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1、10申请公布号CN104099302A43申请公布日20141015CN104099302A21申请号201410345101222申请日20140718C12N9/00200601C12N15/52200601C12N15/70200601C12N1/15200601C12P19/3220060171申请人西南大学地址400715重庆市北碚区天生路2号72发明人邹祥吴小燕涂光伟74专利代理机构北京同恒源知识产权代理有限公司11275代理人王贵君54发明名称出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶及其重组表达载体和应用57摘要本发明公开了出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，其氨基酸序列如SEQIDNO10所示，。
2、含有439位氨基酸，CDNA序列如SEQIDNO9所示，基因组序列如SEQIDNO8所示，将CDNA序列经重组表达后能够获得分子量约为68KDA的重组蛋白，经酶学性质检测发现，重组表达的苹果酰辅酶A连接酶的活性为0176U，最适反应温度为25，最适PH为80，最适ATP底物浓度为02MM，并且具有较广的底物选择性，可以催化不同单体苹果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸或丙二酸反应，并提高聚苹果酸的产量。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表8页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表8页附图3页10申请公布号CN104099302ACN。
3、104099302A1/1页21出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，其特征在于所述苹果酰辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQIDNO10所示。2根据权利要求1所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，其特征在于编码所述苹果酰辅酶A连接酶的CDNA如SEQIDNO9所示。3根据权利要求1所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，其特征在于所述苹果酰辅酶A连接酶的基因组序列如SEQIDNO8。4表达权利要求13任一项所述出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体。5根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体由SEQIDNO9所示序列连入PET32A载体的BAMH和HIND酶切位点而得。6权利要求13任。
4、一项所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化单体与辅酶A反应中的应用，所述单体为苹果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸或丙二酸。7权利要求13任一项所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在出芽短梗霉中提高聚苹果酸产量中的应用。权利要求书CN104099302A1/5页3出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶及其重组表达载体和应用技术领域0001本发明属于基因工程领域，具体涉及出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶基因，还涉及表达苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体和应用。背景技术0002聚苹果酸POLYMALICACID，PMA是一种新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物，由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性。
5、，可作为药物载体与微胶囊材料、生物医学材料、吸水材料、化妆品、食品包装等材料，具有广泛的应用前景。0003聚苹果酸主要由出芽短梗霉AUREOBASIDIUMPULLULANS发酵生产，对聚苹果酸的生物合成途径研究表明，聚苹果酸是以TCA循环产生的苹果酸为底物进行合成。然而，迄今为止，以苹果酸为单体聚合生产聚苹果酸的聚合途径及相关基因尚未阐明。基于前期文献调研，聚苹果酸的聚合途径可能涉及两个酶即苹果酰辅酶A连接酶MALATECOALIGASE，MCL和聚苹果酸合成酶POLYMALICACIDSYNTHASE，PAS参与反应，但是相关基因及序列在APULLULANS中未见报道，苹果酰辅酶A连接酶在。
6、ATP及辅酶A参与下，实现对单体苹果酸的酰基化，聚苹果酸合成酶催化聚合反应。微生物产生的聚酯型聚合物通常需要对单体酰基活化后，在聚合酶的催化作用下生产聚合物BIOMACROMOLECULES,2012,1329642972。因此，单体酰基活化酶的底物特异性对于聚合单体的选择及新型共聚物材料的创制具有重要意义。本发明首次从真核生物出芽短梗霉中克隆得到苹果酰辅酶A连接酶基因，对实现出芽短梗霉代谢工程改造及提高聚苹果酸合成产率具有重要意义。发明内容0004有鉴于此，本发明的目的之一在于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶；本发明的目的之二在于提供表达出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体；本发明的目。
7、的之三在于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化单体中的应用；本发明的目的之四在于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在出芽短梗霉中提高聚苹果酸产量中的应用。0005为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案00061出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，所述苹果酰辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQIDNO10所示。0007优选的，编码所述苹果酰辅酶A连接酶的CDNA如SEQIDNO9所示。0008优选的，所述苹果酰辅酶A连接酶的基因组序列如SEQIDNO8。00092表达所述出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体。0010优选的，所述重组表达载体由SEQIDNO9所示序列连入PET32A载体的BAMH。
8、和HIND酶切位点而得。00113所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化单体与辅酶A反应中的应用，所述单体为苹果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸、丙二酸中的应用。0012优选的，出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化苹果酸与辅酶A生成苹果酰辅酶说明书CN104099302A2/5页4A中的应用。00134、所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在出芽短梗霉中提高聚苹果酸产量中的应用。0014本发明的有益效果在于本发明首次从真核生物出芽短梗霉克隆了编码苹果酰辅酶A的基因组序列和CDNA序列，经比对发现，出芽短梗霉同褐螺菌属PHAEOSPIRILLUMMOLISCHIANUM苹果酰辅酶A连接酶编。
9、码氨基酸同源性为51，同红杆菌属RHODOBACTERCAPSULATUS苹果酰辅酶A连接酶氨基酸同源性49，表明本发明克隆得到的苹果酰辅酶A连接酶为一种新酶蛋白，本发明还公开了将表达苹果酰辅酶A连接酶的重组载体，将苹果酰辅酶A连接酶重组表达后最适反应温度为25，但在2040条件下均具有较好的催化活性；最适酶促反应PH为80，且在高浓度的ATP下对酶活性具有抑制作用，经苹果酰辅酶A连接酶单体选择性实验表明，出芽短梗霉来源的苹果酰辅酶A连接酶具有较宽的底物选择性，草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸、丙二酸等均可作为该酶的催化底物。因此，本发明获得的苹果酰辅酶A连接酶可作为新型共聚物材料聚合的起。
10、始酶，开发新型高分子可降解材料。本发明还发现在出芽短梗霉中过表达出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶能够提高聚苹果酸的产量，为通过代谢工程提高聚苹果酸的产量提供了有力工具。附图说明0015为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图0016图1为苹果酰辅酶A连接酶SDSPAGE分析结果图。0017图2为温度对苹果酰辅酶A连接酶活力的影响。0018图3为PH对苹果酰辅酶A连接酶活力的影响。0019图4为ATP浓度对苹果酰辅酶A连接酶的影响。0020图5为苹果酰辅酶A连接酶对不同底物的选择性。0021图6为重组质粒PBARGPE1MCL酶切验证结果图。具体实施方式0022下面将结合附。
11、图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版，J萨姆布鲁克等著中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0023本发明通过生物信息学分析，根据苹果酰辅酶A连接酶基因的保守序列，设计兼并引物，从出芽短梗霉中克隆得到聚苹果酸聚合途径中的苹果酰辅酶A连接酶的核心片段，采用IPCR的方法成功克隆到了CDNA全长基因，并纯化该酶，研究其酶学特性及功能验证。0024实施例1、苹果酰辅酶A连接酶基因的克隆0025利用生物信息学分析NCBI中已报道的苹果酰辅酶A连接酶基因序列，序列来自莫氏褐螺菌PHAEOSPIRILLUMMOLISCH。
12、IANUM，WP_002730336；布鲁氏菌BRUCELL，WP_008503553A；荚膜红细菌RHODOBACTERCAPSULATUS，WP_013066464；深红红螺菌RHODOSPIRILLUMRUBRUM，WP_011388966；脱氮副球菌PARACOCCUSDENITRICANS，WP_01174690；将序列进行比对分析后在保守区设计说明书CN104099302A3/5页5兼并引物，上游引物为5ARGGHGGTATGGACATTGAGG3SEQIDNO1，下游引物为5CCRCCRAARATGTTGACRAAG3SEQIDNO2，其中RA/G，YC/T，MA/C，KG/T，。
13、SC/G，WA/T，HA/C/T，BC/G/T，VA/C/G，DA/G/T，NA/C/G/T，然后以出芽短梗霉AUREOBASIDIUMPULLANSCCTCCNOM2012223基因组为模板，进行PCR扩增，扩增条件为94预变性5MIN；94变性30S，56退火30S，72延伸30S，30个循环；72后延伸10MIN；25保温10MIN。然后将PCR产物经琼脂糖电泳，并回收目的片段，回收产物连接PMD19TVECTOR，经测序获得如SEQIDNO3所示序列，记为苹果酰辅酶A连接酶基因核心片段，该片段为666BP的核苷酸片段。0026然后根据IPCR原理，设计扩增苹果酰辅酶A连接酶全长的引物，。
14、具体如表1所示0027表1IPCR引物序列0028注表1加粗碱基为兼并碱基。0029用HIND内切酶对出芽短梗霉AUREOBASIDIUMPULLANSCCTCCNOM2012223基因组DNA进行酶切，酶切反应在37水浴中酶切10小时，酶切后用酚氯仿抽提和乙醇沉淀，最后用无菌水溶解。酶切产物经纯化后加入T4DNALIGASE，在8条件下反应16H。将连接后产物进行巢式PCR。第一次巢式PCR的引物为IPCR72R和IPCR73F，PCR扩增条件为94预变性5MIN；94变性50S，59退火50S，72延伸4MIN，35个循环；72后延伸10MIN，25保温10MIN；将第一次巢式PCR产物稀。
15、释10倍后进行第二次巢式PCR，扩增条件与第一次扩增条件相同，将扩增产物与PMD19TVECTOR连接，转化ECOLIDH5感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得重组子，然后测序，经分析获得苹果酰辅酶A连接酶基因组序列，其核苷酸序列如SEQIDNO8所示。由SEQIDNO8可知，苹果酰辅酶A连接酶基因组序列为1498BP，含有4个外显子和3个内含子，经分析苹果酰辅酶A连接酶CDNA为1320BPSEQIDNO9，编码439个氨基酸SEQIDNO10，推导其编码多肽链分子量约为48KDA。0030将苹果酰辅酶A连接酶的氨基酸序列经CLUSTALW多序列对比。结果显示，出芽短梗霉出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接。
16、酶与来自褐螺菌属莫氏褐螺菌PHAEOSPIRILLUMMOLISCHIANUM苹果酰辅酶A连接酶的氨基酸同源性为51；与红杆菌属荚膜红细菌RHODOBACTERCAPSULATUS的苹果酰辅酶A连接酶同源性为49，表明出芽短梗霉的苹果酰辅酶A连接酶与原核来源的苹果酰辅酶A连接酶存在差异。0031实施例2苹果酰辅酶A连接酶CDNA重组表达载体构建0032为实现在大肠杆菌表达，用真菌RNA提取试剂盒购自OMEGA公司，货号为R684001提取出芽短梗霉的总RNA，然后用反转录酶试剂盒购自FERMENTAS公司，货号为K1621合成CDNA第一条链，并以此为模板，上游引物为5ATGTTCAAGCTC。
17、GCCCGCAG3SEQIDNO11，下游引物为5TTAGATACCGAGAGAGAACTCG说明书CN104099302A4/5页6ACAC3SEQIDNO12进行PCR扩增，PCR扩增条件为94预变性5MIN；94变性30S，57退火50S，72延伸2MIN，30个循环；72后延伸10MIN；最后25保温10MIN，将扩增产物连接PMD19TVECTOR，然后转化ECOLIDH5感受态细胞，筛选获得阳性重组子，然后测序获得1320BP的序列，如SEQIDNO9所示，即苹果酰辅酶A连接酶CDNA。同时，以合成的CDNA第一条链为模板，以带有酶切位点的引物进行PCR扩增，上游引物为5ATAGG。
18、ATCCATGTTCAAGCTCGCCCG3SEQIDNO13，下划线为BAMH；下游引物为5GCGAAGCTTGATACCGAGAGAGAACT3SEQIDNO14，下划线为HIND，PCR扩增条件为94预变性5MIN；94变性30S，60退火50S，72延伸2MIN，30个循环；最后25保温10MIN。将扩增产物连接PMD19TVECTOR，然后转化ECOLIDH5感受态细胞，筛选获得阳性重组子，经扩大培养后取菌液提取质粒，将提取的质粒用BAMH和HIND酶切后回收目的片段，然后与经BAMH和HIND酶切后的PET32A载体连接，得苹果酰辅酶A连接酶重组表达载体，记为PETMCL重组表达载。
19、体。0033实施例3苹果酰辅酶A连接酶的表达与纯化0034将构建的重组表达载体PETMCL转入ECOLIBL21DE3中，通过预培养及05MMOL/L的IPTG诱导6H后，收集菌体，将菌体重新悬浮于细胞裂解液中，利用超声破碎法裂解菌体，离心分离得到细胞上清；将细胞上清液通过NINTA亲和层析法纯化蛋白。然后用SDSPAGE检测蛋白，结果如图1所示。由图1可知，在泳道1上约68KDA处出现单一条带，由于载体上含有四个蛋白标签，TRXTAG、STAG和2个HISTAG标签，所以纯化获得的蛋白的分子量大于48KDA。表明苹果酰辅酶A连接酶成功表达，且蛋白纯化效果较好。0035实施例4苹果酰辅酶A连接。
20、酶酶学性质0036采用ELLMAN法，通过检测底物辅酶的减少来测定苹果酰辅酶A连接酶的活性。酶活力单位定义为在25，PH80的TRISHCL缓冲液中，每分钟催化1MOL底物所需酶量为一个酶活单位U。然后检测苹果酰辅酶A连接酶的酶活，反应体系为TRISHCL缓冲液PH80、50MMKCL溶液，02MMATP，45M辅酶A，2MM苹果酸及2MM苹果酰辅酶A连接酶，催化温度25，反应时间10MIN，反应结束后加入02MG/MLDTNB5,5二硫代双2硝基苯甲酸，5，5DITHIOBIS2NITROBENZOICACID溶液终止反应。然后于412NM波长下检测5巯基2硝基苯甲酸TNB的生成量，结果显示。
21、苹果酰辅酶A连接酶的酶活为0176U。00371测定酶的最适反应温度按照与上述相同的反应体系，测定反应温度分别为15、20、25、30、35、40条件下酶活，其检测结果如图2所示。由图2可知，苹果酰辅酶A连接酶的最适反应温度为25将此处催化活性设定为100，在2040条件下，相对酶活力较高，达到70100，说明苹果酰辅酶A连接酶对温度的耐受力比较强。00382测定酶的最适反应PH按照与上述相同的反应体系，区别在于分别使用PH为75、80、85和9的TRISHCL缓冲液检测酶活力，其检测结果如图3所示。由图3可知，苹果酰辅酶A连接酶的最适反应PH为80将此处催化活性设定为100，当PH值高于或低。
22、于80时苹果酰辅酶A连接酶的相对活性急剧下降，表明苹果酰辅酶A连接酶的适应PH范围较窄。00393测定酶的最适ATP底物浓度由于高浓度ATP对酶促反应存在抑制作用，测定不同ATP底物浓度下的苹果酰辅酶A连接酶的相对活性。按照与上述相同的反应体系，区别在于分别选取ATP浓度为005MM、01MM、02MM、03MM、04MM、05MM时测定酶活力，结果说明书CN104099302A5/5页7如图4所示。由图4可知，ATP浓度为02MM时，苹果酰辅酶A连接酶反应速度最大，随着ATP浓度逐渐增大，苹果酰辅酶A连接酶的催化活性急剧下降，当ATP浓度为05MM时，苹果酰辅酶A连接酶催化活性基本受到抑制。。
23、00404测定底物特异性反应体系中分别以2MM苹果酸、2MM琥珀酸、2MM草酰乙酸、2MM柠檬酸、2MM丁酸、2MM草酸、2MM丙二酸为底物，在最适反应温度和PH值下，测定酶活力，结果如图5所示。由图5可知，苹果酰辅酶A连接酶具有较广的底物选择性，可以催化不同单体草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸、丙二酸；其中苹果酸为最适底物，其次为草酸、草酰乙酸、丁酸、丙二酸，对柠檬酸和琥珀酸的催化活性相对较低。因此，苹果酰辅酶A连接酶可以用于催化苹果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸、丙二酸等底物。0041实施5出芽短梗霉中过表达苹果酰辅酶A连接酶0042根据苹果酰辅酶A连接酶CDNA序列设计构建。
24、真核表达载体的引物，具体引物如下0043上游引物5CGGGATCCCGTATCTCTTTGCTGAGCCTTGTTTG3SEQIDNO15，下划线表示BAMHI酶切位点；0044下游引物5TCCCCCGGGGGATGGCAAAGGTAGCTACTTGAGT3SEQIDNO16，下划线表示SMAI酶切位点。0045然后以出芽短梗霉CDNA为模板，SEQIDNO15和SEQIDNO16所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为，94预变性5MIN；94变性30S，60退火50S，72延伸2MIN，30个循环；最后25保温10MIN；扩增产物通过SMAI和BAMHI酶切位点连入经同样酶切。
25、的PBARGPE1载体中，获得重组质粒PBARGPE1MCL。获得的PBARGPE1MCL中目的基因上游装有真核生物通用启动子GPDA，下游装有终止子TRPC，筛选标记基因为BAR基因。然后将重组质粒PBARGPE1MCL经SMAI、BAMHI双酶切验证，结果如图6所示。结果显示，重组质粒PBARGPE1MCL酶切后获得2108BP的目的片段，表明含有苹果酰辅酶A连接酶的重组质粒构建成功，然后通过原生质体转化出芽短梗霉AUREOBASIDIUMPULLANSCCTCCNOM2012223，获得含有重组质粒PBARGPE1MCL的工程菌，然后将工程菌进行发酵培养96小时，同时以出芽短梗霉AURE。
26、OBASIDIUMPULLANSCCTCCNOM2012223为对照，然后提取聚苹果酸，并计算聚苹果酸的产量发酵方法和聚苹果酸提取方法见公开号为102827778A的中国专利。结果显示，对照组聚苹果酸为285G/L，而工程菌的聚苹果酸产量提高了8。表明苹果酰辅酶A连接酶能够改变出芽短梗霉的代谢流向，过表达能够提高出芽短梗霉中聚苹果酸的含量。0046最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。说明书CN104099302A1/8页800010002序列表CN104099302A2/8页90003序列表CN104099302A3/8页100004序列表CN104099302A104/8页110005序列表CN104099302A115/8页120006序列表CN104099302A126/8页130007序列表CN104099302A137/8页140008序列表CN104099302A148/8页15序列表CN104099302A151/3页16图1图2图3说明书附图CN104099302A162/3页17图4图5说明书附图CN104099302A173/3页18图6说明书附图CN104099302A18。