马属动物抗人、禽流感免疫球蛋白的 制备及其药物制剂 技术领域：
本发明提供一种马属动物抗人、禽流感免疫球蛋白的制备及其药物制剂，特别用于预防和治疗H1、H2、H3、H5、H7亚型流感病毒(InfluenzaVirus)感染的疾病，属于流行性感冒疾病的预防和治疗技术领域。
背景技术：
流感是一种古老的传染病。从1918年世界上出现第一次流感大流行后，在世界范围内又先后出现过四次流感大流行，造成几千万人的死亡，元凶分别是H1N1(1918)、H2N2(1957)、H3N2(1968)、H1N1(1977)、H5N1(1997)。人们虽然采取了多种防制措施，但流感的发生与流行依然没有得到有效控制。
1997年禽流感病毒(H5N1)感染人的事件发生之前，人们普遍认为流感病毒具有极为严格的宿主特异性，禽类的流感不会直接跨越种间屏障感染猪以外的哺乳动物，而必须通过中间混合器—猪体进行基因重组获得感染人的能力。近年来先后发生的H5N1、H9N2、H7N7感染人的事件，表明禽流感病毒有直接感染哺乳动物的能力，并可能在人类引发大流行。特别是自2003年12月以来，在韩国、日本、越南、泰国和中国等东南亚各国相继爆发了A型H5N1亚型流感病毒引起的高致病性禽流感，而且继1997香港“禽流感”事件后再次出现了H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染人的事件。据世界卫生组织调查统计，截至2004年2月6日，越南、泰国已有20人确诊被高致病性禽流感病毒感染，并已有16人死亡，病死率高达80％。有关专家警告，禽流感将比非典对人更具有威胁性。
目前，在流感预防与治疗方面，主要通过下列手段：①灭活疫苗：是通过流感病毒全病毒或亚病毒体成分的灭活制剂，对人群地保护力为60％-70％，疫苗效果取决于接种者的年龄和免疫能力，也取决于所用疫苗中所含毒株与当年流行的毒株是否相配。②活疫苗：是一种减毒疫苗，为单价、二价和多价疫苗，可经鼻腔喷雾引起上呼吸道轻微感染而产生免疫力，保护力有时可达85％，但存在潜在的致病危险。③基因疫苗：又称DNA疫苗，一般需构建流感抗原的重组体，主要包括HA、NA、NP基因，以各种方式导入体内，基因表达产物可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。但价格较高。疫苗免疫的共同特点是保护力持久，但产生需要一定的时间，不能立即提供保护。④抗流感病毒药物：金刚烷胺和金刚乙胺，是通过阻抑M2来抑制A型流感病毒进入细胞，对预防A型流感具有一定的作用，对B型流感病毒无效，有明显的头晕、嗜睡、失眠甚至共济失调等副作用，限制了其在临床上的应用；利巴韦林，属广谱抗病毒药，但对流感病毒的选择性差和血红蛋白下降等副作用限制了其在临床上对流感的作用；新型抗流感病毒药物----神经氨酸酶抑制剂，能选择性地抑制A型、B型流感病毒的神经氨酸酶活性，抑制病毒从感染细胞的释放，从而阻止流感病毒的传播，但在临床应用上常见有鼻部不适、腹泻、恶心、头痛、支气管炎等副作用。
病毒抗原刺激机体免疫系统可产生多种特异性抗体(IgA、IgG、IgM)，血清中最主要的中和抗体是IgG。抗体与病毒结合后能覆盖病毒吸附位点，使病毒不能吸附和穿入易感细胞，从而丧失感染力。目前国内外已有多种抗细菌毒素、抗病毒血清或免疫球蛋白制剂应用于临床，用于疾病的紧急预防与治疗，如抗狂犬病血清、破伤风抗毒素血清、白喉抗毒素血清等。经检索未见有关马属动物抗人、禽流感的免疫球蛋白的制备及其药物制剂的文献报道。
发明内容：
本发明的目的旨在提供一种马属动物抗人、禽流感的免疫球蛋白的制备工艺，适用于工业化生产。
本发明还提供了上述免疫球蛋白所研制成的药物制剂，用于预防和治疗H1、H2、H3、H5、H7亚型流感病毒感染的流行性感冒。
本发明的技术实施方案如下：
1.免疫血浆制备：用国家标准流感病毒H1、H2、H3、H5、H7亚型毒株经组织培养、提纯、浓缩、灭活后，由各亚型毒株单独或联合免疫马属动物而获得的免疫血浆。
2.抗体提取与精制：经胃酶消化、硫酸胺盐析等常规制备工艺，从免疫血浆中提取特异性免疫球蛋白IgG F(ab’)2。
3.半成品与成品标准检测：精制马属动物流感病毒免疫球蛋白制剂半成品经无菌检验、热原质检验、化学物质测定后，按国家规程要求进行调整，制成成品。
马属动物抗人、禽流感免疫球蛋白的具体制备方法包括以下步骤：
a.用国家标准流感病毒H1、H2、H3、H5、H7亚型毒株通过SPF鸡胚培养增殖，回收鸡胚尿囊液进行收毒，病毒经差速离心及密度梯度离心进行提纯、浓缩，经福尔马林灭活后加入弗氏完全与不完全佐剂，制成免疫抗原；
b.挑选健康马匹，经过基础免疫、超免疫后采血，分离血浆；将分离的免疫血浆用2～4倍注射用水稀释，调节pH至3.2～3.6，加入胃酶适量及甲苯0.2％～0.4％(ml/ml)，于29～31℃消化1～1.5小时；
每100ml消化液加硫酸铵14～16g，调节pH至4.8～5.6，加温至55℃左右，保持30分钟；加温终了，迅速降温至45℃以下，离心5000rpm，10min，取清液；上述清液调节pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸铵19～21g，离心5000rpm，10min，取沉淀，压干；上述沉淀用水稀释至蛋白含量不超过2％(g/ml)，加明矾不少于0.8％(g/ml)，调节pH至7.7～7.9，离心5000rpm，10min，取清液；将上述清液按100ml加硫酸铵38g，分离，取沉淀，压干。沉淀物透析至硫酸铵含量0.1％(g/ml)以下；调整固体总量不超过20％(g/ml)、蛋白含量不超过17％(g/ml)，加氯化钠使最终含量为0.9％(g/ml)，加三氯甲烷使最终含量为0.5％(ml/ml)或硫柳汞液使最终含量为0.01％(g/ml)。
所述的马属动物包括：马、驴及其杂交后代。
本发明利用动物免疫方法生产抗病毒血清制成被动免疫制剂，使用后可使机体立即获得免疫保护能力，用于预防和治疗H1、H2、H3、H5、H7亚型病毒(Influenza Virus)感染的人、禽流感疾病，具有疗效显著，药效作用迅速与无毒副作用的特点，药物制剂容易保存，便于运输，保质期限长，生产工艺简单，适合于工业化生产。
为表明本发明在紧急预防和治疗H1、H2、H3、H5、H7亚型病毒(Influenza Virus)感染的流感疾病，通过以下试验给予证明：
首先，以小白鼠为H1、H2、H3、H5和H7亚型流感病毒感染的动物模型，以死亡、体重减轻、检出病毒或检出抗体为判定标准，将其分为治愈、有效、显效和无效四个等级进行统计，用所制备的精致免疫球蛋白进行小鼠的H1、H2、H3、H5和H7亚型流感病毒的紧急预防与治疗实验，预防用量为每鼠肌注0.5U，治疗肌注1U。
结果如下表：
紧急预防与治疗效果统计
动物 使用 治愈％ 有效％ 显效％ 无效％
小白鼠 预防 80 20 0 0
(18-20g) 治疗 70 20 10 0
综上所述，马属动物抗人、禽流感免疫球蛋白在紧急预防和治疗由H1、H2、H3、H5和H7亚型病毒引起的流感具有显著的疗效。
具体实施方式：
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1
1.免疫血浆制备
a.抗原制备：用国家标准流感病毒H1、H2、H3、H5、H7亚型毒株接种SPF鸡胚(9-11日龄)，培养增殖病毒，72h回收鸡胚尿囊液进行收毒。用HA方法检测病毒毒力，病毒血凝价应达到1∶27-10。病毒经差速离心(5000rpm/min 30min，25000rpm/min 2.5h)及蔗糖密度梯度离心进行提纯、浓缩，经2‰-4‰福尔马林灭活后加入弗氏完全或不完全佐剂，制成免疫抗原。
弗氏完全佐剂抗原：
抗原∶羊毛脂∶石腊油＝3∶1∶2，加卡介苗达0.4-0.6mg/mL
弗氏不完全佐剂抗原：
抗原∶羊毛脂∶石腊油＝3∶1∶2
b.免疫血浆制备：按《中国生物制品规程》中《生物制品生产用马匹检疫及管理规程》的规定，挑选健康马匹(无马传染性贫血、马鼻疽、布氏杆菌病、马副伤寒性流产及其他传染病)，经过基础免疫、超免疫后采血，分离血浆。免疫采取皮下、肌肉、皮内、静泳、腹腔等途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。采用“多点分散，每点少量”的原则。
基础免疫：采用二针次，首免用弗氏完全佐剂抗原，二免用弗氏不完全佐剂抗原。每次免疫前采少量马血测定抗体情况。
注射剂量及时间：第1天2mL，第7天2.5mL
超免疫：采用五针次免疫，用弗氏不完全佐剂抗原。每次免疫前采少量马血测定抗体情况。
注射剂量及时间：
第1针：第14天 3-5mL
第2针：第20-22天 3-10mL
第3针：第26-28天 3-10mL
第4针：第32-34天 4-20mL
第5针：第38-40天 4-20mL
采血：于末次免疫后第8-15天进行采血，采血量按16-19mL/千克体重，隔天后再采1次。马血以枸椽酸钠抗凝分离血浆。
休息10-15天后可进行下程免疫。下程免疫一般采用二针次或三针次免疫。每个针次间隔8-15天，免疫抗原用灭活病毒原液10-30mL。
2.抗体提取与精制：
a.将分离的免疫血浆用2～4倍水稀释，调节pH至3.2～3.6，加入胃酶适量及甲苯0.2％～0.4％(ml/ml)，于29～31℃消化1～1.5小时。
b.每100ml消化液加硫酸铵14～16g，调节pH至4.8～5.6，加温至55℃左右，保持30分钟。加温终了，迅速降温至45℃以下，离心5000rpm，10min，取清液。
c.上述清液调节pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸铵19～21g，离心5000rpm，10min，取沉淀，压干。
d.上述沉淀用水稀释至蛋白含量不超过2％(g/ml)，加明矾不少于0.8％(g/ml)，调节pH至7.7～7.9，离心5000rpm，10min，取清液。
e.将上述清液按100ml加硫酸铵38g，分离，取沉淀，压干。沉淀物透析至硫酸铵含量0.1％(g/ml)以下。进行中和实验检测抗体效价。
3.半成品与成品标准检测：
a.调整固体总量不超过20％(g/ml)、蛋白含量不超过17％(g/ml)，加氯化钠使最终含量为0.9％(g/ml)，加三氯甲烷使最终含量为0.5％(ml/ml)或硫柳汞液使最终含量为0.01％(g/ml)为防腐剂。用于制造冻干产品者只用三氯甲烷为防腐剂。调节pH至6.0～7.0。
b.上述制品经除菌过滤及半成品检定合格后，可用冻干法制成精制免疫球蛋白干燥制品。
c.精制免疫球蛋白成品要求是：液体精制免疫球蛋白以及冻干制品按规定量溶解后，固体总量不得超过20％(g/ml)，蛋白含量不得超过17％(g/ml)，pH值应为6.0～7.0，氯化钠含量应为0.85％～0.95％(g/ml)，硫酸铵含量不得超过0.1％(g/ml)，液体精制免疫球蛋白的防腐剂，用三氯甲烷者不得超过0.5％(mlg/ml)，用硫柳汞者不得超过0.01％(g/ml)，冻干精制免疫球蛋白水分含量不得超过3％。将样品稀释至2％蛋白浓度，做琼脂糖电泳分析，应不含或仅含痕量白蛋白迁移率的蛋白。用SDS-PAGE法，预防用F(ab’)2含量不得低于50％，治疗用F(ab’)2含量不得低于60％。对H1、H2、H3、H5、H7的中和抗体效价不低于1∶2048。
实施例2 注射剂
取实施例1制备的免疫球蛋白100g加注射用水制成5％的水溶液，用微孔滤膜(φ0.20μm)滤过至澄明，灭菌，无菌分装，每瓶10ml，封口，即得。
实施例3 口服胶囊
取实施例1制备的免疫球蛋白1kg，药用淀粉0.5kg，用80％乙醇湿法制粒，整粒，装2#胶囊，每粒0.2g。其他项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊项下。
实施例4 滴鼻剂
取实施例1制备的免疫球蛋白100g加注射用水制成5％水溶液，加透皮剂，经微孔滤膜(φ0.20μm)滤过除菌，无菌分装滴鼻瓶，每瓶5ml。其他项目应符合中华人民共和国药典2000年版滴鼻剂项下。