超临界液体加工：制备蛋白质 微粒及使其稳定化 【发明领域】
本发明涉及利用超临界液体加工法而使蛋白质和多肽沉淀的方法，以及其保护和稳定化，防止变性。
【发明背景】
在很多应用中对稳定的蛋白质和多肽的需要正在连续增大。在药物领域中治疗用的蛋白质尤其如此。为了方便制造者和最终用户，蛋白质水溶液常常是优选的给药剂型。此外，这是它们的共同自然形态，这种形态使得能生成水化的、三维折叠的络合物。这种构象通常报称第三结构，其完整性对维持蛋白质的生物活性是极其重要的。蛋白质第三结构的不可逆丧失称作变性，并引起失活。因为在溶液中的蛋白质和多肽受到很多应激，这些应激能引起物理降解(变性)和化学降解(即化学反应如水解、脱酰胺化，等等)，所以对液态配制物的开发常常被排除了。目前，获得蛋白质稳定性的最普遍方法是用合适方法例如冷冻干燥法或喷雾干燥法除去水。但是，这两种方法(参考“Formulation and Delivery of Proteins andPeptides”J.L.Cleland and R.Lan ger American Chemical Society，Washington，DC 1994)能引起蛋白质无折叠。特别是在开始地冷冻过程中，或在用升华法急性脱水的过程中，能发生冷冻干燥蛋白质的无折叠。
关于喷雾干燥法，热降解、低效率、低产率和高残留水分是限制这一技术的主要因素。
另一个问题是采用不同干燥法所制得的相似制剂在长期稳定性方面的差异。事实上，依赖于脱水方法，蛋白质可具有不同的三维结构，其起始生物活性相同，但货架寿命不同。
碳水化合物特别是海藻糖在冷冻过程和脱水过程中对蛋白质的稳定性影响已多见诸报导(“Formulation and Delivery of Proteins andPeptides”J.L.Cleland and R.Lan ger American Chemical Society，Washington，DC 1994以及“Freeze-Drying/Lyophilization ofPharmaceutical and Biological Products”L.Rey and J.C.May，MarcelDekker，Inc.New York 1999)。虽然很多糖类能防止蛋白质在脱水过程中被伤害，但是因为Maillard反应，其产品在室温下的货架寿命是短的。在室温下的稳定性通过使用非还原糖例如蔗糖和海藻糖能够改善。
英国专利申请GB 2009198公开了脑膜炎球菌多糖类和海藻糖的冷冻干燥法；GB 2126588公开了通过加入非离子表面活性剂或海藻糖(或其他糖)而在冷冻干燥和冷冻中使瘤坏死因子(TNF)稳定；而日本专利申请J58074696则公开了在海藻糖存在下使ATP冷冻干燥。
据报导含海藻糖的碱性磷酸酯酶制剂在冷冻干燥后仍维持其活性，而在45℃下贮存84天后仍维持70％的起始活性(A.W.Ford等人，J.Pharm.Pharmacol.1993，45：86-93)。虽然冷冻干燥法至今仍是用于干燥蛋白质的主要方法，但必须采取若干预防措施，以便防止受损坏害，这种损坏能引起严重的应激相例如冷冻融化和干燥。事实上，在冷冻干燥蛋白质制剂的第一步骤中，正确选择操作条件(pH、离子强度、稳定剂的存在......等等)能保证最好地防止蛋白质无折叠和失活。已经知道很多赋形剂例如糖类、氨基酸、聚合物、表面活性剂特异配位体(底物、辅助因子、别构改性剂......等等)在冷冻干燥中能使蛋白质稳定，并已称作“冷冻保护剂(lyoprotectants)”。在它们之中，对碳水化合物特别是多糖例如蔗糖和海藻糖已进行了广泛的研究。这些化合物的稳定机理以及别的稳定剂还未被完全搞清楚。但是，在冻融和干燥过程中，有效的溶解保护剂必须保持有效。因为在冷冻过程的大部分期间，蛋白质环境是含水的，使水溶液中的天然构象稳定的溶质作为冷冻保护剂常常是非常有效的。碳水化合物和一些氨基酸就是例子。Arakawa等人(J.Pharm.Res.1991，8，285-291)报导，尽管在水溶液中，这些溶质倾向于从蛋白质表面除去。这种现象的热动力学结果是蛋白质天然构象的稳定化。
在干燥及贮存期间的稳定性可以用水置换和玻璃固化的假设很好地解释。前者指出稳定剂与含水的蛋白质的相互作用确实通过置换已被除去的水而做到了，而且是因为干燥过程的热动力学控制。后者则指出稳定剂是良好的玻璃形成剂，并在干燥过程之中和之后仍维持无定形，因而它们在玻璃状基体内不能机械地移动蛋白质。这纯粹是动力学方面的论点，它同样好地应用于解释干燥时的稳定性及贮存时的稳定性。(“Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and BiologicalProducts”L.Rey and J.C.May，Marcel Dekker，Inc.New York 1999)。
因此，参考上述关于已干燥蛋白质的稳定性假设，人们能假想，对长期稳定性来说，玻璃固化是主要论点之一。为了干燥作用而采用喷雾干燥较少被研究。虽然微细的无定形颗粒能生产，但是这一方法需要热空气作为干燥的强制力，而热空气能导致蛋白质的热降解。此外，低效率、低产率和高残留水份是另外的限制因素。
另外的已报导的能避免失活的干燥蛋白质方法是在室温下空气脱水。Quadrant Bioresources Ltd(UK)的US 4,891,319公开了于大气压下在海藻糖存在下通过在37-40℃干燥而使若干种蛋白质和其他大分子防腐的方法。
也已报导使用超临界液体方法作为获得干燥的微细颗粒状蛋白质的方法。这一方法的主要优点是在迅速沉淀之前维持蛋白质在可取的含水环境之中，以便减少变性，工艺过程比冷冻干燥短，以及不太昂贵。
S.P.Sellers等人(J.Pharm.Sci.，2001，90，785-797)报导一种生产蛋白质粉末用的脱水方法，此方法基于超临界CO2促进的喷雾方法。这一技术可同化于喷雾干燥；事实上超临界CO2被用于提高溶液喷雾干燥，而不是用作溶质沉淀的反溶剂。Debenedetti(US 6,063,910)报导了一种用于形成蛋白微颗粒的GAS法(气体反溶剂重结晶法)。在这一方法中，蛋白质溶液被喷雾通过一个用激光钻孔的铂盘，此孔的直径20μm，长度240μm，该盘放在颗粒形成容器之内，而此容器则已用超临界液体灌装，超临界液体则从不同入口引入。此技术已用于从乙醇/水(9∶1v/v)溶液中形成过氧化氢酶和胰岛素的颗粒(0.01％w/v)，使用二氧化碳作为超临界液体。在这一方法中，超临界液体的入口并不优化：溶液的喷入发生在几乎静态的超临界液体的氛围中。Hanna M.及Youk P.(WO 96/00610)推荐了一种新的方法和新的设备，它用称作SEDS(用超临界溶液使溶液高度分散)的特异的超临界液体方法获得非常细的颗粒。
此方法基于一种新的同轴喷嘴：溶液膨胀通过毛细管入口，超临界液体膨胀通过带锥形端部的外同轴通道。在锥形区超临界液体与溶液之间产生混合。他们还建议使用三通路喷嘴：可以输送入改性剂以改善混合。他们将SEDS方法用于水溶性化合物例如糖类(乳糖、麦芽糖、海藻糖及蔗糖)和蛋白质(R-TEMβ-乳酰胺酶)的细颗粒的沉淀。在该文中既未提到也未举例说明蛋白质与稳定剂的共沉淀。
此外，这些相同发明人(WO 01/03821)描述了一种改进的沉淀方法，它使用相同设备，但往颗粒形成容器输送超临界液体及两种不溶混溶剂。这一方法使得两种或多种溶于两种不溶混溶剂的溶质产生共沉淀。液体入口由两个同轴喷嘴形成，其中两种溶剂之间的接触仅仅在它们由于超临界反溶剂而分散之前发生，这避免了在喷嘴内的沉淀溶质。但是，这一方法允许形成均匀共沉淀；当必须加工两种具有不同极性的溶质时这一点通常是有用的。此外，如果这用于水溶液，第二溶剂必须是在水中至少部分可溶的，这使得它能让水分散到超临界反溶剂之中。这一步骤对于使水溶溶质沉淀是必要的。在这一文件中未描述蛋白质与稳定剂的共沉淀。
Walker(WO 01/15664)公开了一种将活性(优选药物活性)物质与低聚或聚合赋形剂共同配制的方法，在其中80％与100％之间的活性物质是与结晶形相反的无定形。在0与10℃之间的温度贮存时，在这些制剂中，这些活性物质比结晶形的是更稳定的。在这一文件中仅公开了药物活性物质与低聚的或聚合的赋形剂的共同配制，但未提到蛋白质的稳定化。因此在现有技术中蛋白质的稳定化是通过冷冻干燥和喷雾干燥而获得的。在此之前还未描述过用超临界液体使蛋白质与稳定剂共沉淀，而这正是本发明的目的。
我们现在已发现一种采用超临界液体以共沉淀法生产带有稳定剂的稳定的干燥的蛋白质微粒的方法。优选的稳定剂是碳水化合物、氨基酸、表面活性剂和聚合物。更优选的稳定剂是糖类，最优选的是海藻糖。
共沉淀使得蛋白质/稳定剂分子之间能密切相互作用，也使得在每对蛋白质/稳定剂之间存在优化的重量/重量比。
事实上因为不存在冻融，因此不需要低温保护。此外，虽然蛋白质/稳定剂的相互作用的本质已较清晰，但在目前情况下，在干燥过程中，稳定剂而不是残留的蛋白质活性起着改善贮存稳定性的作用。事实上用超临界液体进行的沉淀因蛋白质颗粒生产本身而引起，在干燥过程中不发生变性。
本发明的说明
术语“超临界液体”指处于或高于其临界压力及其临界温度的一种液体。
术语“溶剂”指一种液体，它能与蛋白质和稳定剂形成溶液。
术语“稳定剂”指一种固态药物赋形剂，它能够使例如蛋白质稳定，而这种蛋白质能溶于该溶剂而实际上不溶于超临界液体。
术语“改性剂”指一种物质，优选指一种溶剂，它增大“溶剂”在超临界液体中的溶解度。
本发明提供利用气体反溶剂法(gas anti solvent process)而使一种物质与稳定剂共沉淀的方法，此方法包括将纯的超临界液体或它与改性剂的混合物送入颗粒形成容器之中；及
送入一种含有溶解在溶剂中的该物质和该稳定剂的溶液；
因而该溶剂被该超临界液体从溶液中萃取出来，而且发生了此物质与稳定剂的共沉淀。
优选的是，此溶液与改性剂混合物而一起送入颗粒形成容器之中。此方法包括将该物质与稳定剂的溶液或悬浮液与超临界液体一起送入颗粒形成容器之中。在颗粒形成容器中，发生了超临界液体与溶液的混合和溶剂被超临界液体萃取，因而溶质(此物质和稳定剂)以细颗粒共沉淀出来。如果溶剂与超临界液体不溶混，则需要用改性剂。改性剂是既溶于溶剂又溶于超临界液体的化合物。
更优选的是，使用图1中的设备。在此情况下，将此物质与稳定剂的溶液、超临界液体与改性剂(如果需要的话)用喷嘴27以并流的方式分开地送入颗粒形成容器之中。这种在WO 02/68107图2和图3中所示的喷嘴为超临界液体和溶液提供了分开的入口。事实上这是一种在其中心有小孔的盘，与中心相同距离而且沿着圆周距离相等地有两个或多个孔。全部小孔与颗粒形成容器的内部连通。溶液通过中心孔送入颗粒形成容器之中，而纯的或与改性剂混合的超临界液体则通过外部的孔送入。
在送入颗粒形成容器之前，将改性剂与超临界液液体混合。在此方法的另一形式中，则将一部分改性剂与溶液以及一部分改性剂与超临界液体，或者仅与溶液一起送入颗粒形成容器中。
此物质优选是药物上或诊断上有意义的蛋白质或多肽化合物，它溶于溶剂和溶剂/改性剂混合物中，而实际上不溶于超临界液体中。
此稳定剂优选是药物赋形剂，它能使共沉淀产物中的物质稳定。此稳定剂溶于溶剂中和溶剂/改性剂混合物中，而实际上不溶于超临界液体中。优选稳定剂是糖类，更优选是海藻糖。也可以使用稳定剂的混合物。
此溶剂优选选自水、乙醇、甲醇、DMSO、异丙醇、丙酮、THF、乙酸、乙二醇、聚乙二醇及N，N-二甲基苯胺。最优选的溶剂是水。
此超临界溶剂优选选自二氧化碳、乙烷、乙烯、丙烷、六氟化硫、一氧化二氮、氯三氟甲烷、单氟甲烷、氙气及其混合物，最优选二氧化碳。
此改性剂优选选自乙醇、甲醇、DMSO、异丙醇、丙酮、THF、乙酸、乙二醇、聚乙二醇及N，N-二甲基苯胺或其混合物。最优选的改性剂是乙醇。当然，改性剂和溶剂必须是不相同的。
【附图说明】
图1表示实现根据本发明方法所采用的设备的示意图。
图2和图3表示用于实现根据本发明方法的喷嘴。
图4、5和6表示在w/w比值分别为1∶10、1∶2和1∶0的情况下超临界CO2共沉淀的溶菌酶/海藻糖粉末的粒径分布。
图7表示由超临界CO2共沉淀的溶菌酶/海藻糖粉末相对于相应纯产品的用差示扫描量热法(DSC)所得的差示热分析图。
本发明的详细说明
本发明将再具体参考此物质是蛋白质而进行描述。业已发现，通过使用各种稳定剂如碳水化合物、氨基酸及表面活性剂聚合物、利用超临界液体，可以生产稳定的干燥的蛋白质/稳定剂颗粒。
令人惊异的是，业已发现，利用超临界液体的共沉淀，能够使蛋白质和稳定剂分子之间产生特别紧密地相互作用，而对于每对蛋白质/稳定剂，存在优化的重量比。如果稳定剂的数量超过优化比值，则超出部分不直接与蛋白质相互作用，而宁肯生成纯稳定剂颗粒。这一情况已被显微镜证明，也被差示扫描量热法(DSC)分析证明。
使物质与稳定剂共沉淀的方法可以用图1所报导的设备来实现，这种方法使用GAS方法，此方法包括在颗粒形成容器中使用纯的超临界液体或其与改性剂的混合物以及使用一种溶剂。
图1设备的优点和超临界液体与溶液之间的接触有关，因为这仅在颗粒形成容器中发生。因此不能在喷嘴内发生粉末沉淀和引起堵塞。重要的是超临界液体起着反溶剂的作用，当它进入颗粒形成容器时也促进溶液转变为细的喷雾。这扩大了溶液/反溶剂的界面，并使得两相之间能迅速混合，因此蛋白质迅速沉淀而无任何变性。另外，溶液与超临界液体之间质量转移的提高使得能在温和的温度和压力环境下操作，这能避免任何可能的蛋白质变性。图1的设备包括颗粒形成容器22，这是一种体积合适的标准反应容器、在此容器中的温度用加热夹套21使之维持恒定。在此容器中的压力用微计量阀5进行控制。
用热电偶29及压力传感器30测定颗粒形成容器中的温度和压力。
将形成的颗粒用过滤器23使之留下。这是一种不锈钢框，它的底部用烧结的不锈钢盘(0.5μm)制造，将第二过滤器24(0.5μm)放在容器的出口处。
超临界液体被从圆筒3中排出，被冷却器4冷凝，并被泵8通过管线34泵至颗粒形成容器。在进入颗粒形成容器之前，用预热器14和加热器17将超临界液体加热至所需温度。预热器14也起着脉动缓冲器的作用。超临界液体也用过滤器15(0.5μm)过滤。分别用热电偶29和压力传感器30测量超临界液在进入沉淀容器之前的温度和压力。
将改性剂从罐2中排出，用泵9通过管线34将它泵出，并在进入颗粒形成容器之前使它与超临界液体混合。也用过滤器12(0.5μm)将改性剂过滤。
管线34装有安全阀16。
把溶液从罐1排出，它用泵10通过管线36泵至颗粒形成容器。也用过滤器13(0.5μm)将此溶液过滤。
在另一形式方法中，改性剂可以一部分与溶液一起、一部分与超临界液体一起被送入颗粒形成容器中。纯的超临界液体或与改性剂的混合物，以及溶液，被喷嘴27送入颗粒形成容器内。
在沉淀容器22的下流方向，用过滤器24(0.5μm)将超临界液体、改性剂及溶剂的混合物过滤，把最终不被过滤器23留住的颗粒留下。将超临界液体、改性剂及溶剂的混合物用微计量阀25进行放压，在分离器26中把超临界液体与改性剂及溶剂分开，其流速用质量流动计31进行测量并排放出来。
图2和图3中所示的喷嘴使得溶液以及纯的或与改性剂混合的超临界液体以并流的方式被送到颗粒形成容器之中。溶液和超临界液体在喷嘴出口处的速度与质量流速及小孔的直径有关。此外，优选的是，溶液及超临界液体的能量压力被转变为其能量损失最小的动能之中。事实上图2和图3中的喷嘴是为此目的而设计的。喷嘴的特性是溶液和超临界液体通过小孔时发生膨胀。小孔的特征是长度与直径的比值在5至10的范围。它比毛细管的优越之处是压力能量损失减少了和有效地将压力能量转变为动能。喷嘴的小孔直径范围为0.02～0.04mm，长度范围为0.1～0.2mm。这一直径使得溶液和超临界液体在小孔出口处具有很高的速度。
喷嘴可以用不锈钢或其他合适材料制成。
此喷嘴是在其中心有小孔39，并且在与中心距离相等而且沿着圆周间隔相同钻着两个或多个与颗粒形成容器内部相通的小孔41。溶液通过中心小孔送入颗粒形成容器之中，而纯的或与改性剂混合的超临界液体则通过外部小孔被送入颗粒形成容器之中。溶液37通过直径D3的通道。其端部是圆锥形物40。在圆锥形端部40的顶点，有一个用激光钻的小孔39。中心小孔的长度L1是其直径D1的5至10倍。直径D1可如此选择，使得溶液在小孔出口具有任何所希望速度。
超临界液体38通过直径D4的通道。每一通道的端部有一个圆锥形物42。在圆锥形端部42的顶点有激光钻的小孔41。小孔的长度L1是直径D2的5至10倍。直径D2可如此选择，使得超临界液体在小孔出口处具有任何所希望的速度。
小孔39和41的长度(L1或L2)与直径(D1或D2)的比值的选择应使得能量损失最小，而且通过将能量压力转变为动能能够获得更高速度。
溶液从中心小孔39以高速度射出，其在与超临界液体接触时破裂成为小液滴。溶液液态射入的分散通过来自小孔41的超临界液体喷射而获得加强，其前提是超临界液体速度非常高，是在工作温度和压力下声速数值的级别。超临界液体在加强溶液液态射入的分散方面的作用是决定性的，它决定了产物的形状、大小和产率。
可将小孔钻到直径小于0.02mm。已用于实施本试验的喷嘴的小孔直径范围为0.02～0.04mm。在本发明的另一实施方案中，外部小孔中的一个或多个如此钻，使得它们的轴集中在中心小孔的轴上。外部小孔的轴与中心小孔的轴所成的角度在1至30°之间。
形成精细的干燥蛋白质微粒的方法的要点是溶液与超临辊液体的混合：迅速而紧密的混合引起小直径颗粒的形成，而且获得高的粉末产率。
为了获得良好的混合，溶液应以小液滴的形式分散到超临界液体之中，从而为质量转移提供大的界面积，为超临界液体分散进入溶液小滴中提供短的通道，从而防止溶质颗粒的生长。此外，超临界液体流速与溶液流速之间的高比值会在它们互相接触的时刻引起超临界液体相对于溶液大量过量，这增强了超临界液体进入溶液的质量转移驱动力，增强了溶剂进入超临界液体的质量转移驱动力。
当溶剂在超临界液体中的溶解度低时，使用改性剂使得在溶液与超临界液体之间产生更好混合。
当使用改性剂时，改性剂流速与溶液流速之间的比值应如此选择，使溶剂在超临界液体中的溶解度能获得大提高。改性剂可以与超临界液体或与溶液一起送入，或者是一部分与超临界液体和一部分与溶液一起送入。改性剂的引入方式大大影响溶剂的萃取以及所形成颗粒的结构。
为了使用二氧化碳作为超临界液体和使用乙醇作为改性剂而进行的来自水溶液的粉末沉淀，超临界液体流速与改性剂流速之间的比值优选在4～8的范围内，更优选为7，而改性剂流速与溶液流速之间的比值优选在15-25的范围之内，更优选为20。
如前面已指出的，溶液在超临界液体中有必要具有良好的分散性，以便获得溶液的很细液滴。
所形成的溶液液滴大小取决于在混合区的液体动力学条件，取决于溶液和超临界液体的物理性质，如粘度、表面张力、密度。这些性质大大受到超临界液体的温度和压力的影响。
超临界液体的入口沿着溶液入口排布，而且其距离很短(约3mm)：这种结构使得溶液能被超临界液体加上能量，因而能强化溶液分散成为很微细的液滴，两相之间产生大的界面积，以及使得溶剂被快速萃取进超临界液体之中。这些现象当超临界液体在小孔出口处的速度达到或大于声速，引起Mach盘生成和溶液分散成为很细液滴的时候，是特别有效的(Matson D.W.，Fulton J.L.，Petersen R.C.，Smith R.D.，“Rapid expansion ofsupercritical fluid solutions：solute formation of powders，thinfilms，and fibers”Ind.Eng.Chem.Res.，1987 26，2298-2306)。在液体中的声速强烈地依赖于压力和温度：对二氧化碳来说，在超临界区声速的最小值在8MPa和40℃时为208米/秒。利用上述现象的好处，对二氧化碳来说在超临界区在声速值附近例如在8MPa和40℃下在208米/秒之下工作，是方便的。
对于使用二氧化碳作为超临界液体和使用乙醇作为改性剂而用GAS法从水溶液生产细粉末，人们发现优化的操作条件是8-12MPa和30-50℃。在用于进行实验检验的实验设备中，超临界液体质量流速为30g/分钟，溶液流速为0.2g/分钟，改进剂质量流速为4g/分钟，这已将超临界液体相对于改进剂的质量流速比设置为7，将改进剂相对于溶液的质量流速比设置为20，以及将喷嘴出口处的超临界液体速度设置为约300米/秒。利用这一设备，采用GAS共沉淀法，我们实施这一方法，制造了此物质与稳定剂的稳定的干燥微粒。蛋白质例如碱性磷酸酯酶和溶菌酶被用作该物质，而海藻糖被用作稳定剂。生成了不同蛋白质/稳定剂比值的共沉淀粉末。收集到的粉末的产率为90％。与未加工的工业试剂相比，加工后保留的酶活性发现为95％～100％之内。这些粉末的粒径分布表明，大于90％的颗粒的等量直径小于10μm，粒径大小分布窄。此外，其物理化学性能表明，共沉淀使得蛋白质与稳定剂分子之间能紧密相互作用，而且对于每一对蛋白质/稳定剂，存在最佳的重量/重量比值。最后，对稳定剂的研究表明，碱性磷酸酯酶/海藻糖共沉淀颗粒比相应的冷冻干燥产物更稳定。
实验方法
将超临界液体用泵8送入沉淀容器中，泵8用于设定超临界液体流速。用加热器17使管线35中的超临界液体温度高于颗粒形成容器内的温度，要考虑由于通过喷嘴小孔时发生膨胀而使温度下降。然后用泵9将改性剂以预定流速加至超临界液体之中。当稳态条件达到后，用泵10将蛋白质和稳定剂的溶液加至颗粒形成容器之中。
在此之后，将一定数量的溶液送入颗粒形成容器中，把泵9和泵10停止，只要沉淀的粉末不含有溶剂和改性剂，就将超临界液体送入颗粒形成容器之中。
把颗粒形成容器放压，将粉末回收，并在氮气氛下封入10ml小瓶中。
通过在下列条件下贮存此小瓶而检验共沉淀的蛋白质的稳定性：25℃-60％RH；30℃-65％RH；40℃-75％RH。在t＝0、1、2、3和6个月时分析每个样品的生物活性。作为比较，进行了平行实验，实验是在超临界液体沉积出的原样蛋白质、在类似的冷冻干燥产物及在未加工工业产物上进行的，它们均贮存在干的氮气之下。
实施例1
制备碱性磷酸酯酶(ALP)/海藻糖共沉淀颗粒
在这一实施例中，本发明的方法用于碱性磷酸酯酶(ALP)和海藻糖的共沉淀混合物。
使用了溶于去离子水中的含有浓度为0.2％w/w ALP(SIGMA Chemicals)和浓度在0-2％w/w范围内的海藻糖(SIGMA Chemicals)的溶液。
所得粉末的ALP/海藻糖比例如下：1∶10、1∶2和1∶0。用二氧化碳作为超临界液体，乙醇作为改性剂。
用泵10在0.2g/分钟的流速下将溶液送入颗粒形成容器22中。用泵8在30g/分钟的流速下将超临界二氧化碳送入，用泵9在4g/分钟的流速下把乙醇送入管线34中，并在进入颗粒形成容器之前将它与超临界二氧化碳混合。
将超临界液体通过喷嘴的四个外部小孔注射入颗粒形成容器之中，每个小孔的直径为0.04mm。将溶液通过喷嘴的中心小孔注射入颗粒形成容器之中，此小孔的直径为0.04mm。全部小孔的长度均为0.2mm。
分别用加热夹套21和微计量调节阀25使颗粒形成容器内的温度维持在恒定的40℃，压力维持在100±1巴。把沉淀颗粒收集在位于颗粒形成容器底部的过滤器23之上，而超临界液体、改性剂及水在大气压下收集在圆筒26之中。
只要获得足够量的粉末，则进行此过程。在溶液和改性剂停止输送后，仅将纯二氧化碳送入颗粒形成容器之中，以便从沉淀粉末中萃取任何痕量的溶剂和改性剂。典型的情况是用两倍体积的二氧化碳洗涤颗粒形成容器以便获得干的粉末。
在放压之后，打开颗粒形成容器，回收粉末，并在干燥氮气下贮存于10ml小瓶中。
收集到的粉末的产率是90％。
与未加工过的工业试剂相比，ALP的残余酶活性在95％与100％之内。粉末的光学显微镜分析表明，在海藻糖含量高时，例如对ALP/海藻糖来说比值为1∶10时，粉末由两种不同集群的颗粒形成：最常见的一种是由针形颗粒形成，而另一种则由圆形颗粒形成。针形颗粒与用海藻糖制得的那些相似，与超临界CO2沉淀的一样。低海藻糖含量粉末仅显示圆形颗粒集群。因此，在低海藻糖含量(蛋白质/海藻糖比例1∶2)时，海藻糖能与ALP用超临界CO2共沉淀，仅生成一类颗粒。从溶菌酶/海藻糖共沉淀也观察到相似情况(见实施例2)。用冷冻干燥法制备类似产品。在这一情况下，与未加工的工业试剂相比，发现ALP残留酶活性在95％和104％之内。
也在干燥氮气下准备放有未加工工业ALP或类似冷冻干燥产物的相同小瓶。
稳定性研究
将每类的若干个小瓶在下列每种条件下放置：25℃-60％RH；30℃-65％RH；40℃-75％RH，存放6个月，在t＝0、1、2、3、6个月，检查每个小瓶内装物的ALP活性。稳定性研究的结果总结在表1中。
被超临界CO2沉淀的纯ALP(样品F6)表明，在全部情况下酶活性均下降。在40℃-75％RH(最极端的条件)下6个月后残留酶活性是t＝0时的值的70％。
与之相反，在比值为1∶10时，用超临界CO2共沉淀ALP/海藻糖(样品FT8)，在全部条件下其活性均无明显损失。
在40℃-75％RH，纯的冷冻干燥ALP(样品F8)以及SIGMA工业产物显示相似的损失，在6个月后仅保留43％和42％的起始酶活性。在别的条件下，SIGMA产物显示比纯的冷冻干燥ALP慢的活性损失。事实上，6个月之后检测到下列残留酶活性：在25℃-60％RH下95％相对于83％，而在30℃-65％RH下86％相对于76％。
最后，ALP/海藻糖比值为1∶10的冷冻干燥粉末(样品FT10)显示活性早期迅速损失，然后直到6个月则较慢，它看来与贮存条件无关。事实上，在250℃-60％RH、30℃-65％RH和40℃-75％RH，残留酶活性分别为起始值的90％、88％和90％。
实施例2
制备溶菌酶/海藻糖共沉淀颗粒
在这一实施例中，用本发明的方法，使用溶菌酶和海藻糖制备共沉淀粉末。
使用溶于去离子水中的含有浓度在0.2-1％w/w溶菌酶(SIGMAChemicals)的和浓度在0-2％w/w的海藻糖(SIGMA Chemicals)的溶液。所得粉末的溶菌酶/海藻糖比例如下：1∶10、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1和1∶0(表2)。
用二氧化碳作为超临界液体，用乙醇作为改性剂。
用泵10在0.2g/分钟的流速下将含酶及稳定剂的水溶液送入颗粒形成容器22中。用泵8在30g/分钟的流速下将超临界二氧化碳送入，用泵9在4g/分钟的流速下把乙醇送入管线34中，并在进入颗粒形成容器之前将它与超临界二氧化碳混合。
将超临界液体通过喷嘴的四个外部小孔注射入颗粒形成容器之中，每个小孔的直径为0.04mm。将溶液通过喷嘴的中心小孔注射入颗粒形成容器之中，此小孔的直径为0.04mm。全部小孔的长度均为0.2mm。
分别用加热夹套21和微计量调节阀25使颗粒形成容器内的温度维持在恒定的40℃，压力维持在100±1巴。把沉淀颗粒收集在位于颗粒形成容器底部的过滤器23之上，而超临界液体、改性剂及最终未被沉淀的溶质在大气压下收集在圆筒26之中。
在此之后，把一定数量的溶质送入颗粒形成容器之中，停止泵9和10，而仅把超临界液体送入颗粒形成容器之中，以便把沉淀的粉末干燥：典型的情况是，需要颗粒形成容器体积的约2倍的超临界液体以获得干燥粉末。
在此刻，把颗粒形成容器放压，打开，收集粉末。
回收到的粉末的产率为90％。
与未加工工业产物相比，发现溶菌酶的残留酶活性为96％～100％。
表2报导了每个样品的溶菌酶/海藻糖的比，保留的酶活性，与沉淀均匀性相关的蛋白质含量，颗粒集群数目和颗粒大小。正如所能看到的，对全部样品来说，酶活性及蛋白质含量与理论值很相近。因此，我们采用的实验条件使蛋白质和糖类均生成相似的沉淀，而且保证几乎完全恢复生物活性。
由SEM显微镜的图像分析计算出的粉末粒径分布表明，由超临界CO2沉淀制得的全部粉末，多于90％的颗粒的等值直径小于10μm，粒子大小分布窄。图4、5、6分别表示溶菌酶/海藻糖比值为1∶10、1∶2和1∶0的超临界CO2共沉淀的粒径分布。别的共沉淀物产生相似分布。此外，用光学显微镜分析进行的粉末观察表明，在例如溶菌酶/海藻糖比值为1∶10和1∶5这两种高海藻糖含量的情况下，粉末由两种颗粒集群组成：最常见的一种是由针形颗粒形成，而另一种由圆形颗粒形成。针形颗粒与用超临界CO2沉淀由海藻糖制得的很相似。与此相反，在低海藻糖含量(溶菌酶/海藻糖的比值为1∶2)时，这些粉末仅显示图形颗粒集群。因此，可以用超临界CO2使溶菌酶与海藻糖共沉淀，在低海藻糖含量(即高蛋白质/海藻糖比值)下仅形成一类颗粒。因此，存在一个能保证在两种分子之间产生最好相互作用的最佳蛋白质/海藻糖比值。这一情况也已被DSC分析证明。图7表示各种共沉淀的溶菌酶粉末的DSC差示热分析图。作为参考，也报导了纯的沉淀的溶菌酶和海藻糖。正如能看到的，在较高海藻糖含量(比值1∶5)时，样品含有以与沉淀海藻糖本身相同方式能回收结晶(在197℃的放热峰)并随后在214℃熔化的海藻糖。较低含量海藻糖样品的热性能是很不同的。比值1∶2至4∶1的样品显示与溶菌酶原本之一相似的差示热分析图。最相关的差别是移向在T＝204℃的较低的溶菌酶特征转变温度。海藻糖含量越高，则转变温度越低。因此，我们已有力地证明，超临界液体引起的共沉淀使得蛋白质与海藻糖之间能紧密相互作用。事实上在高达一定量的糖(1∶2的比值)时我们获得了均匀的固相。这一比值使得能产生最好的蛋白质/糖相互作用和蛋白质的最好长期稳定性。
表1 样品/干 燥方法 ALP/海藻 糖比值 贮存条件 1个月的酶活性 (t＝0下的％)2个月时的酶活性(t＝0下的％)3个月时的酶活性(t＝0下的％)6个月时的酶活性(t＝0下的％) ALP Sigma 冷冻 干燥 1∶0 -20℃ ---96 25℃/60％RH 10110010195 30℃/70％RH 1031039486 40℃/75％RH 94857542 ALP F6 SCF 1∶0 -20 ---- 25℃/60％RH 91726967 30℃/70％RH 101715959 40℃/75％RH 64695857 ALP F8 1∶0 -20℃ ---- 25℃/60％RH 88898983 冷冻 干燥 30℃/70％RH 83 87 87 76 40℃/75％RH 75 75 62 43 ALP FT8 SCF 1∶10 -20 - - - 101 25℃/60％RH 111 99 113 99 30℃/70％RH 104 97 102 99 40℃/75％RH 113 98 101 99 ALP FT10 冷冻 干燥 1∶10 -20℃ - - - 95 25℃/60％RH 95 95 93 90 30℃/70％RH 94 96 92 88 40℃/75％RH 94 93 92 90
表2 样品 溶菌酶/海藻糖 比值 酶活性 (mg酶/mg蛋白质) 蛋白质含量 (％，标称) 颗粒集群数 颗粒大小 (％＜10jim) L3 1∶0 0.96 102.6 1 99 LT2 1∶10 1.04 104.3 2 - LT3 1∶1 0.96 100.8 1 98 LT6 1∶5 0.96 104.0 2 92 LT8 4∶1 1.01 103.2 1 97 LT9 1∶2 0.98 104.0 1 93 LT10 2∶1 0.97 103.9 1 97