增强新生儿的器官成熟度并预测重症监护时间 本申请要求2001年7月27日提交的美国临时专利申请No.60/308,143的权益。
本申请中的发明是在国家卫生研究院许可号HD00072和RR06020的基金资助下完成的。美国政府可以享有某些权利。
发明领域
本发明涉及增强人类早产新生儿的器官成熟度，并预测人类早产新生儿在新生儿重症监护病房住院的时间及该期间所需医疗费用。本发明也涉及增加活体系统中IV型胶原的形成。
发明背景
早产是一类主要的医学问题，几十年来一直是产科学和儿科学领域研究的焦点。由于早产涉及到大量经济费用，因此它还是一个主要的社会问题。在美国，早产婴儿(＜37妊娠周)仅占所有活胎产地9％，但花费占所有急诊新生儿重症监护病房(NICU)费用的57％，或每年58亿美元[St.John等，“根据出生时的妊娠龄和存活状态的新生儿监护费用”，182：170-175(2000)]。这一数值超过了所有婴儿总健康监护费用的40％。从出生至15岁的较长时期内，早产后遗症所涉及的后续医疗费用每年都超出54亿，或是所有儿童健康监护费用的10％(Zupancic等，“管理式医疗时代的早产经济学”，Clin.Perinatol.，27(2)：483-497(2000))。因此，每年在早产上的总体社会支出都超过110亿。当然这一数字并不包括由于早产幸存者长期体力、精神障碍及监护他们所需的时间和资源分配导致的直接或间接经济生产率损失，也没有把早产婴孩父母所经历之感情上的痛苦和苦恼计算在内。值得注意的是，大家一致认为美国的早产率正在上升。
对早产婴儿的医疗监护通常缘于早产婴儿身体不成熟，尤其是受其心肺系统不成熟。一旦脱离胎盘，心肺系统就必须能发挥作用，从所吸入的大气气体中提取分子氧，并通过血流将与血红蛋白结合的分子氧运送到全身所有的细胞。除了单纯的支持性干预——如在适当年龄范围维持血液中糖、气体和酸/碱平衡或提供外源性表面活性剂来克服内源性表面活性剂的缺失之外，还有一些干预通过增强婴儿体内的基因活性来加速组织成熟。这些直接使缺失基因在早产婴儿体内表达的药剂主要是皮质激素(corticosteroids)。在早产儿分娩之际，将皮质激素施用于母亲身上，皮质激素由于母亲胎盘的存在而得以调节，可以大大提升娩后早产儿心肺系统的性能水平。
也可以在分娩后将皮质激素施用于新生儿身上，预期出生后施用和出生前施用对心肺系统同样有益。在美国和加拿大平均每4个早产儿中有一个在NICU中使用皮质激素治疗，而且如果出生时体重低于1000克，这一比例超过1/3。因为皮质激素可导致数量多得无法接受的短期及长期并发症，2002年初美国儿科协会和加拿大儿科协会以联合声明建议，早产儿出生后不应再常规使用皮质激素(美国儿科协会和加拿大儿科协会，“出生后应用皮质激素治疗或预防早产儿心肺疾病”，Pediatrics，109：330-338(2002))。对那些在本领域技术人员来说，这是一个极大的进步。这样在本文落笔之时，除了依赖于“糖水、盐和空气”的经典支持性治疗外，新生儿重症监护不能提供给早产儿任何东西。
相应地，引进一种具有加速早产儿生命器官子宫外成熟的潜能的药物就极为迫切了。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及一种增强人类早产新生儿器官成熟度的方法，该方法在可有效增强器官成熟的条件下将生长因子施用于人类早产新生儿。
本发明的另一方面涉及预测人类早产新生儿在新生儿重症监护病房住院的时间及该期间所需医疗费用的方法。该方法包括提供人类早产新生儿的样品，并测定样品中来源于细胞外基质的生物标记物。将样品中生物标记物水平或其比例和标准品相比较，确定人类早产新生儿需在新生儿重症监护病房住院的时间及该期间所需医疗费用。
本发明的一个进一步实施方案涉及增强人类早产新生儿器官成熟度的方法，该方法在可有效增强器官成熟的条件下将编码生长因子的基因施用于人类早产新生儿。
本发明的另一方面涉及增强人类早产新生儿器官成熟度的方法，该方法在能够有效增强器官成熟的条件下将增加生长因子形成的药剂施用于人类早产新生儿。
本发明的另一方面涉及增加活体系统中IV型胶原形成的方法，该方法在能够有效增加IV型胶原形成的条件下，将生长因子、编码生长因子的基因或增加生长因子形成的药剂施用于活体系统。
对于早产新生儿，产后早期施用外源生长激素更为合适。因为众所周知这些病人的人生长激素——胰岛素样生长因子(“hGH-IGF”)系统存在功能缺陷。该缺陷涉及生长激素分子的形成。这些生长激素分子通过常规免疫检测法可以检测得到，但测定其生物效应时发现它并不具有活性。早产儿体内的免疫反应性生长激素至少比具生物活性的生长激素多出10倍(Radetti等，“早产儿及足龄新生儿生命中第一个月期间生长激素、生长激素结合蛋白、胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子结合蛋白的生长激素生物活性和含量”，Arch.Pediatr.Adolesc.Med.，151：170-175(1997)，将其整体在此引入作为参考)。
预测在新生儿重症监护病房住院的时间及该期间所需医疗费用的任何方法，以及通过给予生产激素及其各种同型物和类似物或其相关的次级元件来刺激IV型胶原合成而加速基底膜形成，从而增强新生儿上皮和内皮成熟的任何方法，均是儿科领域中潜在的主要进步标志，是健康监护费用显著降低的标志。如上所述，早产婴儿(妊娠龄＜37周)仅占所有活胎产的9％，但花费占所有急诊初生婴儿重症室(NICU)费用的57％，或每年58亿美元(St.John等，“根据出生时的妊娠龄和存活状态的新生儿监护费用”，Am.J.Obstet.Gynecol.，182：170-175(2000)，将其整体在此引入作为参考)。这一数值占所有婴儿总健康监护费用的40％以上。从出生至15岁的较长时期内，早产后遗症所涉及的后续医疗费用每年都超出54亿之多，或所有儿童健康监护费用的10％[Zupancic等，“管理式护理时代的早产经济学”，Clin.Perinatol.，27(2)：483-497(2000)，将其整体在此引入作为参考]。
附图简述
图1A～D为显示四个儿童夜间脉冲式生长激素分泌(封闭的菱形/粗点区)和基质生物标记物反应(封闭的方形/梯度阴影区；图1A：PICP，I型前胶原C-端前肽；图1B：C-IV，IV型胶原螺旋形域；图1C：PIIINP，III型前胶原N-端前肽；图1D：层粘素-1的P1抗原)之间的典型关系图。早晨皮质醇分泌的生理性上升改变了图1A和B的反应(开放的圆形/细点区)。与生物节律研究的标准数据的表示方法一致，各时间点的各参数以偏离于该参数(平均值＝0％偏差)总夜间均数(％DOM)的百分数来表示。
图2A-C为显示生长激素总量及胶原生物标物记总量的图(图2A：PICP，I型前胶原C-端前肽；图2B：C-IV，IV型胶原螺旋结构域；图2C：PIIINP，III型前胶原N-端前肽)，均通过曲线下面积(AUC)测定法测得，呈剂量-效应关系。
图3为显示生命第一周(fw)内C-IV生物标记和后继新生儿重症监护病房住院时间之关系的Kaplan-Meier图，不考虑第一个七天后给予何种治疗性干预。尽管各组婴儿的平均妊娠龄(GA)无差别，当临界值fwC-IV小于或等于905ng/mL时在NICU住院的平均时间仍明显长于临界值fwC-IV高于905ng/mL者。N表示研究受试者的数目。
图4为显示IV型胶原C-IV生物标记物和层粘连蛋白P1生物标记物之间关系的图。为预测后继NICU住院时间，于生命第一周内测定。每个数据点反映一个早产新生儿。
图5为根据fw基质生物标记测量值精确预测在NICU住院时间的图，用比值[fC-IV+fwPICP/fwP1]表示。每个数据点反映一个早产新生儿。
图6为根据fw基质生物标记测量值精确预测在NICU住院时间的图，用比值[fC-IV+fwPICP/fwP1]表示。每个数据点反映一个早产新生儿。
图7是用一个曲线图显示，根据fw基质生物标记的大小精确预测在NICU住院时间，用fwP1表示。每个数据点反映一个早产新生儿。
图8显示图5-～7中的生物标记参数与新生儿的妊娠龄间无任何联系。
图9为显示涉及IV型胶原C-IV生物标记物和层粘连蛋白P1生物标记物之间关系的图。为预测后继的NICU医生直接服务所致费用，于生命第一周内测定。每个数据点反映一个早产新生儿。
图10为根据fw生物标记测量值精确预测在NICU医生直接服务所致费用、交纳给医院的支持性费用及其总和的图，用比值[fC-IV+fwPICP/fwP1]表示。其中的插图显示生物标记参数与新生儿的妊娠龄间无任何联系。每个数据点反映一个早产新生儿。
图11为根据fw生物标记测量值精确预测在NICU医生直接服务所致费用、交纳给医院的支持性费用及其总和的图，用比值[fwC-IV/fwP1]具体表达。其中的插图显示生物标记参数与新生儿的妊娠龄间无任何联系。每个数据点反映一个早产新生儿。
图12为根据fw生物标记测量值精确预测在NICU医生直接服务所致费用、交纳给医院的支持性费用及其总和的图，用比值fwP1具体表达。其中的插图显示生物标记参数与新生儿的妊娠龄间无任何联系。每个数据点反映一个早产新生儿。
发明详述
本发明的一个实施方案涉及增强人类早产新生儿器官成熟度的方法，该方法是在能够有效增强器官成熟的条件下将生长因子施用于人类早产新生儿。
作为医学应用的一个完整部分，科学上已确定蛋白因子和激素(“介质”)在人体构成及其各种器官发育和功能等方面具有复杂的影响。这些蛋白介质影响细胞生物学及细胞外基质生物学，而细胞外基质是将细胞包埋在其中的复合物质。
人体内，这类介质中最突出的介质包括严格意义上的生长激素及其被认为是从共同前体进化而来的各种同型物和类似物、它们的受体和胰岛素样生长因子(IGFs)之类的相关次级元件。生长激素基因家族的主要成员由17号染色体长臂上的基因编码，其5’至3’顺序如下：严格意义上的生长激素(GH-N)-绒毛膜生长催乳素-A(CS-A)-生长激素变体(GH-V)-绒毛膜生长催乳素-B(CS-B)。另一成员催乳素编码在6号染色体上。包括IGF-1A、IGF-1B和IGF-2在内的IGFs分别由12号和11号染色体上的基因编码。已发现这些介质的大量结合蛋白和受体。hGH-IGH系统的生理学和病理学及它们在应用上和经济学上的分歧是最近一些综述的主题(Smith等编著《人类生长激素，研究与临床应用》中的Bercu等，“生长激素：儿科学关联性”，Humana出版社，Totowa，pp.191-220(2000)。Smith等编著《人类生长激素，研究与临床应用》中的Carroll等“成人中的生长激素缺乏：生长激素替代的原理”，Humana出版社，Totowa，pp.221-232(2000)。Sperling等编著《儿科内分泌学》中的Rosenfeld等“生长激素紊乱/类胰岛素生长因子分泌与作用”，Saunders，Philadelphia，pp.211-288(2002)。DeGroot等编著《内分泌学》中Kopchick“生长激素”，Saunders，Philadelphia，pp.389-404(2001)。将其整体在此引入作为参”)。
细胞外基质是生长激素、生长激素基因家族成员和IGFs之类相关次级元件的主要靶点之一。生长激素的生成及分泌不足经常分导致儿童时期严重身材矮小，在人体生命周期的这一时期生长激素是在身高发育的主要介质。在生命早期，生长激素是调节代谢的关键因子，如血糖水平；而在老年，生产激素主要发挥维持骨密度和防止骨质疏松症的作用(Smith等编著《人类生长激素，研究与临床应用》中的Bercu等“生长激素：儿科学关联性”，Humana出版社，Totowa，pp.191-220(2000)。Sperling等编著《儿科内分泌学》中的Rosenfeld等“生长激素紊乱/类胰岛素生长因子分泌与作用”，Saunders，Philadelphia，pp.211-288(2002)。Smith等编著《人类生长激素，研究与临床应用》中的Baum等“生长激素与骨质疏松”，Humana出版社，Totowa，pp.233-246(2000)。将其整体在此引入作为参考)。
与该活性谱一致，生长激素驱动骨内和骨生长板上的胶原形成。作为细胞外基质的主要蛋白成分，胶原有19种不同类型，在解剖位点有三种类型胶原特别突出，并发现其对生长激素和IGFs具有反应性。它们分别为I型胶原、III型胶原和X型胶原(关于I型胶原与III型胶原的综述参见Vihervuori等，“儿童在生长激素治疗期间胶原形成与降解增加”，Bone，20：133-138(1997)，将其整体及引用的文献资料在此引入作为参考；关于X型胶原综述见Kikkawa等，“佩尔特斯病损伤大鼠模型在发病前类胰岛素生长因子I(IGF-I)和X型胶原表达发生改变”，J.Bone Miner.Res.，15：111-119(2000)，将其整体在此引入作为参考)。实际上，生长激素增强基质形成的活性相当显著，因此可以通过测定起源于细胞外基质的生物标记物尤其是III型胶原，来检测为提高运动能力而滥用的生长激素(Langobardi等，“生长激素(GH)在健康成年人骨质和胶原转化中的作用及其作为检测体育运动GH滥用之标记物的潜力：一项双盲、安慰剂对照研究”，J.Clin.Endocrinol.Metab.，85：1505-1512(2000)，将其整体在此引入作为参考)。通过重组技术生产的生长激素作为药品经常用于增强I、III和X型胶原形成，以提高多种疾病状态下的身高，并改善骨骼结构。这种疾病状态指的是生长障碍，如内源生长激素不足或由遗传因素及医学遗传因素导致的身材矮小(Sperling等编著《儿科内分泌学》中的Rosenfeld等“生长激素紊乱/类胰岛素生长因子分泌与作用”，Saunders，Philadelphia，pp.211-288(2002)，将其整体在此引入作为参考)。对于衰老或感染人免疫缺陷病毒所导致的异化状态，生长激素也显示出不错的疗效(Smith等编著《人类生长激素。研究与临床应用》中的Baum等“生长激素与骨质疏松”，Humana出版社，Totowa，pp.233-246(2000)。将其整体在此引入作为参考)。正如内源生长激素缺乏情况所证实的，生长激素分泌不足与来源于I型和III型胶原的生物标记物水平低下相关。相反，施用外源性生长激素可使来源于I型与III型胶原的生物标记水平显著提高(关于I型胶原与III型胶原的综述参见Vihervuori等，“儿童在生长激素治疗期间胶原形成与降解增加”，Bone，20：133-138(1997)，将其整体及引用的文献资料在此引入作为参考)。
因此，依据本发明，合适的生长因子包括但不限于人17号染色体、12号染色体、11号染色体和6号染色体上基因编码、表达的内分泌生长因子。特别地说，人17号染色体上基因编码的合适生长因子包括hGH-N、hGH-V、绒毛膜生长催乳素-A和绒毛膜生长催乳素-B。人12号染色体上基因编码的合适生长因子包括IGF-1。人11号染色体上基因编码的合适生长因子包括IGF-2。人6号染色体上基因编码的合适生长因子包括催乳素。
依据本发明，合适的生长因子也包括一组基质生长因子，包含人体内不同染色体上基因编码的层粘连蛋白。
在能够有效促进器官成熟的条件下将生长因子施用于早产儿。特别地说，在能够有效增加早产儿器官内基底膜的条件下施用生长因子。另外，在能够有效增加早产儿器官内IV型胶原形成的条件下施用生长因子。
更确切地说，我们发现，在人类中不仅I型胶原和III型胶原，IV型胶原也受hGH-IGF系统控制。I型胶原和III型胶原形成原纤维和纤维，因而其主要存在于暴露于生物机械压力(biomechanical stress)的组织中，而IV型胶原不形成原纤维和纤维。相反，该型胶原形成片层样多聚体，这种多聚体是基底膜的主要成分，基底膜可以锚定形成肺、肠和肾上皮表面及形成心血管系统内皮面的细胞(Zakim等编著《肝脏病学，肝病手册》中的Hanauske-Abel，“肝纤维变性：典型分子元件及其显现出来的作为抗纤维化靶点的作用”，Saunders，Philadelphia(2002)，出版中，将其整体在此引入作为参考”)。这个发现说明如果人体存在与IV型胶原生物标记物水平低下相关的情况，这种情况下，尤其是该情况与hGH-IGF系统功能不足一致时，给予外源性生长激素、其各种同型物和类似物或其相关次级元件就可以得到缓解。意想不到的是，我们已在一类独特的病人中鉴别出这种情况。
生长激素以脉冲的方式分泌入血流中，尤其在睡眠期间(Smith等编著《人类生长激素，研究与临床应用》中的Bercu等，“生长激素：儿科关联性”，Humana出版社，Totowa，pp.191-220(2000)；Sperling等编著《(儿科内分泌学》中的Rosenfeld等“生长激素紊乱/类胰岛素生长因子分泌与作用”，Saunders，Philadelphia，pp.211-288(2002)。将其整体在此引入作为参考)。这种不连续的分泌允许通过检测血清中胶原蛋白或非胶原基质蛋白特异性的生物标记物，在体内监测细胞外基质的应答。如果某一基质生物标记物对生长激素具有感应性，则每个夜间生长激素峰应与一适当的基质生物标记时间峰一致，或时间峰紧随其后。如果无感应性，生长激素水平大而快的波动与基质生物标记水平不相干。该生长激素刺激和基质应答间的普遍联系应更适合于早晨的数小时。众所周知此时抑制基质形成的生长激素强拮抗剂皮质醇的分泌处于激活状态。
因此，可以实现肺、肾、胃肠道、心脏、骨骼肌和血管等的器官成熟。在一个具体的实施方案里，实现了肺的器官成熟。根据本发明，以充分促进器官成熟的剂量施用生长因子。
可以通过吸入、口服、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内，或在粘膜如鼻、咽喉和支气管粘膜上敷药等方式施用生长因子。在一具体的实施方案里，为了完成肺器官成熟，生长因子以吸入方式施用。生长因子可单独施用，也可与药学或生理学容许的载体、赋形剂或稳定剂一起施用；生长因子的施用可以通过固体或液体形式，如粉末、溶液、混悬液或乳剂。
固体单位剂型可以是常规的类型。固体剂型可以是胶囊，如包含生长因子、润滑剂之类载体和乳糖、蔗糖或玉米淀粉之类惰性填充剂的普通明胶胶囊。在另一实施方案中，将生长因子与乳糖、蔗糖或玉米淀粉之类的常规片基质；阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶之类的粘合剂；玉米淀粉、马铃薯淀粉或海藻酸之类的崩解剂；以及硬脂酸或硬脂酸镁之类的润滑剂等合用，制成片剂。
生长因子也可用生理相容性的材料和药用载体稀释成溶液或混悬液以注射剂型给药。这样的载体包括添加或不添加表面活性剂、添加剂、赋形剂或稳定剂的无菌液体，如水和油。举例来说，油来源于石油、动物油、植物油或人工合成的油，比如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、葡萄糖和相关的糖溶液以及丙二醇或聚乙二醇之类的二醇都是优选的液体载体，尤其是对于注射剂溶液来说更是如此。
用作气雾剂时，生长因子可以与适量抛射剂，如丙烷、丁烷或异丁烷之类的烃类抛射剂及常规辅料一起，以溶液或混悬液形式封装在保持一定压力的气雾剂容器中。也可置于雾化器或喷洒器内，以非压力形式施用生长因子。
本发明也涉及预测人类早产新生儿需要在新生儿重症监护病房住院的时间及该期间所需医疗费用的方法。该方法包括提供人类早产新生儿的样品，并测定样品中来源于细胞外基质的生物标记物。将样品中生物标记物水平或其比例和标准品相比较，确定人类早产新生儿需要在新生儿重症监护病房住院的时间及该期间所需医疗费用。
合适的样品包括生物样品，如血浆、血清、尿液、支气管灌洗液和体液药签。
依照本发明的一个实施方案，来源于细胞外基质的生物标记物起源于胶原蛋白。在一个具体的实施方案中，来源于细胞外基质的生物标记物起源于人类早产新生儿器官的IV型胶原。
本发明的另一个实施方案中，细胞外基质的生物标记物起源于非胶原蛋白或粘多糖。在一个具体的实施方案中，来源于细胞外基质的生物标记物起源于人类早产新生儿器官的粘连蛋白。
可用本领域普通技术人员所了解的方法测定这些生物标记物。特别地说，可在任何生物流体中用商品化、高度特异和高度重复性的免疫测定法和/或层析法检测细胞外基质的胶原和非胶原生物标记物。(例子可参见Aghai等，“出生体重极低的早产胎儿的基底膜生物标记物”，Biol.Neonate.，81：16-22(2002)，将其整体在此引入作为参考)。这些产品可购买得到，并可在任何临床实验室中由具备临床化学经验的普通技术人员可靠地使用。一旦样品中的生物标记物得以测定，它们的浓度或其比值即可用在数学公式中估计早产新生儿需要留在NICU的时间及该期间所需费用。对于各生物标记物或生物标记物比值来说，对早产新生儿生物标记物参数与他们需要在NICU住院的时间或NICU里产生的费用之间的关系分别进行常规统计分析，从而研发出各生物标记物或生物标记物比例的近似精确数学公式(“标准”)，方法如下如实施例2所述。
本发明一个进一步的实施方案涉及一种促进早产儿器官成熟的方法，该方法在能够有效增强器官成熟条件下将编码生长因子的基因施用于早产儿。
根据本发明，编码生长因子的基因选自人17号染色体、12号染色体、11号染色体和6号染色体上基因编码的分泌生长因子。在一个具体的实施方案中，生长因子由人17号染色体上的基因编码，并选自hGH-N、hGH-V、绒毛膜生长催乳素-A和绒毛膜生长催乳素-B。在另一个具体的实施方案中，生长因子是由人12号染色体编码的IGF-1。在另一个实施方案中，生长因子是由人11号染色体编码的IGF-2。在一个进一步的实施方案中，生长因子是由6号染色体编码的催乳素。在另一个进一步的实施方案中，编码生长因子的基因编码一种基质生长因子，具体为位于人体内不同染色体上的层粘连蛋白。
编码所需生长因子的基因或cDNA或其片段可以通过基因组文库或cDNA基因文库筛选、PCR扩增而获得。
能够以核酸构建体的方式施用编码生长因子的基因，其方法包括利用常规重组DNA技术将核苷酸分子导入宿主细胞中。通常来说，涉及将核酸分子导入到对核酸分子是异源的表达系统中(如正常情况下不存在的系统)。该异源核酸分子导入的表达系统中包含能够将所插入编码序列转录并翻译的必要元件。除非另作说明，本发明的实施将利用本领域常规技术中的病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术常规方法。这些技术已在文献中得以充分阐述，参见Sambrook等《分子克隆：实验室手册》(1989)、《DNA克隆：实践方法》第I卷和第II卷(D.Glover编著)、《寡核苷酸的合成》(N.Gait编著，最近的版本)；《核苷酸杂交)》(B.Hames和S.Higgins编著，最近的版本)；《基础病毒学》第二版第I和第II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编著)。将其整体在此引入作为参考。
首先将基因序列插入一个合适的核酸载体，能够促进特定的外来或内在基因向哺乳动物宿主的导入。此处“载体”指与适当的操纵元件连接时能进行复制、可在细胞间转移基因序列的任何遗传学元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒颗粒等。因此，该术语包括克隆载体、表达载体和病毒载体。利用本领域内已知的药剂可将核酸分子插入到许多可用的表达载体和细胞系统中。
已用作外源基因在哺乳动物细胞中转导和表达之载体的病毒包括SV40病毒(Innis等，“COS-1细胞中类人猿病毒40-pBR322重组质粒的染色质结构”，Mol.Cell Biol.3(12)：2203-2210(1983)；Okayama等，“用于将cDNA克隆文库转导入哺乳细胞的噬菌体λ载体”，Mol.Cell Biol.，5(5)：1136-1142(1985)。将其整体在此引入作为参考)和牛乳头瘤病毒(Meneguzzi等，“啮齿类成纤维细胞的BPV1-pBR322穿梭质粒在不立即使受体细胞发生明显致瘤转化时的质粒维持”，FEMBO J.，3(2)：365-371(1984)；DiMaio等，“牛乳头状瘤病毒载体作为质粒在小鼠与细菌细胞间传播”，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，79(13)：4030-4034(1982)；Lusky等，“牛乳头瘤病毒维持序列的特征”，Cell，36(2)：391-401(1984)；Giri等，“转染细胞中显示连环遗传之大肠杆菌gpt基因和BPV-1 DNAs表达的对比研究”，Virology，127(2)：385-396(1983)，将其整体在此引入作为参考)，及科莫洛尼氏鼠肉瘤病毒等逆转录病毒(Perkins等，“设计用于表达和转导外源性基因入哺乳动物细胞的逆转录病毒来源载体”，Mol.Cell Biol.，3(6)：1123-1132(1983)；Lee等，“哺乳动物细胞内的具温度敏感性转化功能的禽类fujinami肉留病毒DNA克隆”，J.Virol.，44(1)：401-412(1982)；Curran等，“FBJ鼠骨肉瘤病毒：具生物活性前病毒DNA的分了克隆工鉴定”，J.Virol.，44(2)：674-682(1982)；Gazit等，“用含禽类有核红细胞增多症病毒erb基因的鼠逆转录病毒载体转化哺乳动物细胞”，J.Virol.，60(1)：19-28(1986)。将其整体在此引入作为参考)和基于HIV的病毒。
人们也研发出许多基于腺病毒(Ad)的基因传递系统。人腺病毒是双链DNA病毒，它通过受体介导的胞吞作用进入细胞。这些病毒尤其适合基因治疗，因为它们易于生长和操纵，并且在体内存在广泛的宿主。腺病毒易于高效价地生成，很稳定，因而可以纯化和贮存。即使处于感受态的复制形态，腺病毒也仅产生低水平的致病率，且与人类恶性肿瘤无关。另外，腺病毒可感染分裂与非分裂细胞；而许多基因治疗的靶组织包括大量的非分裂细胞(Askari的No.6,171,855号美国专利，将其整体在此引入作为参考)。描述各种基于腺病毒的基因传递系统参见Haj-Ahmad等，“研发不依赖于辅助的人腺病毒载体及该病毒载体在转运单纯疱疹病毒胸苷激酶基因中的应用”，J.Virol.，57(1)：267-274(1986)；Bett等，“5型人腺病毒载体包装能力和稳定性”，J.Virol.，67(10)：5911-5921(1993)；Mediate等，“在体外体评价腺病毒介导的人囊性纤维化跨膜传导调节子cDNA转运的效能与安全性”，Hum.Gene Ther.，5(6)：717-729(1994)，Seth等，“复制缺陷的腺病毒与未修饰的质粒DNA共同内化后DNA表达增强的机制”，J.Virol.，68(2)：933-940(1994)；Barr等，“用复制缺陷的腺病毒以导管介导的方式将基因高效转运入心脏”，Gene Ther.，1(1)：51-58(1994)；Berkner等，“研发用于表达异源基因的腺病毒载体”，Biotechniques，6(7)：616-629(1988)；Rich等，“用于囊性纤维化基因治疗之重组腺病毒的研发和分析”，Hum.Gene Ther.，4(4)：461-476(1993)。将其整体在此引入作为参考。
可使用能够整合入细胞染色体的逆转录病毒载体，通过插入诱变鉴定重要的发育相关基因(参见Chang的U.S.专利No.6207455，将其整体在此引入作为参考)。逆转录病毒载体也应用于治疗(例如，基因治疗)。其中将一个基因(或多个基因)加入到细胞中，以替代缺失的或有缺陷的基因或灭活病毒之类的病原体。逆转录病毒家族成员以其病毒颗粒中存在逆转录酶为特征(Chang的U.S.专利No.6207344，将其整体在此引入作为参考)。该家族分成了3类亚家族：(1)肿瘤病毒亚科，包括所有致癌逆转录病毒和几种密切相关的非肿瘤病毒；(2)慢病毒亚科，即“慢逆转录病毒”，在后面会更详细地加以讨论；和(3)泡沫病毒亚科，为诱导持续感染但不诱发任何临床疾病的诱导“泡沫性”逆转录病毒(Verma等的No.6,218,181号美国专利，将其整体在此引入作为参考)。有些逆转录病毒是致癌的(即致癌的)，而其他则无致癌性。致癌病毒在易感种属中诱发肉瘤、白血病、淋巴瘤和乳腺癌(Wilson等的No.6,033,905号美国专利，将其整体在此引入作为参考)。逆转录病毒可感染许多物种，在水平与垂直方向均可传播。它们能够整合入宿主DNA，并可将宿主DNA序列从一个细胞传递到另一细胞。这就引发了研发逆转录病毒载体并将之用于各种目的，包括基因治疗。举例来说，在美国批准的基因转移试验大多数依赖于将治疗性多核苷酸序列作为逆转录病毒基因组一部分的复制缺陷型载体(Miller等，“逆转录病毒载体的基因传递仅发生于感染时正在活跃复制的细胞中”，Mol.Cell Biol.，10(8)：4239-4442(1990)；Cornetta等，“猴接触双嗜性逆转录病毒后长期再接触病毒败血症不会复发，也不见病理改变”，Hum.Gene Ther.，2(3)：215-219(1991)，将其整体在此引入作为参考)。正如本技术领域众所周知的那样，逆转录病毒载体用于基因治疗的主要优势在于其将基因向特定类型复制细胞中的高效率、被转移基因与细胞DNA的精确整合，及基因转移后序列不会进一步传播(Wilson等的No.6,033,905号美国专利，将其整体在此引入作为参考)。
在这里，术语“慢病毒”指一群(或属)可引起缓慢发展性病变的逆转录病毒。属于这一类的病毒包括人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体——HIV(人免疫缺陷病毒，包括I型HIV和II型HIV)；使可引发羊产生脑炎(绵羊脱髓鞘性脑白质炎)和肺炎(羊慢性进行性肺炎)的visna-maedi病毒；导致山羊免疫缺陷的羊关节炎-脑炎病毒；导致自身免疫溶血性贫血和导致马脑病的马感染性贫血病毒；导致猫免疫缺陷的猫免疫缺陷病毒(FIV)；导致淋巴结病、淋巴细胞增多和可能使牛发生中枢神经系统感染的牛免疫缺陷病毒(BIV)；导致亚人类灵长类免疫缺陷和脑病的猿免疫缺陷病毒(SIV)。这些病毒引起的疾病以潜伏期长和病程拖延不愈为特征。一般说来，这些病毒在潜伏期感染单核细胞和巨噬细胞，然后从这些细胞传播到其他细胞。HIV、FIV和SIV也很容易感染T淋巴细胞(即T细胞)。慢病毒的病毒颗粒核酸呈棒形，包含比其它逆转录病毒大的基因组。慢病毒合成负链所用的引物是tRNAlys，而不是其它感染性哺乳动物逆转录病毒共用的tRNApro。慢病毒的基因组间显示同源性，但与其它逆转录病毒不同源(Davis等编著《微生物学)》第4版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa.，pp.1123-1151(1990)，将其整体在此引入作为参考)。这些病毒引发疾病的一个重要因素是其病毒基因组的高致突变性，导致产生能躲过宿主免疫应答的突变体。慢病毒的优势在于转基因能够持续表达。
本发明中也以用腺相关病毒(AAV)为载体。AAV是一含有简单基因组构(4.7kb)的小单链DNA病毒，是基因工程的理想底物。其两个开放阅读框编码一系列rep及cap多肽。rep多肽(rep78、rep68、rep62和rep40)参与AAV基因组的复制、修复和整合。cap多肽(VP1，VP2和VP3)形成病毒衣壳。在5’和3’末端的rep和cap开放阅读框两侧是145bp的反向末端重复序列(ITRs)，起始的125bp能形成Y或T形双链结构。尽管其对AAV载体进化非常重要，整个rep和cap域可被切除并代以治疗性转化基因或报道转化基因(B.J.Carter，《细小病毒手册)》，P.Tijsser编著，CRC出版社，pp.155-168(1990)，将其整体在此引入作为参考)。ITRs是AAV基因组复制、修复、包装和整合所需的最小序列(Wilson等的NO.5,871,9982号美国专利，将其整体在此引入作为参考)。
正如前面提到的，病毒载体已成功用来提高将重组载体导入恰当宿主细胞的效率。因此，本发明使用病毒载体是合适的，这些载体包括上述或本技术领域熟知的任意腺病毒(Ad)、逆转录病毒、慢病毒或腺相关病毒(AAV)载体。当前病毒载体领域的研究目的是产生具有高效价、可在哺乳动物细胞高效转导的改良病毒载体(参见Finer等的No.6,218,187号美国专利，将其整体在此引入作为参考)。这种载体适用于本发明，此处所述的包含来源于一个或多个病毒载体之必需元件组合的任何病毒载体也同样适用于本发明。
将特定的“控制元件”或“调节元件”也引入载体构建体。术语“控制元件”指启动子区、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、内部核糖体入口位点(IRES)、增强子及类似序列，在受体细胞中控制编码序列的复制、转录和翻译。只要选定的编码序列可在合适的宿主细胞中得以复制、转录和翻译即可，并非所有这些控制元件都得存在。
在这里，术语“启动子区”通常指包括一段DNA调节序列的核苷酸区域，其中调节序列来源于能结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的基因。
真核细胞中的转录调控信号包括“启动子”和“增强子”元件。已从各种真核细胞基因分离出启动子和增强子元件，这些真核细胞基因包括酵母、昆虫、哺乳动物细胞和病毒中的基因。原核细胞中也发现了类似的控制元件，即启动子。这些元件的强度及特异性可能不同。例如，启动子可能是“组成性的”或“诱导性的”。
组成性启动子是调控贯穿于生物整个生命周期之基因表达的启动子。广泛用于诱导转化基因表达的一些组成性启动子包括来源于根瘤土壤杆菌的nopoline合酶(NOS)基因启动子(Rogers等的No.5,034,322号美国专利，将其整体在此引入作为参考)、巨细胞病毒(CMV)早期启动子、来源于数个肌动蛋白基因的任意启动子，已知这些肌动蛋白在大部分类型的细胞中均有表达(Privalle等的No.6,002,068号美国专利，将其整体在此引入作为参考)，以及泛素启动子，已知泛素的基因产物在许多细胞中均有积累。
诱导性启动子是受诱导剂刺激后可直接或间接激活一个或多个DNA序列或基因转录的启动子。在无诱导剂时，DNA序列或基因不发生转录。诱导剂可以是代谢物之类的化学药剂，或是施加于该生物的生理性应激，如低温、高温、毒素，或是通过病原体或疾病介质起作用。通过在外面对细胞施加诱导剂或将生物暴露于合适的环境条件下或有效的病原体中，含诱导性启动子的重组细胞可暴露于诱导剂中。诱导性启动子包括四环素反应元件和来源于β-干扰素、热休克基因、金属硫蛋白基因的启动子或来源于甾体激素反应性基因的任何启动子。组织特异性表达在基因表达领域已得到很好的鉴定，且组织特异性和诱导性启动子在该领域已是众所周知。这些基因在引入靶细胞后用来调节外源基因的表达。
组成性或诱导性启动子可用于本发明的病毒载体。
利用众所周知的分子克隆技术将选择的载体、恰当的标记基因、启动子/增强子区和合适的3’调节区可操作性连接在一起以产生本发明的表达系统，或其中的适当片段。这些技术如下列文献所述：Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》第二版，Cold Sprig Harbor出版社，NY(1989)；和Ausubel等(1989)《当代分子生物学方案》，John Wiley & Sons，New York，N.Y.。将其整体在此引入作为参考。在这里术语“可操作性连接”指将核苷酸连接起来，产生的核酸分子能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白分子的合成。
一旦本发明的核酸构建体得以制备并插入了目标载体，该构建体即易于引入宿主细胞。基本上，本方法使用本领域中已知的标准克隆方法，将本发明的构建体在能够有效促进DNA分子在宿主细胞内转录的条件下转化宿主细胞，实施本发明。这些标准克隆方法如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》第二版，Cold Sprig Harbor出版社，NY(1989)所述，在此将其整体引入作为参考。恰当的宿主细胞包括但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、植物等。当载体为病毒载体时，HEK293细胞株是一种合适的宿主细胞系，有望获得高的载体子代滴度。可以用磷酸钙共沉淀、电穿孔等各种转染技术将载体DNA引入包装细胞。这些技术参见：Sambrook等编著的《分子克隆：实验室手册》(1989)；《寡核苷酸的合成》(N.Gait编著，最近版本)；《核酸杂交》(B.hames和S.Higgins编著，最近版本)；《基础病毒学》第二版第I和第II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe等编著)。在此将其整体引入作为参考。本发明中使用的其他的常规方法包括病毒基因组的同源重组、琼脂糖覆盖面上的病毒噬菌斑形成、信号发生的测量方法等本技术领域中熟知或文献中所述的方法。
用本发明的病毒载体转染合适的宿主后，使病毒在宿主中繁殖，并加以收集。一般地，这涉及以固定的时间间隔收集细胞上清，利用本技术领域中熟知的技术如氯化铯密度梯度法纯化来自于粗制裂解液的病毒空斑。测定病毒的滴度(pfu/ml)，并根据需要进行上调(如通过过滤)或下调(用合适的缓冲液或基质稀释)。在本发明中，典型的AD滴度为1010-1012pfu/ml。
为了实现本发明基因治疗方面的目标，将分离纯化的、含编码生长因子之核酸的载体或受其感染的人细胞在能够有效表达生长因子及促进增强新生儿器官成熟的条件下施用于新生早产儿。
本发明的重组病毒可施用于新生儿，优选将其悬浮于生物相容性的溶液，或药学上可接受的传递载体，或来源于该新生儿的任意类型细胞。合适的载体包括无菌盐水。也可将已知是药学上可接受载体的、为本领域技术人员熟知的其他水含水和不含水的等渗无菌溶液，及含水和不含水的无菌混悬液用于此目的。
可以使用足量的本发明中重组病毒在体内或体外转染目标细胞，并引起所选转基因之足够高水平的整合及表达，以提供无不良反应的治疗效果或医学上可接受的生理效应，该生理效应可被医学领域的技术人员测定。尽管增强肺成熟度时的优选施用方法是吸入，本发明也包含了其他常规的和药学上可接受的施用方法，包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、粘膜上施用及口服。
重组病毒的剂量主要依赖于所选基因、患者的年龄、体重及健康状况，因而可在不同的患者中加以变动。剂量的调整应使治疗效果和副作用之间存在一种平衡。可通过监测所选基因的表达水平来决定施用剂量的选择、调整或频度。
本发明的另一方面旨在建立增强人类早产新生儿器官成熟度的方法，该方法在能够有效促进器官成熟的条件下将增加生长因子形成的药剂施用于人类早产新生儿。
增加生长因子形成的药剂包括但不限于释放生长因子的激素及其肽类似物、肽模拟性(peptidomimetic)生长激素促分泌素，这一点已被MK-0677证实(Smith等编著的《人类生长激素。研究及临床应用》中的Patchett等，“肽模拟性生长激素促分泌素的设计”，Humana出版社，Totowa，pp.45-67(2000)，将其整体在此引入作为参考)。
本发明额外的一方面是建立增加活体系统中IV型胶原形成的方法，该方法在可有效增加IV型胶原形成的条件下将生长因子、编码生长因子的基因或可增加生长因子形成的药剂施用于活体系统。
这里所用的活体系统不受任何限制地包括哺乳纲的任何成员，包括人、诸如黑猩猩及其他猿和猴等非人类的灵长类动物；包括牛、绵羊、猪、山羊和马在内的农场动物；包括猫、狗在内的驯养动物；包括小鼠、大鼠和豚鼠之类啮齿动物在内的实验动物，等等。该术语不限定特定的年龄和性别。因此，它不仅涵盖成年人和新生儿，也涵盖胎儿。
下面的实施例进一步阐明本发明。
实施例
实施例1-夜间生长激素水平与基质生物标记物水平间的关系
经父母知情同意、未成年人同意及学会批准，在睡眠期间每隔20分钟采集健康儿童血样，监测夜间生长激素与基质生物标记物水平之间的关系。由血样所得血清的所有参数均用普遍接受的特异、常规方法测定。代表性发现如3个Y轴的图1A～D所示。在每个图中，水平轴代表时间(测定的时间和时钟小时)，左边的纵轴给出基质生物标记物的水平，右边的两条纵轴分别给出生长激素和皮质醇的水平。基质生物标记物的波动由闭合方形/梯度阴影区表示(PICP，I型胶原的生物标记物；C-IV，IV型胶原的生物标记物；PIIINP，III型胶原的生物标记物；P1，层粘连蛋白的生物标记物)，生长激素(GH)的波动由闭合菱形/粗点区表示，皮质醇(G)的波动由开放圆形/细点区表示。依据生物周期研究领域中的成熟方法，特定时间的参数值以偏离该参数在整观察期间之总体均数的百分数(偏离均数的百分数，或％DOM)来表示。图1A显示每一PICP所对应之I型胶原和GH、F之间的关系。图1B显示每一C-IV所对应之IV型胶原和GH、F之间的关系。图1C显示每一PIIINP所对应之III型胶原和GH、F之间的关系。图1D显示每一P1所对应之层粘连蛋白和GH、F之间的关系。正如所预料的那样，所有I型胶原和三型胶原的生物标记物水平的波峰(图1A和1C中的闭合方形/梯度阴影区)与生长激素波峰始终相关。令人惊异的是，生长激素也激发IV型胶原生物标记物水平的波峰(图1B中的粗点/梯度阴影区)，说明如果生长激素浓度升高则基底膜胶原的生物合成也增加，并随生长激素水平达到最高值而达到最大值。相较之下，尽管层粘连蛋白与IV型胶原类似，也为基底膜形成所必需，但层粘连蛋白的生物合成不与生长激素的含量形成相关(图1D中的粗点/梯度阴影区)。
图2A～C显示：通过测量曲线下面积测定，各受试者的生长激素总量和胶原生物标记物总量呈现出剂量-效应关系。生长激素的值越低则生物标记物的值也越低(图2A：I型胶原的PICP；图2B：IV型胶原的C-IV；图2C：III型胶原的PIIINP)。总而言之，内源性人生长激素在体内除了刺激I型和III型胶原形成外，也刺激IV型胶原形成。因此，正如生长激素能缓解以I型和III型胶原合成不足为特征的病情，服用外源性人生长激素可以缓解以IV型胶原合成不足为特征的病情。
实施例2-生命第一周内基质生物标记物与后继病程中各临床参数之间的关系
经父母知情同意、未成年人同意及学会批准，监测一群早产新生儿生命第一周内基质生物标记物与后继病程种临床参数之间的关系，不管对其采取何种治疗性干预。如图3中的Kaplan-Meier分析所示，那些fwC-IV水平低于或等于905ng/mL的早产新生儿在新生儿重症监护病房的住院时间明显比那些fwC-IV水平高出905ng/ml的早产新生儿要长：分别为110天和85天。组间平均妊娠龄无差异。其他任何生物标记物不能定义类似的临界值。在早产新生儿生命第一周内测定时，完全出乎意料的是存在一种与新生儿重症监护病房住院时间密切相关的生物标记物。这种生物标记物仅在生命第一周很久之后才会发生变化。图3还使人认识到任何提高fwC-IV的药物，即将右边曲线向左边曲线移动的药物都可以合理地缩短新生儿重症监护病房住院时间。
既然已知新生儿重症监护病房(NICU)住院时间决定了由监护所产生的新生儿重症监护病房费用(St.John等，“依据出生时妊娠龄和存活状态的新生儿监护费用”，Am.J.Obstet.Gynecol.，182：170-175(2000)，将其整体在此引入作为参考)，我们还分析了早产新生儿生命第一周内测定的生物标记物与该新生儿重症监护的后继费用支出帐单之间的关系。再次注意到存在显著的、非常有意义的相关性。表1和表2总结了单个生物标记物的发现和由原始数据计算而得的一系列比值。
表1
生命第一周(fw)内生物标记物与新生儿重症监护病房住院时间
与住院时间
参数 相关的 P值
Spearman值
基质成分 fwC-IV -0.3 0.03
fwP1 0.5 0.006
胶原对非胶原 fwC-IV/fwP1 -0.7 0.0001
fwPICP/fwP1 -0.72 0.0001
fwC-IV+swPICP/fwP1 -0.83 0.0001
胶原对胶原 fwC-IV/fwPINP -0.4 0.03
fwC-IV/swPIIINP -0.47 0.0027
fwC-
IV/fwPINP+fwpIIINP -0.45 0.15
表2
生命第一周(fw)生物标记物与新生儿重症监护费用
与NICU总
参数 支出相关的 p值
Spearman值
基质成分 fwpIIINP 0.45 0.01
fwPINP 0.5 0.03
fwP1 0.7 0.0007
胶原对非胶原 fwC-IV/fwP1 -0.46 0.03
fwC-IV+fwPICP/fwP1 -0.57 0.01
胶原对胶原 fwC-IV/fwPINP -0.5 0.03
fwC-IV/swPIIINP -0.5 0.009
fwC-
-0.53 0.01
IV/fwPINP+fwpIIINP
至于住院时间，如图4所示，组中所有个体中装配基底膜的两种主要组分，机IV型胶原和层粘连蛋白的表现恰好相反：fwC-IV越高则住院时间越短，fwP1越高则住院时间也越长。因此，这些第一周参数可以单独使用或以算术比值使用来评估可能的延长住院期及预期的医学资源需求。基于第一周生物标记物测量值以数学方式推测住院时间的实例见图5、图6和图7。这些图使人认识到何种医疗干预可能缩短住院时间：使胶原含量相对于层粘连蛋白含量升高。如图8所示，图5、图6和图7中的生物标记物和生物标记物比值与妊娠龄无关。
至于新生儿重症监护的费用，我们分析了第一周基质生物标记物与医生直接服务产生的帐单(“医生帐单”)、医院支持性服务所产生的费用(“医院帐单”)及二者之和(“总帐单”)之间的关系。如图9所示，对于所有受试病人的医生帐单来说，装配基底膜的两种主要组分，即IV型胶原和层粘连蛋白表现还是相反：fwC-IV越高则医生费用越低，fwP1越高则医生费用也越高。因此，这些第一周参数可以单独使用或以算术比值使用来评估预期费用。基于第一周生物标记物测量值以数学方式推测这三种费用参数的实例见图10、图11和图12。每个图中的插图显示妊娠龄本身与所示任何可用于评估随后所产生费用的第一周生物标记物参数无关。这些图使人认识到何种医疗干预可能降低早产新生儿NICU监护三类费用的每一类费用：使胶原含量相对于层粘连蛋白含量升高。
尽管优选实施方案在这里作了详细的描述和说明，对于相关领域的熟练技术人员来说，很明显可以在不违背本发明精神的条件下作出各种修改、添加、替换等。因此这些修改、添加、替换应属于下面权利要求书定义的发明范围之内。