携带SV40增强子元件的DNA疫苗载体.pdf

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明进行详细的描述，但本领域的技术人员应
理解，下述实施例是意图解释本发明，而不应以任何形式理解为意图限制
本发明的范围。

本实验所使用的实验材料：pVRC2000是由美国国立卫生研究院疫苗
研究中心Gary Nable教授惠赠的DNA疫苗载体，其结构见图2，携带该
载体的大肠杆菌保藏在CGMCC，保藏号为1088。携带遗传密码优化的HIV
B’/C重组毒株CN54gag基因的质粒pCRScript-gpnef由本实验室和德
国雷根斯堡大学微生物研究所共同构建，转化该质粒的大肠杆菌
DH5α/pCRScript-gpnef已保藏在CGMCC，保藏号为1003。Pyrobest DNA
Polymerase高可信度高温聚合酶和dNTP混合物为Takara公司产品；T4
DNA连接酶为New England Biolabs公司产品；各种限制性内切酶均为
Takara公司产品；琼脂糖(Agarose)、低熔点琼脂糖、十二烷基硫酸钠(SDS)
均为GIBCO BRL公司产品；酵母粉，胰蛋白胨为Amersham公司产品；2-
巯基乙醇(2-ME)、丙烯酰胺和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为Fluka公司
产品；Tris碱、高分子量标准蛋白为Promega公司产品；质粒小量提取
试剂盒E.Z.N.A.Plasmid Miniprep KitI为Omega公司；凝胶回收试剂
盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit为Omega公司；PCR产物纯化试剂盒
E.Z.N.A Cycle-Pure Kit为Omega公司产品；Lipofectin2000质粒转染
试剂盒为Invitrogen公司产品；用于制备无内毒素质粒DNA的试剂盒
Qiagen Giga Endo-Free Prep kit为Qiagen公司产品；小鼠IFN-γ和
IL-5 ELISA试剂盒为晶美公司产品；大肠杆菌Top10为Invitrogen公司
产品；哺乳动物细胞株293T为Invitrogen公司产品；293T培养于含10
％胎牛血清的DMEM培养液中(购于GIBICO公司)，37℃培养；辣根过氧
化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自北京中山公司；辣根过氧化物酶(HRP)
标记羊抗鼠IgG1和辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG2a为Sigma公
司产品；6-8周龄体重18-25克的BALB/c(H-2d)雌性小鼠购自中国药品
生物制品检定所，每组5只，清洁级饲养。

实施例1：DNA疫苗载体pDRVISV1.0的构建

采用PCR技术和亚克隆技术相结合的方法，将72bp单拷贝SV40增
强子序列插入到pVRC2000CMV启动子上游，构建成质粒pDRVISV1.0(构
建流程参见图1)。具体构建过程如下。

以质粒pVRC2000为模板，用引物5’SV40-CMV1
(5’-ggagcctggggactttccacacccattaccgccatgttgacattg-3’(SEQ ID
NO：1))和3’SV40-CMV-SacI(5’-aacagtatagcatgcataagagccaaag
-3’(SEQ ID NO：2))进行PCR扩增，得到的PCR产物命名为SV40-CMV1。
本反应实际上是在CMV启动子上游引入72bp单拷贝SV40增强子的部分序
列(ggagcctggggactttccacacc(SEQ ID NO：3))，经1％琼脂糖凝胶电泳，
用凝胶回收试剂盒回收特异条带DNA(约750bp)。PCR反应体系为：

           10×Pyrobest Buffer                 5μl

           dNTP混合物(各2.5mM)                 5μl

            5’SV40-CMV1(50μM)                   0.5μl

            3’SV40-CMV-SacI(50μM)               0.5μl

            质粒pVRC2000                          0.5μl

            Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)        0.5μl

            ddH₂O                                38μl

反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共4个
循环；94℃30s，68℃30s，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，
然后4℃恒温。

以SV40-CMV1为模板，用引物5’SV40-CMV2
(5’-tgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttcc-3’(SEQ
ID NO：4))和3’SV40-CMV-SacI(5’-aacagtatagcatgcataagagccaaag
-3’(SEQ ID NO：5))进行PCR扩增，PCR产物命名为SV40-CMV2。该反
应实际上是通过引物5’SV40-CMV2引入72bp单拷贝SV40增强子的第二
部分序列(tgcatgctttgcatacttctgcctgctgg(SEQ ID NO：6))，同上经
1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收特异条带DNA(约780bp)。PCR
反应体系为：

         10×Pyrobest Buffer                    5μl

         dNTP混合物(各2.5mM)                    5μl

         5’SV40-CMV2(50μM)                    0.5μl

         3’SV40-CMV-SacI(50μM)                0.5μl

         PCR产物SV40-CMV1                       0.5μl

         Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)         0.5μl

         ddH₂O                                 38μl

反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共4
个循环；94℃30s，68℃30s，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，
然后4℃恒温。

以PCR产物SV40-CMV2为模板，用引物5’SV40-CMV3-EcoRI
(5’-ggaattctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctg-3’(SEQ
ID NO：7))和3’SV40-CMV-SacI(5’-aacagtatagcatgcataagagccaaag
-3’(SEQ ID NO：8))进行PCR扩增，PCR产物命名为SV40-CMV3。本反
应实际上是通过引物5’SV40-CMV2引入了72bp单拷贝SV40增强子的第
三部分序列(tggttgctgactaattgaga(SEQ ID NO：9))，同时在5’端引
入EcoRI限制性酶切位点。PCR产物SV40-CMV3经1％琼脂糖凝胶电泳，用
凝胶回收试剂盒回收纯化(约810bp)。PCR反应体系为：

          10×Pyrobest Buffer                    5μl

          dNTP混合物(各2.5mM)                    5μl

          5’SV40-CMV3-EcoRI(50μM)              0.5μl

          3’SV40-CMV-SacI(50μM)                0.5μl

          PCR产物SV40-CMV2                       0.5μl

          Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)         0.5μl

          ddH₂O                                 38μl

反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共4个循
环；94℃30s，68℃30s，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，然
后4℃恒温。

以质粒pVRC2000为模板，用引物3’PVRC-EcoRI
(5’-ggaattcttggacatgagccaatataaatgtac-3’(SEQ ID NO：10))和
5’PVRC-SacI(5’-tcgctattaccatggtgatgcgg-3’(SEQ ID NO：11))
进行PCR扩增，PCR产物(约4.3kb)命名为pDRVISV1.0-B。PCR反应体
系为：

         10×Pyrobest Buffer                    5μl

         dNTP混合物(各2.5mM)                    5μl

         3’PVRC-EcoRI(50μM)                   0.5μl

         5’PVRC-SacI(50μM)                    0.5μl

         质粒pVRC2000                           0.5μl

         Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)         0.5μl

         ddH₂O                                 38μl

反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，68℃5min，共35个循环；
循环结束后72℃保温7min，然后4℃恒温。

用Takara公司的限制性内切酶EcoRI和SacI对PCR产物SV40-CMV3
和pDRVISV1.0-B分别进行双酶切。

反应体系为：

          10×BufferM                         5μl，

          EcoR I                              2μl

          Sac I                               2μl

          SV40-CMV3(或PDRVISV-1.0-B)          20μl

          ddH₂O                              21μl

反应条件为37℃水浴反应5小时

酶切产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收。
用Biolab公司的T4 DNA Ligase对酶切回收产物SV40-CMV3和
pDRVISV1.0-B进行连接。

反应体系为：

          10×Buffer                          1μl

          T4 DNA Ligase                       1μl

          SV40-CMV3                           5μl

          PDRVISV-1.0-B                       3μl

反应条件为16℃反应4小时。

连接产物转化大肠杆菌Top10感受态。从转化平板上挑取8个菌落接
种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜。碱裂解法提取质粒，
限制性内切酶EcoRI和EcoRV酶切鉴定，筛选正确重组子(结果如图5所
示，正确克隆应该得到大小分别为1664kb和3359kb的两条带)。得到的
正确重组质粒命名为pDRVISV1.0。

反应体系为：

          10×BufferM                          5μl，

          EcoRI                                2μl

          EcoRV                                2μl

          待鉴定质粒                           20μl

          ddH₂O                               21μl

反应条件为37℃水浴反应5小时。

DNA疫苗载体pDRVISV1.0与pVRC2000的区别在于前者在CMV启动子
上游引入了72bp的SV40单拷贝增强子样序列
(tggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctgggg
actttccacacc(SEQ ID NO：12))，并引入EcoRI限制性酶切位点。

实施例2：重组DNA疫苗pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag的构建

以gagwt5SalI(5’-acgcgtcgacgccgccaccatggccgccagggccagcatc
-3’(SEQ ID NO：13))和gags3EcoRV(5’-acgtgatatctcactggctg
ctggggtcgttgcc-3’(SEQ ID NO：14))为引物，通过PCR从质粒
pCRScript-gpnef上扩增得到HIV-1 CN54gag基因(约1.5kb)，SalI
和EcoRV双酶切定向克隆入DNA疫苗载体pVRC2000和pDRVISV1.0，得到
重组DNA疫苗pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag，其构建过程参见图4。

PCR反应体系为：

         10×Pyrobest Buffer                   5μl

         dNTP混合物(各2.5mM)                   5μl

         gagwt5SalI(50μM)                     0.5μl

         gags3EcoRV(50μM)                     0.5μl

         pCRScript-gpnef                       0.5μl

         Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)        0.5μl

         ddH₂O                                38μl

反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共4
个循环；94℃30s，68℃2min，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，
然后4℃恒温。

用限制性内切酶SalI和EcoRV分别酶切鉴定pVRC2000-gag和
pDRVISV1.0-gag(正确的重组质粒酶切后应产生大小分别约为5kb和
1.5kb的两个片段)，鉴定结果正确(图6和图7)。反应体系及反应条件
分别为：

反应体系

          10×BufferH                           5μl

          EcoRV                                 2μl

          SalI                                  2μl

          pVRC2000-gag                          20μl

        ddH₂O                             21μl

反应条件：37℃水浴反应5小时

反应体系

        10×BufferH                        5μl

        EcoRV                              2μl

        SalI                               2μl

        pDRVISV1.0-gag                     20μl

        ddH₂O                             21μl

反应条件：37℃水浴反应5小时

实施例3：pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag免疫接种后所诱导的体液和
细胞免疫反应的比较

用Qiagen Giga Endo-Free Prep kit制备DNA疫苗pVRC2000-gag、
pDRVISV1.0-gag和空DNA疫苗载体质粒DNA，分别溶于生理盐水，配成浓
度为1g/l的质粒溶液。实验组每组5只小鼠(n＝5)，并设空载体对照
和空白对照各5只。采用双侧后腿胫骨前肌注射方法，DNA疫苗免疫组和
载体对照组小鼠注射100g/100l质粒DNA，空白对照组注射100l生理
盐水。初次免疫后间隔2周以同样剂量加强免疫3次。第8周时眼眶采血
获取血清，然后脱颈椎处死，取脾脏，制成单细胞悬液(6×10⁵细胞/ml)。

ELISA检测小鼠血清中HIV-1 Gag特异性抗体，具体检测过程如下：
a)将纯化Gag抗原蛋白(购于北京万泰公司)溶于包被液(0.06M NaHCO₃，
0.02％NaN₃，pH9.6)中，配成0.5ug/ml的溶液，向每个孔中加入200
μl，置冰箱4℃过夜；

b)将包被液倒掉，用PBST(含0.05％Tween-20的1xPBS)洗三遍，每次
5分钟；

c)向每孔加入200μl PBST-BSA(含1％BSA的PBST，BSA购于基因公司)
封闭，37℃2小时；

d)将封闭液倒掉，晾干，用封板胶纸密封，4℃保存待用。

e)用PBST将一抗(即免疫后小鼠血清)做2倍梯度稀释，从1∶100起稀
释至1∶284800(即，1∶100，1∶200，1∶400……1∶284800)，向每孔加
入200μl，每个样品重复2~3个孔，37℃1-2小时；

f)用PBST洗三遍；

g)用PBST或PBST-BSA适当稀释(1∶5000)二抗羊抗鼠IgG抗体(HRPO)；
向每孔加入200μl，

h)37℃1-2小时；

i)用PBST洗三遍，将孔控干；

j)配制底物溶液(邻苯二胺0.4mg/ml)，然后加入0.1μl/ml的30％的
H₂O₂，混匀后向每孔中加200μl，室温放3-10分钟.

k)加入50μl的4M H₂SO₄终止反应，室温放5--10分钟.

l)测450nm处的O.D.值。

结果如图8所示，pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag均诱导了高水平
的特异性抗体，pDRVISV1.0-gag所诱导的抗体水平是pVRC2000-gag诱导
的抗体水平的大约两倍。空载体和阴性对照组均未测到特异性抗体。

定量ELISA对抗体的亚类分析显示两种载体诱导的抗体主要是IgG2a，
参见如图9。实验过程同上，只是将二抗分别换为羊抗鼠IgG1抗体(HRPO)
羊抗鼠IgG2a抗体(HRPO)。

用纯化Gag抗原(购于北京万泰公司)刺激小鼠脾细胞(细胞浓度
5×10⁶/ml，Gag浓度10μg/ml)。用1640培养基(购自Gibico公司)调
各组免疫小鼠的脾细胞数为1×10⁶细胞/毫升。具体刺激条件如下：

a)96孔微量滴定板中每孔加入2×10⁵细胞，每实验组设3个复孔。
总体积为200μl/孔。

b)对应孔中分别加入原核表达纯化抗原P55(购自北京万泰公司)至
终浓度为10μg/ml。

c)37℃5％CO₂孵箱内培养3天，收集上清液测量细胞因子水平

72小时后用购于晶美公司的试剂盒检测培养上清中IFN-γ和IL-4，
评价Gag特异性细胞免疫水平。结果显示，pDRVISV1.0-gag免疫组分泌
的IFN-γ水平明显高于pVRC2000-gag免疫组，但IL-4均低于试剂盒检
测水平(10pg/ml)，参见如图10。两种载体诱生的IgG均以IgG2a为主，
刺激免疫后小鼠脾细胞分泌的细胞因子主要为IFN-γ，提示主要诱生Th1
型免疫反应。

用Gag特异性表位肽(从赛百盛公司合成)(SIRIGPGQTFYATGD(SEQ ID
NO：15)，5μg/ml)刺激小鼠脾淋巴细胞(6×10⁵/ml)，细胞内IFN-γ抗
体染色，用流式细胞仪(购自Beckman公司)检测Gag特异性CD8⁺T细
胞占总CD8⁺T细胞的比例。具体实验过程如下：

1).刺激细胞：

a)根据需要调细胞浓度为4×10⁶细胞/ml(即2×10⁶细胞/500μl/孔)，
所用细胞培养液完全1640购自Gibico公司。

b)配制阳性对照刺激物——取PMA(phorbol myristate acetate，佛波
酯，购于赛百盛公司)使用液(0.1mg/ml溶于DMSO)和Ionomycin
(伊屋诺霉素，购于赛百盛公司)使用液(0.5mg/ml溶于乙醇)溶
于含有20μg/ml rIL-2(购于赛百盛公司)的1640完全培养液，配
制2倍阳性对照刺激物溶液(PMA和Ionomycin浓度分别为50ng/ml
和2μg/ml)。

c)配制多肽刺激物——用含有20μg/ml rIL-2的1640完全培养液配制
Gag特异性表位肽刺激液(肽终浓度为5μg/ml)。

d)按下表每孔分别加入脾脏细胞及刺激物(DMSO含量限制在10μl/ml)：

e)37℃5％CO₂培养1小时。

f)加入BFA(Brefeldin A，蓝菌素，购于赛百盛公司)，终浓度10μg/ml
(2μl/ml，5mg/ml的DMSO储存液)。

g)37℃5％CO₂培养5小时

h)放置4℃或直接染色。

2).细胞染色及流式细胞仪检测

a)将培养物转入1.5ml Eppendorf离心管，450g 4℃离心7分钟。

b)倒掉培养基，加入1ml染色缓冲液FACS缓冲液(PBS+2％FCS(胎牛血
清)+2％NaN₃)洗涤一次

c)450g 4℃离心7分钟，小心吸掉上清。

d)加入100μl含CD⁸/APC，CD⁴/PerCP及CD³/PE标记抗体(购于Pharmingen
公司)的FACS缓冲液中，通常每种抗体含量为2μl/孔(可用FACS缓
冲液配成使用液(使用液浓度40μg/ml)后分装到各管)，轻轻混匀。

e)4℃避光放置15分钟。

f)加入1ml FACS缓冲液洗涤细胞，450g 4℃离心7分钟，小心吸掉上
清。

g)加入100μl的Reagent A(固定剂，购于Caltag公司)重悬细胞。

h)室温避光放置15分钟。

i)加入1ml FACS缓冲液洗涤细胞，450g 4℃离心7分钟，小心吸掉上
清。

j)重悬于50μl含γIFN/Fitc标记抗体(购于Pharmingen公司)的
Reagent B(穿膜剂，购于Caltag公司)中(抗体含量为2μl/孔，
可用Reagent B配成使用液(使用液浓度40μg/ml)后分装到各管)，
轻轻混匀。同种型对照加入抗大鼠的γIFN/Fitc抗体(购于Pharmingen
公司)。

k)室温避光放置15分钟。

1)加入1ml FACS缓冲液洗涤细胞，450g 4℃离心7分钟，小心吸掉上
清。

m)用500μl的固定液(FACS缓冲液+1％甲醛)重悬细胞，准备检测。

n)流式仪检测，FACS计数100,000点。

结果(见图11)表明，pDRVISV1.0-gag免疫所诱导的Gag特异的CD8⁺
T细胞反应(Gag特异的CD8+T细胞占CD8+T细胞总数的3.00％)显著
高于pVRC2000-gag免疫所诱导的Gag特异的CD8⁺T细胞反应(Gag特异
的CD8+T细胞占CD8+T细胞总数的0.68)。

综合动物实验结果，SV40增强子元件显著增强了DNA疫苗的免疫原性，
可以作为优化DNA疫苗的元件。