一种基于氧化硅纳米颗粒构建多功能基因治疗载体及药物载体的方法.pdf

本发明属于非病毒基因载体及药物载体制备技术领域，具体涉及以不同形貌、尺寸的氧化硅纳米颗粒为基质，利用表面修饰功能化氧化硅纳米颗粒，以原子转移自由基聚合(ATRP)法构建多功能载体。本发明所采用表面修饰手段、聚合反应温和，易于调控，可根据需要制备出多种不同聚合度的多功能基因治疗载体及药物载体，并且其储存稳定性好。该多功能基因治疗载体及药物载体在HepG2、COS7、293、C6、Hela等细胞中具有高于国际上“金标”PEI的转染效率，并且细胞毒性远低于高分子线性PDMAEMA。此外，氧化硅纳米颗粒形貌易于调控，可根据不同细胞系设计特殊形貌及尺寸，并且氧化硅纳米颗粒的多孔结构可以装载多种不同药物分子，为新型基因/药物的开发打下了良好的实验基础。

权利要求书
1.  一种基于氧化硅纳米颗粒构建多功能基因治疗载体及药物载体的方法，其特征在于，其 具体操作步骤为：
1)硅烷偶联剂法制备氨基功能化氧化硅纳米颗粒：先将乙醇与水混合均匀，然后加入 3-氨丙基三乙氧基硅烷充分混合，再加入氧化硅纳米颗粒分散均匀后0-80℃反应1-10h，最 后加入三乙胺0-80℃继续反应12-48h；将所得产物用甲醇、乙醇、或水离心洗涤，真空干 燥，100-150℃高温固化1-6h；其中氧化硅纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为 0.1-50，优选0.5-10；氧化硅纳米颗粒与三乙胺的质量比为0.01-20，优选0.1-4.5；氧化 硅纳米颗粒与水的质量比为0.01-50，优选0.01-10；氧化硅纳米颗粒与乙醇的质量比为 0.01-50，优选0.01-4.5；
2)制备氧化硅纳米颗粒引发剂：先将步骤1)制备的氨基功能化氧化硅纳米颗粒溶于有 机溶剂，然后加入2-溴异丁酰溴、三乙胺，室温反应1-12h；产物用体积比为0.1-2的甲醇 与水混合溶剂离心洗涤，真空干燥；其中氨基功能化氧化硅纳米颗粒与2-溴异丁酰溴的质量 比为0.01-10，优选0.5-9.5；氨基功能化氧化硅纳米颗粒与有机溶剂质量比为50-500；氨 基功能化氧化硅纳米颗粒与三乙胺质量比0.01-20。
3)ATRP聚合反应：在无氧环境下先将步骤2)制备的氧化硅纳米颗粒引发剂溶于水， 然后加入有机溶剂、单体，再加入配体，最后加入CuBr2、CuBr引发活性可控自由基聚合； 反应温度为0-60℃，优选5-55℃，更优选10-50℃；反应时间为l-200min，优选l-190min； 其中水与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为50-500，优选50-490；单体与氧化硅纳米颗粒 引发剂的质量比为50-500，优选50-490；配体与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为1-50， 优选1-15；CuBr与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为0.1-10，优选0.1-9.5；CuBr2与氧化 硅纳米颗粒引发剂的质量比为0.1-5，优选0.1-4.5；有机溶剂与氧化硅纳米颗粒引发剂的 质量比为50-500，优选50-490；
4)步骤3)的聚合反应完成后加入水或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合， 水的加入量为氧化硅纳米颗粒引发剂质量的100-500倍；然后放入截留分子量为2500-4500MW 的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得基 于氧化硅纳米颗粒构建的多功能基因治疗载体及药物载体。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氧化硅纳米颗粒的形貌为实心球、空 心球、非手性棒、或手性棒。

3.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的实心球形貌的氧化硅纳米颗粒的制备 方法：将0.01-2g十六烷基三甲基溴化铵溶于50-500mL水，再加入0.2-5mL浓度为0.5-5M 的NaOH溶液，搅拌均匀后加入0.5-5mL正硅酸乙酯，27-150℃下剧烈搅拌反应1-10h；产物 离心收集，27-100℃干燥，400-600℃煅烧3-24h以去除模板。

4.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的空心球形貌的氧化硅纳米颗粒的制备 方法：将0.01-2g十六烷基三甲基溴化铵溶于50-500mL水，加入0.01-1g全氟辛酸，再加 入0.2-5mL浓度为0.5-5M的NaOH溶液，搅拌均匀后加入0.5-5mL正硅酸乙酯，27-150℃下 剧烈搅拌反应1-10h；产物离心收集，27-100℃干燥，400-600℃煅烧3-24h以去除模板。

5.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的非手性棒形貌的氧化硅纳米颗粒的制 备方法：将0.01-2g十六烷基三甲基溴化铵溶于30-300mL水，加入0.5-20mL浓度为2.5-25wt％ 的氨水，最后加入0.5-5mL正硅酸乙酯，25-40℃下搅拌反应1-12h；产物离心收集，27-100℃ 干燥，400-600℃煅烧3-24h以去除模板。

6.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的手性棒形貌的氧化硅纳米颗粒的制备 方法：将0.03-3g十六烷基三甲基溴化铵溶于50-500mL水，加入0.05-5g的PEO基三嵌段 共聚物EO106PO70EO106，然后加入0.5-20mL浓度为2.5-25wt％的氨水，最后加入0.5-5mL正硅 酸乙酯，搅拌0.5-10min后在25-40℃下静置反应1-12h；产物离心收集，27-100℃干燥， 400-600℃煅烧3-24h以去除模板。

7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单体为甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、 甲基丙烯酸缩水甘油醚、N-异丙基丙烯酰胺中的一种或几种。

8.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的配体为2,2-联吡啶、1,1,4,7,10,10- 六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种。

9.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自砜类、亚砜类、酰胺类、 醇类中的一种或几种。

说明书一种基于氧化硅纳米颗粒构建多功能基因治疗载体及药物载体的方法
技术领域
本发明属于非病毒基因载体及药物载体技术领域，具体涉及以氧化硅纳米颗粒为基质， 利用表面修饰功能化氧化硅纳米颗粒，以原子转移自由基聚合(ATRP)法构建多功能基因治 疗载体及药物载体的方法。
背景技术
随着癌症以及其它基因类疾病发病率的升高，基因治疗在癌症以及其它疾病治疗中的应 用引起人们的广泛关注。基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠 正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的，即将外源基因通过基因转移技术 将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基 因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。目前基因治疗在攻克人类 癌症、遗传疾病以及心血管等重大疾病方面起到举足轻重的作用。选择合适的基因载体和药 物基因复合，使目的基因能够在靶细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达是基因治疗的 关键问题之一。
基因载体作为基因导入细胞的工具，功能为将目的基因送至宿主细胞，跨过细胞膜及细 胞外基质，将基因导入细胞核内，使之得到复制和表达。目前使用的基因载体可分为病毒性 载体和非病毒性载体。病毒载体有逆转录病毒(retrovirus,RV)、腺病毒(adenovirus,AV)、 腺相关病毒(adeno-associated virus,AV)、疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、 慢病毒(lentivirus)等。病毒载体转染效率高，但改造病毒易引发机体强烈的免疫反应， 具有潜在致癌性且其价格昂贵。这些缺陷使得病毒性载体的应用受到很大限制。常见的非病 毒性载体包括裸DNA(naked DNA)、脂质体和脂质体复合物(liposanes or lipoplexes)以 及阳离子高聚物(cationic polymer)。裸露DNA转染主要采用物理方法，例如针注射、基因 枪、电穿孔等，将目的基因直接导入细胞中进行表达。脂质体由磷脂双层构成，为两亲性结 构分子，通过自组装可构成水相内核的脂质微囊，将DNA包裹，可用作制备靶向性、无免疫 原性、缓释时间长、毒副作用低及载药率高的抗癌药物载体。阳离子高聚物不仅具有低毒、 低免疫原性、低致癌性，易于制备和携带目的基因、强静电作用、有效络合DNA等特点，且 其便于进行靶向性和生物适用性改性，是近年来研究最广泛的基因载体材料。
化学疗法是将药物经血管带到全身，因为所用药物都是有害，甚至是带毒性的，体内细 胞，无论是否为癌细胞，都受到破坏。这极大地影响了化疗的治疗效果，对患者的身心造成 了很大的伤害。提高化疗效果的关键是如何提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用。通过 载体包裹抗肿瘤药物，能够减少体内酶对抗肿瘤药物的破坏与降解从而提高了药物在体内的 稳定性。同时包裹在载体内的抗肿瘤药物通过缓释过程能够在较长时间内保持有效的血液浓 度，延长药物的作用时间，提高抗肿瘤药物的利用率，降低药物使用的频率。更为重要的是 可以通过在抗肿瘤药物载体上修饰各类靶向分子实现药物的靶向运输，降低药物的毒副作 用。纳米科技的发展及纳米药物输送体系的建立使得医药领域很多传统难题得以解决，纳米 诊疗体系相比于传统药物，其靶向性、生物利用度等都有很大提高，同时此类新型体系可以 改善药物稳定性及药物释放动力学行为，从而更大程度地提高治疗效果并减小副作用。因此， 开发新型、多样化的纳米药物输送体系是贯穿纳米生物医学的重要课题。目前，常见的药物 载体有脂质体、高分子聚合物、金纳米颗粒介孔二氧化硅、量子点等。近年来，无机纳米粒 子因其具有光、电、磁等独特性质、尺寸形貌可控性好、比表面积大等一系列优点，引起了 人们的广泛关注。
介孔二氧化硅纳米颗粒的研究始于20世纪90年代，研究者们先后合成了具有六方、立 方孔道，孔径为2-10nm的MCM-41、MCM-48型介孔二氧化硅材料。介孔二氧化硅由于具有 有序且连续可调的介孔结构、大的比表面积、优良的生物相容性及表面功能基团易于被修饰 等特性，更是成为药物输送体系研究的热点，尤其，介孔氧化硅材料骨架结构稳定、孔径规 则且在2-50nm范围内连续可调、表面富含羟基易于修饰等优点，可以有效装载和输送不同 大小和种类的药物。通过改变介孔二氧化硅的结构参数，如孔径、比表面积和比孔容等，可 以实现对药物释放的改善。特定形貌的介孔材料的制备在工业上的应用是非常重要的，例如 氧化硅膜材料在催化，分离，光学器件上的应用以及单分散球结构在色谱分离等方面的应用 等等。因此介孔氧化硅材料的形貌控制生长也成为一项重要的基础研究工作。由于介孔氧化 硅生长过程中，中间态液晶相自组装行为变化丰富，导致介孔氧化硅的形貌也丰富多变。由 于其同时又兼有可控的规则的孔道结构，因此能否同时实现介孔材料在微观和宏观两个层次 的可控制备。介孔氧化硅的形貌很大程度上是由其中间态液晶相结构所决定的，因此能够对 这一自组装结构有影响的因素也都同时是影响产物形貌的重要因素。例如，两亲分子可能的 自组装结构，硅源及其水解缩聚，硅酸盐与两亲分子头基不同的作用方式，表面活性剂的浓 度，有机分子以及无机盐添加剂，温度，搅拌速度以及pH值影响等等都是介孔化合物形貌 的重要因素，实验过程中对这些条件进行改变可以实现对不同形貌的介孔氧化硅的形貌控 制。到目前，人们已相继合成了多种形貌的介孔氧化硅，如球状，囊泡状，陀螺，多面体， 纳米棒，纳米线，纳米纤维，须状，螺旋，纳米带，纳米管，薄膜，薄片，单块等。目前， 纳米技术发展虽然可以合成许多形貌的介孔氧化硅纳米颗粒，但是氧化硅纳米颗粒的均一 性、分散性仍旧是合成一大难题。
近年来，随着活性/可控自由聚合(living/controlled radical polymerization,LRP) 研究的快速发展，LRP技术在制备具有新颖特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大发展。 LRP集活性可控聚合与自由基聚合的优点为一身，不但可得到相对分子量分布极窄、相对分 子量可控、结构明晰的高分子，而且可聚合的单体多，反应条件温和易控制。所以，LRP技 术具有极高的实用价值，受到了高分子化学家们的重视。其中，ATRP(原子转移自由基聚合) 近几年得到了迅速发展并有着重要应用价值。其所用引发剂一般为卤代烷烃，基本原理是通 过一交替的“活化-去活”可逆反应使体系中游离基浓度极低，迫使不可逆终止反应降低到 最低程度，而链增长反应仍可进行，从而实现“活性”聚合。ATRP反应温度适中，适用单体 范围广，甚至可以在少量氧存在下进行，对高分子材料的分子设计不需复杂的合成路线，是 现有其它活性聚合方法无法比拟的，因此可以说ATRP技术的出现开辟了活性聚合的新领域。
随着高分子科学、医学、生物学以及工程学等多门学科的相互交融、相互渗透和迅速发 展，高分子基因载体材料进入一个快速发展的时期。目前，文献中报道一系列非病毒阳离子 聚合物载体，包括聚-L-赖氨酸(poly(L-Iysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(poly (amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N，N-二甲酚基乙酯(poly(2-dimethylaminoethyl  methacrylate),PDMAEMA)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)等。其中PEI具有较高的 转染效率，是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是上述阳离子聚合物仍具有相当高的 毒性，大大限制了它们的应用。这样，开发低毒而高效阳离子聚合物是研究非病毒基因载体 的核心内容。最近，我们发现以多糖为骨架的聚阳离子的星状或者梳妆的基因载体，具有较 高的基因转染效率和较低的细胞毒性。所以我们以氧化硅纳米颗粒构建低毒高效的星状阳离 子基因载体，并且探索不同形貌以及尺寸的载体体系在不同细胞系中的应用效果，达到在诊 断和治疗中最佳的效果。
综上所述，尽管在利用活性可控自由基聚合法制备以氧化硅纳米颗粒为基质的多功能基 因载体方面已经做了很多工作，但是在技术方面还有以下问题需要解决：
1、在制备高性能氧化硅基因载体时，如何尽可能保证氧化硅纳米颗粒的均一性、分散 性以及相同的表面理化性质是探索最优形貌尺寸基因载体的前提。
2、如何在氧化硅纳米颗粒表面引入ATRP引发点，保证反应高效接入大量引发点，并保 证引发点均匀分布于表面，且接入引发点可以在聚合反应条件下稳定不脱离氧化硅纳米颗粒 表面，高效高质接入ATRP引发点是聚合反应顺利进行的前提。
3、在制备高性能氧化硅基因载体时，随着单体不断的接枝到氧化硅纳米颗粒表面，阳 离子基因载体的分子量随之增大，细胞内吞作用增大，转染效率增加，但是细胞的毒性也随 之增大，如何最大限度的降低基因载体的毒性成为需要解决的问题。
4、随着聚合物分子量的增大，氧化硅纳米颗粒的形貌及尺寸发生变化，探索合适的接 入聚合物的含量，控制形貌、尺寸以及接入聚合物的含量三个变量寻找最佳性能的载体材料 成为一大难点。
发明内容
本发明以不同形貌、尺寸的氧化硅纳米颗粒为基质，利用表面修饰功能化氧化硅纳米颗 粒，以原子转移自由基聚合(ATRP)法构建多功能基因治疗载体及药物载体。该多功能基因 治疗载体及药物载体具有低毒性，高转染效率，并且形貌、尺寸可控，可根据不同细胞系应 用要求设计材料。该方法原料价格相对低廉，制备过程温和，简单易行，制备得到产物具有 良好的稳定性，水溶液分散性和生物相容性，形貌尺寸可调控，可根据不同的应用环境设计 材料，具有潜在的基因载体、药物载体的潜在应用前景。
本发明所述的基于氧化硅纳米颗粒构建多功能基因治疗载体及药物载体的方法为：
1)硅烷偶联剂法制备氨基功能化氧化硅纳米颗粒：先将乙醇与水混合均匀，然后加入 3-氨丙基三乙氧基硅烷充分混合，再加入氧化硅纳米颗粒分散均匀后0-80℃反应1-10h，最 后加入三乙胺0-80℃继续反应12-48h；将所得产物用甲醇、乙醇、或水离心洗涤，真空干 燥，100-150℃高温固化1-6h；其中氧化硅纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为 0.1-50，优选0.5-10；氧化硅纳米颗粒与三乙胺的质量比为0.01-20，优选0.1-4.5；氧化 硅纳米颗粒与水的质量比为0.01-50，优选0.01-10；氧化硅纳米颗粒与乙醇的质量比为 0.01-50，优选0.01-4.5；
2)制备氧化硅纳米颗粒引发剂：先将步骤1)制备的氨基功能化氧化硅纳米颗粒溶于有 机溶剂，然后加入2-溴异丁酰溴、三乙胺，室温反应1-12h；产物用体积比为0.1-2的甲醇 与水混合溶剂离心洗涤，真空干燥；其中氨基功能化氧化硅纳米颗粒与2-溴异丁酰溴的质量 比为0.01-10，优选0.5-9.5；氨基功能化氧化硅纳米颗粒与有机溶剂质量比50-500；氨基 功能化氧化硅纳米颗粒与三乙胺质量比0.01-20。
3)ATRP聚合反应：在无氧环境下先将步骤2)制备的氧化硅纳米颗粒引发剂溶于水， 然后加入有机溶剂、单体，再加入配体，最后加入CuBr2、CuBr引发活性可控自由基聚合； 反应温度为0-60℃，优选5-55℃，更优选10-50℃；反应时间为l-200min，优选l-190min； 其中水与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为50-500，优选50-490；单体与氧化硅纳米颗粒 引发剂的质量比为50-500，优选50-490；配体与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为1-50， 优选1-15；CuBr与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为0.1-10，优选0.1-9.5；CuBr2与氧化 硅纳米颗粒引发剂的质量比为0.1-5，优选0.1-4.5；有机溶剂与氧化硅纳米颗粒引发剂的 质量比为50-500，优选50-490；
4)步骤3)的聚合反应完成后加入水或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合， 水的加入量为氧化硅纳米颗粒引发剂质量的100-500倍；然后放入截留分子量为2500-4500MW 的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得基 于氧化硅纳米颗粒构建的多功能基因治疗载体及药物载体。
所述的氧化硅纳米颗粒的形貌为实心球、空心球、非手性棒、或手性棒。
所述的实心球形貌的氧化硅纳米颗粒的制备方法：将0.01-2g十六烷基三甲基溴化铵溶 于50-500mL水，再加入0.2-5mL浓度为0.5-5M的NaOH溶液，搅拌均匀后加入0.5-5mL正 硅酸乙酯，27-150℃下剧烈搅拌反应1-10h；产物离心收集，27-100℃干燥，400-600℃煅烧 3-24h以去除模板。
所述的空心球形貌的氧化硅纳米颗粒的制备方法：将0.01-2g十六烷基三甲基溴化铵溶 于50-500mL水，加入0.01-1g全氟辛酸，再加入0.2-5mL浓度为0.5-5M的NaOH溶液，搅 拌均匀后加入0.5-5mL正硅酸乙酯，27-150℃下剧烈搅拌反应1-10h；产物离心收集，27-100℃ 干燥，400-600℃煅烧3-24h以去除模板。
所述的非手性棒形貌的氧化硅纳米颗粒的制备方法：将0.01-2g十六烷基三甲基溴化铵 溶于30-300mL水，加入0.5-20mL浓度为2.5-25wt％的氨水，最后加入0.5-5mL正硅酸乙酯， 25-40℃下搅拌反应1-12h；产物离心收集，27-100℃干燥，400-600℃煅烧3-24h以去除模 板。
所述的手性棒形貌的氧化硅纳米颗粒的制备方法：将0.03-3g十六烷基三甲基溴化铵溶 于50-500mL水，加入0.05-5g的PEO基三嵌段共聚物EO106PO70EO106，然后加入0.5-20mL浓度 为2.5-25wt％的氨水，最后加入0.5-5mL正硅酸乙酯，搅拌0.5-10min后在25-40℃下静置 反应1-12h；产物离心收集，27-100℃干燥，400-600℃煅烧3-24h以去除模板。
所述的单体为甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油醚、N-异丙基丙烯酰 胺中的一种或几种。
所述的配体为2,2-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4- 联吡啶中的一种或几种。
所述的有机溶剂选自砜类、亚砜类、酰胺类、醇类中的一种或几种。
有益效果：本发明所采用表面修饰手段、聚合反应温和，易于调控，可根据需要制备出 多种不同聚合度的高性能的多功能基因治疗载体及药物载体，并且其储存稳定性好，放置几 天或几个月后仍可保持原有性能。该多功能基因治疗载体及药物载体在HepG2、COS7、293、 C6、Hela等细胞中具有高于国际上“金标”PEI的转染效率，并且细胞毒性远低于高分子线 性PDMAEMA，使用方法简单，具有商业化潜力。此外，氧化硅纳米颗粒形貌易于调控，可根 据不同细胞系设计特殊形貌及尺寸，并且介孔氧化硅纳米颗粒的多孔结构可以装载多种不同 药物分子，为新型基因/药物的开发打下了良好的实验基础。
附图说明
图1是实施例1合成的不同形貌、尺寸的氧化硅纳米颗粒透射电子显微镜图。
图2是细胞毒性图；甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯为参照。
图3是转染效率图。PEI和甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯为参照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲述的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
实施例1
1)硅烷偶联剂法制备氨基功能化氧化硅纳米颗粒：先将18mL乙醇与2mL水混合均匀，然 后加入300μL3-氨丙基三乙氧基硅烷充分混合，再加入200mg氧化硅纳米颗粒分散均匀后 室温反应6h，最后加入160μL三乙胺继续室温反应12h；将所得产物11000rpm离心乙醇洗 三次，真空干燥，130℃高温固化3h；
2)制备氧化硅纳米颗粒引发剂：取氨基功能化氧化硅纳米颗粒100mg溶于12mL CH2Cl2，然 后加入1.2mL2-溴异丁酰溴与1.2mL三乙胺，室温反应3h，用甲醇与水混合溶剂(甲醇： 水体积比为1:1)11000rpm离心洗三次，真空干燥；
3)ATRP聚合反应：在氮气环境下先将20mg氧化硅纳米颗粒引发剂溶于2mL水，然后加入 3mL甲醇，1mL甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，再加入30μL五甲基二乙烯三胺，最后加入 10mg CuBr2，1mg CuBr，室温下控制反应时间30min；
4)步骤3)的聚合反应完成后暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，然后放入截留分 子量为2500-4500MW的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至 除去所有水分即得基于氧化硅纳米颗粒构建的多功能基因治疗载体及药物载体。
上述使用的氧化硅纳米颗粒分别为实心球NS100、空心球HNS100、非手性棒NR300、手 性棒CNR200、手性棒CNR300。
实心球NS100制备方法：0.2g十六烷基三甲基溴化铵溶于96mL H2O，再加入0.7mL NaOH (2mol/L)，最后加入1mL正硅酸乙酯，80℃下剧烈搅拌反应2h；产物离心收集，60℃干 燥，550℃煅烧6h以去除模板。
空心球HNS100：0.2g十六烷基三甲基溴化铵溶于96mL H2O，加入0.055g全氟辛酸，再 加入0.7mL NaOH(2mol/L)，最后加入1mL正硅酸乙酯，80℃下剧烈搅拌反应2h；产物 离心收集，60℃干燥，550℃煅烧6h以去除模板。
非手性棒NR300：将0.2g十六烷基三甲基溴化铵溶于70mL H2O，加入1.5mL氨水(25 wt％)，再加入1.2mL正硅酸乙酯，27℃搅拌下反应3h；产物离心收集，60℃干燥，550℃ 煅烧6h以去除模板。
手性棒CNR200：将0.375g十六烷基三甲基溴化铵溶于100mL水，加入0.2g PEO基 三嵌段共聚物EO106PO70EO106(F127)，然后加入1.3mL氨水(25wt％)，搅拌下加入1mL正硅 酸乙酯，搅拌3min后，将得到的反应液在27℃下静置反应3h；产物离心收集，60℃干燥， 550℃煅烧6h以去除模板。
手性棒CNR300：将0.4g十六烷基三甲基溴化铵溶于100mL水，加入0.25g PEO基三 嵌段共聚物EO106PO70EO106(F127)，然后加入2mL氨水(25wt％)，搅拌下加入1.2mL正硅酸乙 酯，搅拌3min后，将得到的反应液在27℃下静置反应3h；产物离心收集，60℃干燥，550℃ 煅烧6h以去除模板。
使用不同形貌的氧化硅纳米颗粒HNS100、NR300、CNR200、CNR300，相应得到的基于氧 化硅纳米颗粒构建的多功能基因治疗载体及药物载体记为HNS100-PD40、HNS100-PD80、 NR300-PD40、NR300-PD80、CNR200-PD40、CNR200-PD80、CNR300-PD40、CNR300-PD80。
使用透射电子显微镜、细胞毒性和细胞转染表征上述获得的基于氧化硅纳米颗粒构建的 多功能基因治疗载体及药物载体。
(1)透射电子显微镜
透射电子显微镜结果表明，本发明所合成氧化硅纳米颗粒具有不同的形貌、尺寸，有良 好的分散性和均一性。参照说明书附图1。
(2)细胞毒性
细胞毒性实验结果表明，本发明所合成的不同形貌、尺寸氧化硅纳米颗粒为基质的阳离 子载体相比于线性PDMAEMA来说对HepG2、COS7细胞没有明显的毒性。参照说明书附图2。
(3)细胞转染
细胞转染实验结果表明，本发明所合成的不同形貌的新型多功能基因载体相比于PEI来 说转染效率有了明显的提升，不同形貌、尺寸以及聚合物含量的阳离子氧化硅纳米颗粒载体 对于不同细胞系有不同效果，对于HepG2、COS7细胞系，以手性棒氧化硅作为基质、轴径比 越大、聚合物含量越高的基因载体转染效果最佳。参照说明书附图3。
通过透射电镜(TEM)来观察所合成不同形貌、尺寸氧化硅纳米颗粒的形态，通过X射 线光电子能谱(XPS)对氧化硅纳米颗粒表面修饰后产物进行了分析，用热重分析(TG)对 聚合反应后载体中单体的含量进行了研究。使用激光粒度及电位分析仪表征所得产物的粒 径、zeta电位。最后，通过凝胶电泳实验测试所得基因载体络合DNA的能力，细胞转染、细 胞毒性实验测试了产物载体的转染效率和生物相容性。