，改善和/或推迟疾病的足够数量。确定本发明药物组合物的治疗和预防有效剂量的方法是本领域公知的。例如对于人类来说，药物组合物的有效剂量能够从动物试验的结果推算确定。
在一个实施方案中，治疗和/或预防有效剂量是足够给出约0.05mg/kg体重到200mg/kg体重药物组合物的剂量。在另一实施方案中，治疗和/或预防有效剂量是足够给出约0.5mg/kg体重到50mg/kg体重药物组合物的剂量。更具体地说在一个实施方案中，口服剂量范围是每天约0.05mg/kg到100mg/kg；在另一实施方案中，口服剂量范围是每天约0.05mg/kg到50mg/kg；在另一实施方案中，是每天约0.05mg/kg到20mg/kg；在另一实施方案中，输注剂量范围是在在约几分钟到几天周期内以约1.0μg/kg/min到1.0×104μg/kg/min的剂量输入，和药学上载体混合的抑制剂。在另一实施方案中，局部给药是将本发明化合物和药学载体结合，药物/载体的比例为约0.001到约0.1。
本发明还提供预防接受治疗者炎症反应的方法，包括对接受治疗者用预防有效量的本发明药物组合物给药，或者对于预期引起炎症反应的情况，事先或随后对接受治疗者给药。在优选的实施方案中，所述情况是昆虫叮咬或动物叮咬。
本文使用的以下化学术语具有在本节提出的含义：“独立地”对于取代基来说，是指当有一个以上的取代基时，取代基可以相同或不同；“烷基”是指直链，环状或支链的烷基；“烷氧基”是指O-烷基；“卤素”是指氟，氯，溴或碘；“Ph”是指苯基；“TCA”是指三氯乙酸；“FCS”是指胎牛血清；“RPMI”是指从Roswell Park MemorialInstitute(Sigma cat#R0833)得到的介质。
本发明能够通过参考其后试验的详细材料更好地理解，但是本领域的技术人员很容易明白，这些材料仅仅是为了说明本发明的，在其后的权利要求书中更充分描述。另外，本申请中引述了各种公开出版物，这些公开出版物作为本申请的参考，可以更充分地描述和本发明有关的现有技术的状态。试验的详细说明I.一般的合成反应历程
本发明代表性的化合物可以按照以下所述，并且在以下总合成历程中举例说明的一般合成方法来合成。某些反应历程的产品可以用作中间体，产生一个以上的本发明化合物，在这种情况下，选择产生本发明化合物使用的中间体成为谨慎考虑的事情，这些考虑是本领域技术人员能够作到的。
反应历程1
历程1用来得到其中R1是甲基的本发明化合物。化合物1a，如1，2-二取代的炔，可以用作历程1中的原料。1，2-二取代的炔可以按照公知的方法制备。本发明化合物的取代基X和R3由化合物1a的取代基确定。化合物1a和三甲基胺-N-氧化物结合，溶解在无水溶剂如THF中，冷却到0℃，加入碱如二异丙基氨基锂，于0℃搅拌反应1小时，得到化合物1b作为产品。
反应历程2
反应历程2用于制备其中R1是氢的本发明化合物。化合物2a，1[(1-异氰基-2-(3-甲氧基-苯基)乙烯基)磺酰基]-4-甲基苯可以作为历程2中的原料。化合物2a按照公知的方法制备。本发明化合物的取代基R3由化合物2a中苯基乙炔基基团上的取代基决定，X原子由化合物2b中的乙酯基团的杂芳基取代基确定。将化合物2a溶解在无水溶剂如乙二醇二甲醚中，于0℃滴加到化合物2b(如4-吡啶基乙酸乙酯)和碱(如叔丁醇钾)在无水溶剂(如乙二醇二甲醚)的混合物中。添加完成以后反应温热到25℃，搅拌3小时，得到中间体化合物2c。当R3是甲氧基时，中间体化合物2c在惰性溶剂中(如二氯甲烷)于-78℃用脱甲基化试剂(如BBr3)处理，得到化合物2d。
反应历程3
反应历程3用于制备其中R1是氢及R2是取代的或未取代的本发明化合物。化合物3a，二芳基取代的α，β-不饱和酯，可以作为历程3中的原料。该类型的化合物按照公知的方法制备。化合物3b是另一个原料，即取代的甲苯磺酰基甲基异氰酸酯(tosMIC)衍生物可以按照公知的方法制备。
例如化合物3a是4-氟-α-[(4-吡啶基)亚甲基]苯乙酸和化合物3b是1-(4-甲苯磺酰基)-1-(3-苯基丙基)甲基异氰酸酯。将化合物3a和化合物3b溶解在无水溶剂(如乙二醇二甲醚)中，滴加到-40℃的碱(如叔丁醇钾)在无水溶剂(如乙二醇二甲醚)的混合物中。于-40℃继续搅拌1小时，允许温度提高到-20℃，得到的化合物3c是4-(4-氟苯基)-2-(3-苯基丙基)-3(4-吡啶基)吡咯(化合物27)。
如反应历程4所示，化合物2c和化合物3c用作中间体可以制备本发明的其它化合物。
反应历程4
反应历程4用来制备其中R1是被取代的本发明化合物。于0℃将中间体化合物2c或3c滴加到溶剂(如二甲基甲酰胺)中的碱(如氢化钠)中，滴加完成后，于0℃继续搅拌反应15分钟，随后分份加入烷基化剂，如4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，将反应在60℃温度下加热16小时，然后温度冷却到25℃，得到化合物4a。
反应历程5
反应历程5用来制备其中R1是被取代的本发明化合物，当R1是4-硝基苯基时，中间体化合物4a用催化剂还原，催化剂为溶剂如乙酸乙酯中的钯/碳，得到化合物5a。胺化合物5a用酰基化剂如乙酸酐在溶剂中(如水)处理，得到产品化合物5b。
反应历程6
反应历程6用来制备其中R2是含有杂原子的烷基链的本发明化合物。将中间体化合物3c使用催化剂暴露于还原条件下，催化剂为溶剂如乙醇中的钯/碳，往其中加入催化量的酸如浓盐酸，得到化合物6a。醇化合物6a用磺化剂(如甲磺酰氯)和碱(如三乙胺)在溶剂(如二氯甲烷)中处理，得到中间体化合物6b。化合物6b和亲核试剂如吗啉一起在溶剂(如二氯甲烷)中加热，得到化合物6c。II.具体化合物的合成
本发明代表性的具体化合物能够按照以下实施例制备。没有打算使这些反应的产率是最佳的。根据以下的方法，本领域的技术人员知道如何用常规方法改变反应时间，温度，溶剂和/或试剂来提高产率。
某些合成的产品作为中间体制备一个以上的本发明化合物，在这种情况下，选择制备本发明化合物的中间体是慎重的，这是本领域技术人员有能力作到的。
化合物12 3-(3-羟基苯基)-4-(4-吡啶基)吡咯氢溴酸盐
将化合物13(0.15g，0.006mol)溶解在二氯甲烷(50ml)中，冷却到-78℃。搅拌混合物16小时，将温度提高到25℃。用MeOH(20ml)停止反应，蒸发得到固体。固体用乙醚研制，过滤后得到化合物12(0.15g，79％产率)。
1HNMR(DMSO-d6)δ11.91(1H，s，NH)，9.47(1H，br s，OH)，8.66(2H，d，J＝8.6)，7.86-7.86(3H，m)，7.25-7.14(1H，m)7.06(1H，s)6.80-6.66(3H，m).化合物13 3-(3-甲氧基苯基)-4-(4-吡啶基)吡咯
将1-[(1-异氰基-2-(3-甲氧基苯基)乙烯基)磺酰基]-4-甲基苯(9.0g，0.0285mol)溶解在无水DMF(200ml)中，滴加到冷却的(0℃)4-吡啶基乙酸乙酯(9.0g，0.545mol)和叔丁醇钾(7.1g，0.0633mol)于无水DMF(100ml)中的混合物中。滴加完成后，温热到25℃，搅拌3小时。将反应物倒入冰水中(1200ml)，萃取到二氯甲烷(3×500ml)中，合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，真空蒸发，得到固体。将固体用乙醚研制并过滤得到3.0g的纯3-(3-甲氧基苯基)-4-(4-吡啶基)吡咯。滤液再进行真空蒸发，然后用50/50的二氯甲烷和乙醚的混合物研制，得到另外的1.5g纯产品，最后真空蒸发滤液，用二氧化硅提纯，用乙酸乙酯洗脱，得到另外的0.5g产品，总产率为70％。
1HNMR(DMSO-d6)δ11.38(1H，br s，NH)，8.37(2H，d，J＝6.1)，7.24-7.17(4H，m)，7.02-7.00(1H，m)，6.80-6.77(3H，m)，3.68(3H，s).化合物27 4-(4-氟苯基)-2-(3-苯基丙基)-3-(4-吡啶基)吡咯
将1-(4-甲苯磺酰基)-1-(3-苯基丙基)甲基异氰酸酯(10.9g，0.0346mol)和4-氟-α-[(4-吡啶基)亚甲基]苯乙酸乙酯(9.4g，0.0346mol)溶解在无水DMF(250ml)中，滴加到冷却的(-40℃)叔丁醇钾(9.5g，0.0847mol)于无水DMF(50ml)中的混合物中，搅拌混合物1小时，温度提高到20℃。将混合物倒入水中(1800ml)，萃取到二氯甲烷(3×500ml)中，合并的有机相用硫酸钠干燥，真空蒸发，得到固体。将固体用乙腈研制，得到纯化合物27(6.0g，产率49％)。
1HNMR(DMSO-d6)δ11.17(1H，s，NH)，8.38(2H，d，J＝5.8Hz)，7.27-6.92(12H，m)，2.61-2.51(4H，m)，1.93-1.83(2H，m).
化合物28 1-甲基-3-(4-氟苯基)-4-(4-吡啶基)吡咯
4-[(4-氟苯基)乙炔基]吡啶(2.0g，0.0101mol)和三甲胺-N-氧化物(1.0g，0.0133mol)溶解在无水THF(200ml)中，冷却到0℃，加入二异丙基氨基锂(1.5M，在THF中，14ml)，于0℃搅拌反应1小时，用水(20ml)停止反应，萃取到二氯甲烷(2×100ml)中，用硫酸钠干燥有机物，真空蒸发得到油状物。用二氧化硅提纯，用EtOAc洗脱，得到0.356g(产率14％)化合物28。
1HNMR(CDCl3)δ8.41(2H，d，J＝5.4Hz)，7.19(2H，dd，J＝5.7，6.0Hz)，7.11(2H，d，J＝5.4Hz)，6.99(2H，dd，J＝8.7，8.5Hz)，6.87(1H，d，J＝2.1Hz)，6.69(1H，d，J＝2.4Hz)，3.71(3H，s).
化合物30 4-[(4-氟苯基)-1-(4-硝基苯基)-2-(3-苯基丙基)-3-(4-吡啶基)吡咯
将氢化钠(60％，矿物油中，0.80g，0.0209mol)用己烷洗涤3次，然后溶解在DMF(15ml)中，于0℃搅拌下滴加化合物27(6.0g，0.01683mol)。滴加完成后，于0℃继续搅拌15分钟，然后滴加4-氟硝基苯(2.4g，0.170mol)，于0℃搅拌反应1小时，使温度提高到25℃，将反应物倒入1.5L水中，萃取到二氯甲烷(3×500ml)中，合并的有机物用水洗涤(4×500ml)，硫酸钠干燥，真空蒸发得到黄色固体，用乙腈研制，过滤，空气干燥，得到6.6g(82.5％产率)纯化合物30。
1HNMR(CDCl3)δ8.52(2H，d，J＝5.8Hz)，8.26(2H，d，J＝8.9Hz)，7.46(2H，d，J＝8.9Hz)，7.16-7.13(3H，m)，7.09-7.03(4H，m)，6.95-6.82(5H，m)2.73-2.67(2H，m)，2.35-2.32(2H，m)，1.53-1.43(2H，m).
化合物31 1-(4-乙酰氨基苯基)-4-(4-氟苯基)
-2-(3-苯基丙基)-3-(4-吡啶基)吡咯
化合物32(0.85g，0.0019mol)在乙酸酐(20ml)和水(50ml)中搅拌16小时，将溶液萃取到乙酸乙酯(100ml)中，用水(3×50ml)洗涤，然后用饱和碳酸氢钠(3×50ml)洗涤，再用水(2×50ml)洗涤，有机物用硫酸钠干燥，，真空蒸发得到化合物31(0.89g，96％产率)，为油状物。
1HNMR(CDCl3)δ8.41(2H，d，J＝5.6Hz)，8.05(1H，s)，7.73(2H，d，J＝8.6Hz)，7.28(2H，d，J＝8.7Hz)，7.17-7.04(7H，m)，6.91-6.85(4H，m)，6.79(1H，s)，2.66-2.61(2H，m)，2.35-2.30(2H，m)，2.22(3H，s)，1.59-1.51(2H，m).
化合物32 1-(4-氨基苯基)-4-(4-氟苯基)
-2-(3-苯基丙基)-3-(4-吡啶基)吡咯
化合物30(6.6g，0.0138mol)悬浮在乙醇(200ml)和乙酸乙酯(50ml)中，在Parr氢化器中于还原条件下暴露16小时(50PSI)，用C盐过滤混合物，真空蒸发得到油状物，用乙腈研制，过滤得到的固体，得到化合物32(3.2g)。真空蒸发滤液，用二氧化硅提纯，用己烷中的50％乙酸乙酯洗脱，得到另外的1.75g产品(总产率79％)。
1HNMR(CDCl3)δ8.44(2H，d，J＝5.9Hz)，7.22-6.71(16H，m)，3.85(2H，s)，2.63-2.57(2H，m)，2.38-2.33(2H，m)，1.61-1.49(2H，m).
化合物46 4-(4-氟苯基)-2-(3-羟基丙基)-3-(4-吡啶基)吡咯
将含有浓盐酸(0.2ml)的2-(3-苄氧基丙基)-4-(4-氟苯基)-3-(4-吡啶基)吡咯(0.95g，0.0025mol)的乙醇(125ml)溶液加入到Pd/C(0.2g)中，混合物在Parr氢化器中于氢气氛中暴露16小时(50PSI)，用C盐过滤混合物，将三乙胺(0.5ml)加入到所得溶液中，真空蒸发而得到固体，萃取到乙酸乙酯(100ml)中，用水洗涤(3×50ml)，硫酸钠干燥，真空蒸发得到浅黄色固体(0.7g，产率96％)。
1HNMR(DMSO-d6)δ11.10(1H，s，NH)，8.44(2H，d)，7.05(6H，m)，6.91(1H，d)，4.53(1H，br s，OH)，3.49(2H，br s)，2.64(2H，t)，1.72(2H，m).
化合物47 4-(4-氟苯基)-2-(3-吗啉基丙基)-3-(4-吡啶基)吡咯
4-(4-氟苯基)-2-(3-甲基磺酰氧丙基)-3-(4-吡啶基)吡咯(0.25g，0.0007mol)在二氯甲烷(50ml)和吗啉(0.25ml)中回馏16小时，将溶液冷却，用二氯甲烷(约100ml)稀释，用水洗涤(3×50ml)，硫酸钠干燥，真空蒸发得到油状物，油状物用二氧化硅提纯，用二氯甲烷中的10％甲醇洗脱，得到4-(4-氟苯基)-2-(3-吗啉基丙基)-3-(4-吡啶基)吡咯，为固体(0.088g，产率36％)。
1HNMR(DMSO-d6)δ11.12(1H，s，NH)，8.42(2H，d)，7.05(6H，m)，6.95(1H，d)，3.55(4H，t)，2.62(2H，t)，2.29(6H，m)，1.71(2H，m).
化合物48 4-(4-氟苯基)-2-(3-甲基磺酰氧丙基)
-3-(4-吡啶基)吡咯
4-(4-氟苯基)-2-(3-羟基苯基)-3-(4-吡啶基)吡咯(0.55g，0.0019mol)与在二氯甲烷(50ml)中的三乙胺(0.52ml，0.0037mol)混合，冷却到10℃，滴加甲磺酰氯(0.16ml，0.0020mol)，所得混合物温热到室温，用二氯甲烷(50ml)稀释，用水洗涤(30ml)，硫酸钠干燥有机物，真空蒸发得到油状物，油状物溶解在乙酸乙酯中，通过二氧化硅床(约20ml)提纯，用乙酸乙酯洗脱，真空蒸发溶剂，得到黄色固体(0.63g，产率91％)。
1HNMR(DMSO-d6)δ11.25(1H，s，NH)，8.45(2H，d)，7.09(6H，m)，6.94(1H，d)，4.19(2H，t)，3.17(3H，s)，2.71(2H，t)，1.98(2H，m).III.生物学试验和活性
A.体外酶试验中p38的抑制作用
提纯的重组p38(以E.coli表达的6XHis-p38)的溶液(38μL)，髓磷质碱性蛋白底物(经验确定的)和pH7.5(Hepes：25mM，MgCl2：10mM，MnCl2：10mM)缓冲液加入到96孔园底聚丙烯板的92个孔中，酶的数量凭经验根据试验的线性范围和可接受的信躁比确定，其余的孔用于对照(“CTRL”)和空白(“BKG”)。CTRL使用酶，底物缓冲液和2％DMSO制备，BKG使用底物缓冲液和2％DMSO制备。
DMSO中的试验化合物溶液(12μL)加入到试验孔中。化合物在10％DMSO/H2O中稀释到125μM，并且在25μM下进行试验，此时DMSO的最终浓度是2％。将ATP/33P-ATP溶液(10μL，含有50μM未标记ATP，和1μCi33P-ATP)加入到所有孔中，混合完成的板并且于30℃培养30分钟。将冰冷却的50％TCA/10mM磷酸钠(60μL)加入到每一孔中，在冰中保持15分钟。将每一孔中的物质转移到96孔的过滤板的孔中(Millipore，MultiScreen-DP)，过滤板放在真空中(带有各种废液收集盘)。用10％TCA/10mM磷酸钠(200μL)于真空下洗涤各孔5次，加入MicroScint-20闪烁剂，用Topseal-S片将板封闭，采用PackardTopCount闪烁计数器计数，使用带有颜色熄灭矫正的33P液体程序，其中输出是颜色熄灭矫正cpm，每一试验化合物的％抑制作用列于表2，用以下公式计算：％抑制作用＝[1-(样品-BKG)/(CTRL-BKG)]×100。
表2
％p38抑制作用化合物 R1 R2 R3 R4 @ 10μM2 CH3 H 4-pyr 3，4-F-Ph 153 4-NO2-Ph H 4-pyr 3，4-F-Ph 804 4-CN-Ph H 4-pyr 3，4-F-Ph 2114 CH3 H 4-pyr 3-OCH3-Ph 4318 4-CN-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 2328 H (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 4929 CH3 H 4-pyr 4-F-Ph 3430 4-NO2-Ph H 4-pyr 4-F-Ph 7031 4-NO2-Ph (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 6732 4-NHAc-Ph (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 3833 4-NH2-Ph (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 51
虽然化合物最初在20μM下进行试验，但是也有理由将化合物浓度提高到该浓度的4倍左右。另外，某些化合物的IC50使用有程序的Deltagraph 4-参数曲线-计算。
B.全细胞体外TNF-α抑制试验
新鲜的静脉血用肝素抗凝，用等体积的磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)稀释，放在无菌管或其它容器中。该混合物的等分试样(30mL)转移到离心管中，离心管用Ficoll-Hypaque(15mL)支撑，所制备的离心管于室温在400Xg下离心30分钟不破裂，用吸管移去单核细胞带上的约1/2到2/3血小板层，使用吸管小心移出大部分的单核细胞层，这些PBMC’s用PBS稀释，在600Xg下离心15分钟。得到的PBMC’s用另一份PBS稀释，并且在室温于400Xg下离心10分钟。回收的小球用低的内毒素RPMI/1％FCS培养介质稀释，得到细胞浓度为0.5-2.0×106PMBC/mL。移出少量悬浮液在血细胞计数器上计数，其余者于200Xg下室温离心15分钟，回收的小球PBMC’s再悬浮于RPMI/1％FCS，浓度为1.67×106PMBC/mL。
为了进行试验，将PBMC悬浮液(180μL)转移到96孔平底微滴定板的孔中(双重的)，于37℃培养1小时，将试验化合物的溶液(10μL，20X所需要的最终浓度制备)加入到每一孔中并将板于37℃培养1小时.加入LPS在RPMI/1％FCS(200ng/mL)中的溶液(10μL)，于37℃培养过夜，上清液(100μL)从每一孔中移出，用RPMI/1％FCS(400μL)稀释，使用商品ELISA试剂盒(Genzyme)分析TNF-α。
本发明选择的化合物列于表3，检验化合物抑制TNF-α产生的能力，列出了所述化合物的IC50nM。
表3 TNF-α化合物R1 R2 R3 R4 IC50nM 方案1 H H 4-pyr 3，4-F-Ph 20 22 CH3 H 4-pyr 3，4-F-Ph 30 13 4-NO2-Ph H 4-pyr 3，4-F-Ph 2 44 4-CN-Ph H 4-pyr 3，4-F-Ph 2 45 4-CH3SO2-Ph H 4-pyr 3，4-F-Ph 30 46 CH3 H 4-pyr 3，5-F-Ph 175 17 CH3 H 4-pyr 3-CF3，4-F-Ph 100 18 CH3 H 4-pyr 3-CF3，4-F-Ph 1500 19 CH3 H 4-pyr 3-CF3-Ph 125 110 CH3 H 4-pyr 3-F-Ph 125 111 CH3 H 4-pyr 3-NO2-Ph 100 112 H H 4-pyr 3-OH-Ph 300 213 H H 4-pyr 3-OCH3-Ph 55 214 CH3 H 4-pyr 3-OCH3-Ph 55 115 4-NO2-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 20 416 4-NHAc-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 75 417 4-NH2-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 95 418 4-CN-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 15 419 4-CH3SO2-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 30 420 2-pyr H 4-pyr 3-OCH3-Ph 150 421 2，4-NO2-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 80 422 4-SO2-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 1000 423 (CH2)3-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 2000 424 H H 4-嘧啶 3-OCH3-Ph 250 225 CH3 H 4-pyr 3-噻吩基 900 126 CH3 H 4-pyr 4-OCH3-Ph 2000 127 H H 4-pyr 4-F-Ph 90 228 H (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 3.5 329 CH3 H 4-pyr 4-F-Ph 200 130 4-NO2-Ph H 4-pyr 4-F-Ph 2 431 4-NO2-Ph (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 15 432 4-NHAc-Ph (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 5 533 4-NH2-Ph (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 8 534 CH3 H 4-pyr 4-pyr 3000 135 CH3 H 4-pyr 4-SCH3-Ph 250 136 CH3 H 4-pyr 4-(CH3)2N-Ph 500 137 CH3 H 4-pyr 4-SOCH3-Ph 3000 138 CH3 H 4-pyr Ph 350 139 (CH2)3N(CH2)5 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 5 440 (CH2)2N(CH2)5 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 3 441 (CH2)2CH(CH2)3NCH3 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 5 442 (CH2)2CH(CH2)3NCH3CH2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 2 443 (CH2)2N(CH2)2O(CH2)2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 1 444 (CH2)3N(CH3)2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 8 445 (CH2)2N(CH2)4 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 3 446 H (CH2)3-OH 4-pyr 4-F-Ph 544 647 H (CH2)2N(CH2)2O(CH2)2 4-pyr 4-F-Ph 177 6
C.啮齿动物体内抑制TNF-α产生试验
本发明化合物抑制LPS-诱发的TNF-α产生的能力使用以下啮齿动物体内试验说明，小鼠(BALB/cj，雌性，Jackson实验室)或大鼠(Lewis，雄性，Charies River)禁食，30分钟后口服剂量5-10mL/kg试验化合物(5-50mg/kg)。给药30分钟以后，动物从腹膜内注射LPS1mg/kg，放回到笼子1小时。用二氧化碳麻醉动物，通过心肌穿刺放血并收集全血(0.1-0.7mL)。将血液凝固，血清转移到离心管中。该样品被离心并收集血清，分成等分试样，于80℃冷冻。样品用商品ELISA分析TNF-α(内源的：对于小鼠TNF-α；生物源的：对于大鼠TNF-α)。本发明选择的化合物的体内试验结果列于表4，检验了化合物的在小鼠中抑制TNF-α产生的能力，数据以在25mg/kg下用％抑制作用表示。
表4
小鼠中
TNF-α％化合物 R1 R2 R3 R4 抑制作用1 H H 4-pyr 3，4-F-Ph 967 CH3 H 4-pyr 3-CF3，4-F-Ph 7911 CH3 H 4-pyr 3-NO2-Ph 9414 CH3 H 4-pyr 3-OCH3-Ph 7116 4-NHAc-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 5017 4-NH2-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 6618 4-CN-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 6019 4-CH3SO2-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph -12727 H H 4-pyr 4-F-Ph 10028 H (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 1030 4-NO2-Ph H 4-pyr 4-F-Ph 5339 (CH2)3N(CH2)5 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 10040 (CH2)2N(CH2)5 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 9641 (CH2)2CH(CH2)3NCH3 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 10042 (CH2)2CH(CH2)3NCH3CH2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 10043 (CH2)2N(CH2)2O(CH2)2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 9344 (CH2)3N(CH3)2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 10045 (CH2)2N(CH2)4 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 9947 H (CH2)2N(CH2)2O(CH2)2 4-pyr 4-F-Ph 77
本发明选择的化合物的体内试验结果列于表5中，检验了化合物的在小鼠中抑制TNF-α产生的能力，数据以在10mg/kg下用％抑制作用表示。
表5
小鼠中
TNF-α％化合物 R1 R2 R3 R4 抑制作用3 4-NO2-Ph H 4-pyr 3，4-F-Ph 817 CH3 H 4-pyr 3-CF3，4-F-Ph 6111 CH3 H 4-pyr 3-NO2-Ph 7414 CH3 H 4-pyr 3-OCH3-Ph 4118 4-CN-Ph H 4-pyr 3-OCH3-Ph 2427 H H 4-pyr 4-F-Ph 7328 H (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 1031 4-NO2-Ph (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 4732 4-NHAc-Ph (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 4839 (CH2)3N(CH2)5 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 3640 (CH2)2N(CH2)5 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 9641 (CH2)2CH(CH2)3NCH3 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 10042 (CH2)2CH(CH2)3NCH3CH2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 10043 (CH2)2N(CH2)2O(CH2)2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 9344 (CH2)3N(CH3)2 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 10045 (CH2)2N(CH2)4 (CH2)3-Ph 4-pyr 4-F-Ph 99参考文献1.C.Dinarello，et al.，Inflammatory Cytokines：Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor as Effector Molecules in Autoimmune Diseases，Curr. Opin.Immunol 1991，3，941-48.2.M.J.Elliot et al.，Treatment of Rheumatoid Arthritis with Chimeric Monoclonal Antibodies to Tumor Necrosis Factorα，Arthritis Rheum. 1993，36，1681-90.3.J.C.Boehm，et al.，1-Substituted 4-Aryl-5-pyridinylimidazoles：A New Class of Cytokine Suppressive Drugs with Low 5-Lipoxygenase and Cyclooxygenase Inhibitory Potency，J.Med.Chem.，1996，39，3929-37.4.International Publication No.WO 93/14081.5.A.M.Badger，et al.，Pharmacological Profile of SB 203580，A Selective Inhibitor of Cytokine Suppressive Binding Protein p38 Kinase，in Animal Models of Arthritis，Bone Resorption，Endotoxin Shock and Immune Function，The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics， 1996，279，1453-61.6.D.Griswold，et al.，Pharmacology of Cytokine Suppressive Anti- Inflammatory Drug Binding Protein(CSBP)，A Novel Stress-Induced Kinase，Pharmacology Communications，1996，7，323-29.7.U.S.Patent No.5,776,954.8.International Publication No.WO 97/05877.9.Intemational Publication No.WO 97/05878.10.Davis，Roger J.，et al.，Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP Kinases on Apoptosis，Science，1995，270(5240)，1326-31.11.Heidenreich，Kim A.，et al.，Inhibition of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase by Insulin in Cultured Fetal Neurons，J.Biol.Chem.，1996， 271(17)，9891-4.12.Arvanitakis，L.，et al.，G-Protein-Coupled Receptor of Kaposi′s Sarcoma- Associated Herpesvirus is a Viral Oncogene and Angiogenesis Activator，Nature，1998，391(6662)，86-89.13.Pitha，Paula M.，et al.，Eatly Activation of Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase，Extracellular Signal-Regulated Kinase，p38 Mitogen- Activated Protein Kinase，and c-Jun N-terminal Kinase in Response to Binding of Simian Immunodeficiency Virus to Jurkat T Cells Expressing CCR5 Receptor，Virology，1998，252(1)，210-217.14.Bukrinsky，M.，The Critical Role of p38 MAP Kinase in T Cell HIV-1 Replication，Mol.Med，1997，3(5)，339-346.