人工神经管 【技术领域】
本发明涉及人工神经管。背景技术
末梢神经在手术中被切断或者由于外伤切断时，首先尝试将切断的末梢神经的断处相互直接吻合的方法。但是，多数情况下，不能使切断的神经准确地直接吻合，有时就这样断着置之不理。因此，欲向末梢侧再生的神经被结缔组织等阻挡，不能到达末梢侧神经断处，形成切断端神经瘤，停止再生，结果手术创伤或创伤治愈后，不能恢复切断神经的功能，大多会留有后遗症。不能直接吻合的情况下，有时由同一患者部分地切除其功能不太重要的末梢神经，用其自体移植到神经的切断部位。但是，即使采用这种方法，大多也不能充分恢复神经功能，而且在采取移植神经的部分也多见功能低下。
因此，不断进行了大量用管状的医用材料，即人工神经管将切断的末梢神经的断处相互连接，诱导轴突由神经干的中枢侧断处向末梢侧断处再生，沿正确的方向伸长，使之从末梢神经干到达神经肌肉接点或末梢感受器，从而使之恢复功能的尝试。作为人工神经管，以前不断尝试了硅酮、聚乙烯、聚氯乙烯等形成的非多孔性管；拉伸聚四氟乙烯、纤维素等形成的多孔性管；聚丙烯腈或聚砜等形成的半透膜管；生物分解性材料聚乙醇酸、聚乳酸或其共聚物等形成的管；或明胶管；或者来源于动脉或静脉等同种地生物体组织管。但是，在采用这些材料的末梢神经再生实验中，由于生物体的修复受到材料的阻碍，迄今为止能够再生的神经长度再长也不过15mm。另外，再生的神经较细，不仅不能正常地恢复神经形态，大多也不能恢复再生神经的功能。另外，也报道了将神经生长因子NGF填充到管中的先例，但是由于NGF在早期流出、扩散，不能获得优良的效果。
最近，尝试了在胶原管中填充被覆有昆布氨酸和粘连蛋白的胶原纤维得到的人工神经管(Tong，X.，et al.Brain Research 663：155-162(1994))，在神经再生至更长之前的期间内，胶原管不能没有分解地残留，无法获得良好的结果。
另一方面，一直认为脊髓一旦受到损伤就不能再生。由于外伤、肿瘤等使脊髓受到损伤时，受损的脊髓不能再生，丧失损伤部位以下的功能，作为后遗症留有截瘫。但是，最近开始进行证明脊髓也能再生的动物实验，在大白鼠实验中观察到将脊髓锐利地切断，准确地再缝合时，功能恢复，脊髓损伤部位也得到相当地恢复；将部分脊髓呈管状地切除，在该部位埋植肋间神经束，则脊髓的一部分再生，功能也部分恢复；而且将部分脊髓呈管状地切除，并将胎儿的脊髓移植到该部位，则脊髓的功能、形态均得以恢复。确认即使在这种情况下，只有使移植的胎儿脊髓片准确地与各神经突起相对应进行移植时，才出现再生。基于上述发现判断出，即使是脊髓，通过诱导准确地使再生组织的区域一致，也能够引起脊髓的再生，但是实际上根本没有开发出能够使脊髓再生的人工脊髓管。
因此，期望开发一种人工神经管，能够控制生物体内分解速度，使之在生物体内残留至神经再生之前，由于在进行神经再生的同时在生物体内分解吸收，神经再生后，不压迫再生神经，诱导由切断的神经断处再生的轴突沿正确的方向伸长，通过促进由生物体侵入毛细血管，引起早期的血流恢复，促进神经组织再生。另外，还期望开发一种不仅连接末梢神经，还连接脊髓的缺损部分，使脊髓组织准确地再生，促进功能恢复的人工脊髓管。发明内容
本发明是由生物体内分解吸收性材料形成的管(10、20)的内腔中具有微细纤维化胶原体(30)的人工神经管，其特征在于该微细纤维化胶原体的空隙中填充有昆布氨酸。
本发明还涉及人工神经管的制备方法，其特征在于准备由生物体内分解吸收性材料形成的管(10、20)；向该管的内腔中导入胶原的盐酸溶液；冷冻；冷冻干燥形成微细纤维化胶原体(30)；对该内腔中具有微细纤维化胶原体的管实施热交联处理；然后向该微细纤维化胶原体中导入昆布氨酸。附图说明
图1是表示本发明人工神经管的一种实施方式的剖面图(示意性的表示其结构，尺寸并非实际的尺寸。另外，符号30指示的部分为实体，为了便于说明省略了斜线)。
图2是表示类型-1的本发明人工神经管结构(剖面)的照片(SEM照片)。
图3是表示类型-2的本发明人工神经管的管基材结构(表面)的照片(SEM照片)。
图4是本发明人工神经管的管内腔中存在的微细纤维化胶原体结构(剖面)的照片(SEM照片)。
其中，11、21：(由生物体内分解吸收性材料形成的)管；12、13：(明胶)被覆层；22、23：(胶原)被覆层；30：微细纤维化胶原体。具体实施方式
构成本发明的人工神经管的管(10、20)长度以及内径根据神经切断部分的长度和粗细有所不同，例如为了包覆坐骨神经(以猫为例)上约25mm的缺损部位，长度为约28～35mm，优选约30mm，内径为约1～8mm，优选约4mm。另外，本发明的人工神经管用作人工脊髓管时，该管的长度最好根据切断部分的长度确定，另外其内径优选为约2～12mm，特别是约10mm。
为了防止生物体细胞由管外侵入，构成本发明人工神经管的生物体内分解吸收性材料形成的管(10、20)，在切断的神经再生直到切断的部位再结合的期间(约1～3个月)，必须保持管的形状，因此必须具有生物体内分解吸收性，同时在某种程度的期间内，能够在生物体内维持其形状。作为这种材料的基材，例如由聚乙醇酸、聚乳酸、乙醇酸和乳酸的共聚物、乳酸和ε-己内酯的共聚物、polydioxanone以及乙醇酸和三亚甲基碳酸酯的共聚物中选择的材料形成的网状材料，其中优选聚乙醇酸形成的网状管。另外，除上述网状管以外，微细纤维化胶原形成的管也可以很好地使用。
首先，记载本发明的人工神经管(以下称为“类型-1”)，其生物体内分解吸收性材料形成的管至少在聚乙醇酸等材料形成的网状管(11)的外面具有明胶或胶原形成的被覆层(13、23)。聚乙醇酸等材料形成的网状管(11)为了在生物体内保持其管状的形状约1～3个月，该管的厚度(作为筒体的管的壁厚，以下相同)优选约0.1～3mm，特别是约0.5～2mm。如果厚度超过约3mm，则会阻碍生物体组织的再生，如果厚度低于约0.1mm，则管的分解吸收过早，其形状不能维持到神经完成再生。另外，本发明的人工神经管用作人工脊髓管时，其厚度优选为约0.2～5mm，特别是约0.5～3mm。
上述管的基材为聚乙醇酸等材料时，为了给自身为疏水性的基材赋予透水性，将该基材制成网状。该网状管(11)的网眼孔径优选为约5～30μm，特别是10～20μm。网眼孔径如果低于约5μm，则细胞和组织不能增殖，如果超过约30μm，则组织的进入变得过剩。
另外，由于该材料自身没有促进组织再生的作用，至少使作为基材的管(11)的外面具备由具有组织再生促进作用的材料形成的被覆层(13、23)，优选在该作为基材的管的内外两面以及网眼内部均被覆或填充该具有组织再生促进作用的材料。被覆层(13、23和/或12、22)的厚度，优选为约0.2～5mm，特别是约0.5～3mm。作为这种具有组织再生促进作用的材料，例如具有透水性，即使用于生物体也不会引起异物反应，生物体亲和性和组织相容性优良，具有促进组织再生作用的胶原或明胶。作为胶原的原料，可以使用以前一直使用的各种来源于动物的胶原，优选例如来源于牛、猪、兔、羊、袋鼠、鸟等动物的皮肤、骨、软骨、腱、脏器等的可用酸、碱、酶等溶化的I型胶原，或I型与III型的混合胶原。这种胶原形成的被覆层是胶原分子分散的无定形结构的层。明胶形成的被覆层，能够以日本药典的纯化明胶作为原料。
本发明的人工神经管中，生物体内分解吸收性材料形成的管基材除上述聚乙醇酸等材料形成的网状管(11)之外，也可以是以具有组织再生促进作用的胶原作为原料得到的微细纤维化胶原形成的管(21)。以下，记载本发明的人工神经管(以下称为“类型-2”)，其生物体内分解吸收性材料为微细纤维化胶原形成的管，而且至少在该管的外面具有的被覆层(23和/或22)为胶原形成的被覆层。
作为用作该管基材原料的胶原，与类型-1的人工神经管的被覆层原料同样，优选以前一直使用的各种来源于动物的可用酸、碱、酶等溶化的I型胶原，或I型与III型的混合胶原。该微细纤维化胶原形成的材料是胶原分子形成的微细纤维多层重叠而成的无纺布状多元结构体(详细地说，以数个胶原分子形成的直径3～7nm的超微细纤维作为其基本单位，该超微细纤维集成束形成直径30～70nm的微细纤维，该微细纤维再集成束形成直径1～3μm的细纤维，接着将该细纤维的束纵横相错地层叠形成直径5～8μm的纤维，然后该纤维沿同轴方向重合形成直径20～50μm的板状纤维。最后该板状纤维11随机络合形成作为最大单位的纤维性胶原。参见图2)基质或者用丝状物织成或编成的物质，以其为材料的管(21)具有与类型-1的人工神经管的管(11)同样的内径和长度。其厚度优选为约0.5～5mm，特别是约1～2mm，另外本发明的人工神经管用作人工脊髓管时，其厚度优选为约0.5～5mm，特别是约1～3mm。另外，至少在该管(21)的外面形成的由胶原构成的被覆层(23和/或22)与作为基材的微细纤维化胶原形成的无纺布状多元结构体同样，以以前一直使用的各种来源于动物的可溶化的I型胶原或I型与III型的混合胶原作为原料。但是，作为形态，是胶原分子分散的无定形结构的层。另外，其被覆层的厚度优选为约0.1～2mm，特别是0.5～1mm。
本发明的人工神经管是在以上详细记载的生物体内分解吸收性材料形成的管(10、20)的内腔中具有微细纤维化胶原体(30)的人工神经管，其中该微细纤维化胶原体的空隙中填充有昆布氨酸(其中，该微细纤维化胶原体是与作为管基材的微细纤维化胶原形成的无纺布状多元结构体实质上结构相同的物质。参见图3)。如果将该人工神经管用于生物体，将该微细纤维化胶原体用作神经纤维再生的脚手架，不断再生、伸展(另外，在神经纤维再生、伸展的过程中，该微细纤维化胶原体一点点消化、消灭)。
作为优选的实施方式，生物体内分解吸收性材料形成的管基材(11或21)为聚乙醇酸的筒状网构成的管(11)，该管的被覆层(23和/或22)为无定形胶原构成的物质。
以下，记载本发明人工神经管的制备方法。
首先，制备类型-1的人工神经管时，先以聚乙醇酸等作为材料，制作网状的管(11)。可以采用任何一种方法，例如将聚乙醇酸等的纤维(例如直径0.1mm的纤维)编成筒状，得到具有上述厚度的网状管。在制得的网状管(11)上涂覆上述胶原或明胶溶液，或者将其浸渍在该溶液中(以下将这种涂覆或浸渍称为“被覆”)，然后通过风干，在网状管(11)的至少外面以及网眼内部形成胶原或明胶被覆层(13、23和/或12、22)(仅在该网状管的外面和网眼内部形成该胶原或明胶被覆层时，可以在该胶原或明胶溶液的被覆之前，向该网状管的内腔中插入与该网状管的内面吻合的聚四氟乙烯等制的棒)。形成该胶原或明胶被覆层时，优选使用含有约1～3重量％，特别是约1～2重量％胶原的约1N盐酸溶液(pH约3)，或约2～30重量％，优选约10～20重量％的明胶水溶液。另外，对于这种类型的人工神经管，为了赋予网状管(11)亲水性，在其表面进行等离子体放电、臭氧照射等亲水化处理后，再用胶原或明胶被覆较为理想。
另一方面，制备类型-2的人工神经管时，使用与管内面相吻合的，例如直径为约1～8mm，优选约4mm的聚四氟乙烯等制成的棒作为芯材。另外，本发明的人工神经管用作人工脊髓管时，优选使用直径为约2～12mm，特别是约10mm的棒作为芯材。将其浸渍于含有优选约0.5～3重量％，特别是1～2重量％胶原的约1N盐酸溶液中，在该芯材的表面形成厚度优选为约5～20mm，特别是约10mm的胶原盐酸溶液层，将其冷冻(例如在约0℃下约12小时)。另外，本发明的人工神经管用作人工脊髓管时，形成厚度优选为约5～30mm，特别是约20mm的胶原盐酸溶液层，将其冷冻。通过冷冻，在盐酸溶液中分散的胶原分子之间形成微细的冰，胶原盐酸溶液发生层分离，而且通过胶原分子重排，使胶原微细纤维化。其次，将其在真空条件下冷冻干燥(例如在约0℃下约24小时)。通过冷冻干燥，胶原分子间微细的冰气化，同时得到胶原的微细纤维多层重叠而成的无纺布状胶原层形成的管。
其次，将其上形成了该微细纤维化胶原层的芯材装入聚乙烯等制成的袋中，密闭，脱气，或者不进行脱气将该微细纤维化胶原层机械地压碎，压缩胶原层。通过压缩，得到密度高的微细纤维化胶原层(21)。进行该压缩操作使压缩后的该微细纤维化胶原层的厚度优选达到约0.5～5mm，特别是约1～2mm，用作人工脊髓管时，优选使厚度达到约0.5～5mm，特别是1～3mm。另外，作为微细纤维化胶原形成的管，使用胶原的丝状物织成或编成物质时，不形成上述胶原盐酸溶液层，首先由上述胶原盐酸溶液湿式纺丝制作胶原的丝状物，将其织成、编成筒状，并冷冻，此后进行相同的操作即可。
至少在这样形成的压缩微细纤维化胶原层(21)的外面进一步形成胶原被覆层(23和/或22)。通过形成这些胶原被覆层(23和/或22)，得到具有更高强度的由生物体内分解吸收性材料形成的管(20)。为了形成这些胶原被覆层(23和/或22)，将由上述芯棒取下的微细纤维化胶原层(21)形成的管再次涂覆含有优选约0.5～3重量％，特别是约1～2重量％胶原的约1N盐酸溶液或浸渍于该胶原盐酸溶液中，至少在微细纤维化胶原层(21)的外面形成胶原盐酸溶液层，将其风干。反复进行这种浸渍和风干操作数次，优选5～20次，形成胶原分子分散的无定形结构的胶原被覆层(23和/或22)(胶原盐酸溶液层的厚度作为整体分别优选为约0.2～1.0mm，特别是约0.5mm)。本发明的人工神经管用作人工脊髓管时，其厚度相同。
这样制得的管(20)与仅由压缩微细纤维化胶原层(21)构成的管相比，具有较高的撕裂强度(这是由于无定形胶原一部分进入该压缩微细纤维化胶原层，而且该压缩微细纤维化胶原层与该胶原被覆层的界面中的一部分胶原溶解、析出)，因此易于操作，容易与神经缝合。
在如上所述制得的由生物体分解吸收性材料形成的管(10，20)的内腔中形成微细纤维化胶原体(30)。为了形成该微细纤维化胶原体(30)，除不进行芯材的装填和压缩操作，与类型-2的管(21)的形成同样进行即可。必要的是，以管(10)或管(20)作为某种模，使上述胶原盐酸溶液流入这些管的内腔中，冷冻，冷冻干燥即可。
另外，在形成该微细纤维化胶原体(30)之前，为了赋予胶原或明胶被覆层(13、23和/或12、22)以及压缩微细纤维化胶原形成的管(21)耐水溶性，进行交联处理(类型-2的场合，也可以在制备管(21)后，被覆层(23和/或22)形成前进行这种交联处理)。这种交联处理使本发明的人工神经管在末梢神经完成再生之前的期间保持其管状的形状，对于防止细胞由神经管外侵入也是有利的。
交联处理根据需要再生的神经切断部位的长度有所不同(由于赋予管在生物体内的形状保持功能成为速度限制)，进行交联使之用于生物体后，保持管状的形状1～3个月。作为交联方法，例如γ射线交联、紫外线交联、电子射线交联、热脱水交联、戊二醛交联、环氧交联以及水溶性碳化二亚胺，优选容易控制交联程度，即使进行交联处理也不会给生物体带来影响的热脱水交联。交联处理在真空条件下，例如约105～150℃，优选约120～150℃，特别优选约140℃的温度下，进行例如约6～24小时，优选约6～12小时，特别优选约12小时。
最终，向上述微细纤维化胶原体(30)的空隙中填充辅助神经纤维生长的成分，这种成分优选昆布氨酸，特别是人昆布氨酸。作为填充方法，可以采用将昆布氨酸溶解于PBS中，将内腔具有微细纤维化胶原体(30)的管(10、20)浸渍在其中，或者将昆布氨酸的PBS溶液压入该微细纤维化胶原体中等方法进行。其中，基于与微细纤维化胶原体(30)的制作步骤中同样的理由，在该昆布氨酸的填充步骤之前，最好对制得的该微细纤维化胶原体进行交联处理，优选热脱水交联处理。另外，本发明的人工神经管用作人工脊髓管时，除填充该昆布氨酸之外，优选在该微细纤维化胶原体中导入促进神经纤维再生、伸展的附加成分，例如TGF-β等细胞营养/生长因子、自体的以巨噬细胞为主的炎症细胞(通过体外培养得到)或自体、同种或异种的少突神经胶质或许旺细胞等髓磷脂(髓鞘)形成细胞中的至少一种。关于这些附加成分的导入方法，按照常规方法进行即可。填充、导入这些神经再生、伸展辅助成分后，将整体风干，即完成本发明人工神经管的制备(当然，并不意味着不进行在市场流通所必需的操作，例如包装或杀菌等)。
如上所述制备的人工神经管可以通过将由于外伤或外科手术等切断的神经的两个断处插入该人工神经管中，并将该部分结扎，用于诱导轴突再生，沿正确的方向伸长，使轴突由末梢神经干到达神经肌肉接点或末梢感受器，使之恢复功能。另外，认为在由于外伤等造成脊髓损伤时，也可以取下损伤部位的椎骨，用该人工神经管包覆脊髓的损伤部位，使受损的脊髓再生，恢复其功能。
以下结合实施例和比较例更详细地说明本发明，但是这些实施例并不能限定本发明。实施例
将聚乙醇酸(PGA)纤维(φ：0.1mm)编成筒状，准备长度约10mm，内径约4～5mm，厚度约1mm的聚乙醇酸网状管(网眼孔径：约10～20μm)，通过等离子体放电处理对其表面进行亲水化，然后，浸渍于含有来源于猪皮的1.0重量％酶可溶性胶原的1N盐酸溶液中，接着风干，从而用该胶原盐酸溶液被覆网状管的内外面(当然，该胶原盐酸溶液也填充到其网眼内部。其中，浸渍、风干操作反复进行10次)。
其次，对其内外面具有上述胶原被覆层的管实施热脱水交联处理(140℃×24hr)后，使上述胶原盐酸溶液流入其内腔，将其冷冻(-20℃×24hr)，冷冻干燥(真空条件下，-80℃×48hr)，然后，再次进行热脱水交联处理(140℃×24hr)。
将内腔具有这样得到的交联处理后的微细纤维化胶原体的上述管浸渍于人昆布氨酸的PBS溶液(浓度：10μg/ml)(10min)，然后风干(该操作的次数：3次)，得到本发明的人工神经管(类型-1)。
切除狗(体重10kg)的总腓骨神经80mm，将两侧的神经断处插入上述人工神经管中，将该人工神经管与该神经断处的重叠部分用10-0尼龙丝结扎，随时间经过进行评价。比较例
将预先进行了热脱水交联处理(140℃×24hr)的来源于猪皮的酶可溶性胶原的纤维(φ：约5μm)浸渍于人昆布氨酸的PBS溶液(浓度：10μg/ml)中，然后风干(该操作的次数：3次)，得到昆布氨酸被覆胶原的纤维约80根，将其插入内外面具有胶原被覆层的上述PGA网状管的内腔中，使之实质上与该管的轴线平行，得到人工神经管，使用该人工神经管与实施例同样进行观察。观察结果
比较例的场合，在手术后1个月，确认静止时患侧后肢的姿势异常，步行时为跛行步态，在手术后3个月，确认大部分被测体仍有上述姿势以及步行异常的延迟。与此相对，实施例中，确认手术后1个月的相同功能异常的轻症状化，手术后3个月，两者均几乎消失。在电生理学的研究中，表示感觉神经恢复的躯体感觉诱发电位(SEP)、表示运动神经恢复的多相肌肉活动电位(CMAP)由手术刚结束后的反应消失至再次诱发的时间缩短，也促进了术后3个月的恢复度(Recovery index)。工业实用性
本发明的人工神经管可以在神经完成再生之前的期间内维持其形状，另外由于能够诱导、促进神经的再生，与以前的人工神经管相比，切断的神经更快、更长地再生，再生的神经状态也更接近正常，神经功能的恢复也良好。另外，也可以作为用于受损的脊髓再生、恢复的人工脊髓管使用。