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1、10申请公布号CN104188957A43申请公布日20141210CN104188957A21申请号201410232851922申请日20140528A61K31/365200601A61P9/10200601A61K31/12220060171申请人中国中医科学院西苑医院地址100091北京市海淀区西苑操场1号中国中医科学院西苑医院72发明人史大卓刘剑刚赵福海梁鑫淼丰加涛王欣张大武刘艳芳王培利杜健鹏崔源源74专利代理机构北京同辉知识产权代理事务所普通合伙11357代理人刘洪勋54发明名称一种防治再狭窄的药物及其制备和使用方法57摘要本发明公开了一种防治再狭窄的药物及其制备和使用方法，所述。
2、药物的有效成分包括愈创木烷型倍半萜化合物P1、P2和P3；所述P1为ZEDOALACTONEB，所述P2为所述P1的立体异构体，所述P3为ZEDOARONDIOL，上述有效成分的提取是将莪术块状粉末通过水浴、超滤分离、纳滤浓缩、色谱纯度分析和核磁共振结构对比得到。上述药物的使用方法是将化合物P1、P2、P3为有效成分的药物涂覆在一承载器械上，该药物不仅能够防治再狭窄，且与现有的雷帕霉素支架等相比，能够抑制血管平滑肌细胞增殖、血管壁的炎性反应，此外还能促进血管内皮细胞的愈合，避免了远期血栓并发症，且用量少、成本低、无毒副作用。51INTCL权利要求书2页说明书9页附图2页19中华人民共和国国家知。
3、识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书9页附图2页10申请公布号CN104188957ACN104188957A1/2页21一种防治再狭窄的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括愈创木烷型倍半萜化合物P1、P2和P3；所述P1为ZEDOALACTONEB，其结构式为所述P2为所述P1的立体异构体，其结构式为所述P3为ZEDOARONDIOL，其结构式为2根据权利要求1所述的防治再狭窄的药物，其特征在于，所述愈创木烷型倍半萜化合物P1、P2、P3的质量比为P1P2P31664251025100。3根据权利要求2所述的防治再狭窄的药物，其特征在于，所述愈创木烷型倍半萜化合物P1、P2、P3。
4、的质量比为P1P2P332550。4一种权利要求1所述防治再狭窄的药物的制备方法，其特征在于，包括如下提取其有效成分的步骤1先将莪术块粉末经水浴提取，将提取样液管道离心，得离心提取液；2然后将离心提取液进行超滤分离，得到超滤透过液和超滤截留液；3再将超滤透过液进行纳滤浓缩，得到纳滤液；4最后对纳滤液进行色谱纯度分析和核磁共振结构对比，得到化合物P1、P2、P3。5一种权利要求1所述防治再狭窄的药物的使用方法，其特征在于，将以化合物P1、权利要求书CN104188957A2/2页3P2、P3为有效成分的药物涂覆在一承载器械上。6根据权利要求5所述的一种防治再狭窄的药物的使用方法，其特征在于，所述。
5、承载器械为体内管腔内支架。7根据权利要求6所述的一种防治再狭窄的药物的使用方法，其特征在于，所述体内管腔内支架的载药量为0709G/MM2。8根据权利要求6或7所述的一种防治再狭窄的药物的使用方法，其特征在于，将所述体内管腔内支架预装在快速交换型球囊导管上。9根据权利要求6或7所述的一种防治再狭窄的药物的使用方法，还包括对所述体内管腔内支架进行钴60辐照灭菌的过程。权利要求书CN104188957A1/9页4一种防治再狭窄的药物及其制备和使用方法技术领域0001本发明涉及中药提取物领域，具体涉及一种以愈创木烷型倍半萜化合物为有效成分的防治再狭窄的药物、用莪术制备该药物的方法以及该药物的使用方法。
6、。背景技术0002目前，经皮冠状动脉介入术PERCUTANEOUSCORONARYINTERVENTION,PCI是治疗冠心病的主要方法,但此类方法的主要缺陷在于施放支架部位的术后再狭窄。而血管内血栓形成、弹性回缩、动脉重构、新生内膜增生、平滑肌过度增生、血管重塑以及炎症等是导致再狭窄发生的主要因素。0003为了解决再狭窄的问题，近年来国内外普遍采用在传统的支架上涂覆药物层来抑制再狭窄现象的发生，例如雷帕霉素、紫杉醇等药物图层支架，在预防冠状动脉球囊扩张后再狭窄方面获得显著进展，但由于此类药物会抑制球囊扩张后血管损伤内膜的愈合，远期血栓并发症明显增加，几项临床试验和荟萃分析结果显示此类药物洗脱。
7、支架可能会增加死亡或心肌梗死发生率支架内血栓形成，远期预后并不优于以往的金属裸支架，急性心肌梗死介入治疗后心脏病事件发生率每年20左右，且采用西药涂层支架后再狭窄的发生率仍在10左右。此外，药物涂层支架价格昂贵，一枚进口支架达20万左右，不能适合我国国情推广发展，极大增加了医疗成本与患者的经济负担。0004针对再狭窄的病理生理机制，理论上所具有的抗血栓、抗炎及抗细胞移行、增殖作用的药物都应具有预防再狭窄的作用，但经PCI术后全身应用这些药物的研究结果令人失望，不仅降低再狭窄的效果有限，关键是其中有些药物的毒性作用和副反应严重。发明内容0005为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种防。
8、治再狭窄的药物，并相应提供了该药物的制备及使用方法，该药物不仅能够防治再狭窄，且与现有的雷帕霉素支架等相比，能够抑制血管平滑肌细胞增殖、血管壁的炎性反应，此外还能促进血管内皮细胞的愈合，避免了远期血栓并发症，且用量少、成本低、无毒副作用。0006本发明提供的一种防治再狭窄的药物，有效成分包括愈创木烷型倍半萜化合物P1、P2和P3；0007所述P1为ZEDOALACTONEB，其结构式为0008说明书CN104188957A2/9页50009所述P2为所述P1的立体异构体，其结构式为00100011所述P3为ZEDOARONDIOL，其结构式为00120013所述愈创木烷型倍半萜化合物P1、P2。
9、、P3的质量比为P1P2P316642510251000014所述愈创木烷型倍半萜化合物P1、P2、P3的质量比为P1P2P332550。0015一种用制备上述防治再狭窄的药物的制备方法，包括如下提取其有效成分的步骤00161先将莪术块粉末经水浴提取，将提取样液管道离心，得离心提取液；00172然后将离心提取液进行超滤分离，得到超滤透过液和超滤截留液；00183再将超滤透过液进行纳滤浓缩，得到纳滤液；00194最后对纳滤液进行色谱纯度分析和核磁共振结构对比，得到化合物P1、P2、P3。0020所述莪术为姜科植物蓬莪术CURCUMAPHAEOCAULISVAL1、广西莪术CURCUMAKWANG。
10、SIENSISSGLEEETCFLIANG和温郁金CURCUMAWENYUJINYHCHENETCLING的干燥根茎。多年生草本植物，主要产于广西、云南、四川等地。说明书CN104188957A3/9页60021一种上述防治再狭窄的药物的使用方法，是将化合物P1、P2、P3涂覆在一承载器械上。0022优选地，所述承载器械为体内管腔内支架。0023优选地，所述体内管腔内支架的载药量为0709G/MM20024优选地，将所述体内管腔内支架预装在快速交换型球囊导管上。0025优选地，上述使用方法还包括对所述体内管腔内支架进行钴60辐照灭菌的过程。0026本发明具有如下有益效果00271能够抑制血管平。
11、滑肌细胞增殖以及血管壁的炎性反应，特别是与现有药物相比还能促进血管内皮细胞的愈合，避免了远期血栓并发症，降低了再狭窄的发生率；00282通过天然中药莪术进行提取出药物的有效成分，有效成分的化学结构清楚、制备工艺成熟、提取率高、方便规模化生产，节约生产成本；00293将本发明提供的药物应用于体内管腔内支架时，在载药量较小的条件下即可达到有效防治再狭窄发生的效果，不仅降低了成本还能避免因用量过多带来的不利影响；00304与现有的雷帕霉素等防治再狭窄药物比无其它毒副作用。附图说明0031图1A为本发明药物支架ZES植入30天时脉管片段的横切面视图；0032图1B为雷帕霉素支架SES植入30天时脉管片。
12、段的横切面视图；0033图1C为金属裸支架BMS植入30天时脉管片段的横切面视图；0034图2A为本发明药物支架ZES植入90天时脉管片段的横切面视图；0035图2B为雷帕霉素支架SES植入90天时脉管片段的横切面视图；0036图2C为金属裸支架BMS植入90天时脉管片段的横切面视图；0037图3A为本发明药物支架ZES植入90天时扫描电镜分析图；0038图3B为雷帕霉素支架SES植入90天时扫描电镜分析图；0039图3C为金属裸支架BMS植入90天时扫描电镜分析图；0040图4为本发明药物支架ZES的横截面结构示意图；0041图5为本发明药物支架ZES的整体结构示意图；0042图中1、支架基。
13、体2、药物涂层。具体实施方式0043为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。0044实施例10045从莪术中提取本发明防治再狭窄的药物的有效成分，具体提取方法为00461样品预处理过程0047提取称取110KG莪术块状粉末，分两批提取。加入10L、95水浴旋转2小时，提取3次。将提取的样液合并进行离心，得到约435L离心提取液，分别取50ML留样分析。0048超滤分离将435L离心提取液加入膜分离仪器的料液槽中，进行超滤分离中空纤维膜UF，型号PS06，膜面积40M2，编号090114，得到超滤透过液43L左右原因为说明书CN10418。
14、8957A4/9页7超滤前未排尽水，超滤截留液35L，分别取50ML留样、分析。0049纳滤浓缩将43L超滤液透过液加入到纳滤仪器中，频率调整到20HZ，调整出液口压力为05MPA，得到纳滤截留液39L，纳滤透过液401L，分别取50ML留样、分析。00502莪术愈创木烷型倍半萜中药的制备X1制备第一维制备0051用3倍柱体积的95乙醇对色谱柱进行活化，再用2倍柱体积的水进行平衡处理，然后取19L纳滤液上样，再经水洗、3倍柱体积的1050乙醇反复淋洗5次、洗脱、洗柱、馏分合并得到F6、F7、F8、F9、F11、F12、F16子馏分，主峰目标为P1、P2、P3。00523莪术愈创木烷型倍半萜中药。
15、的C18HC柱制备第二维制备0053峰P1制备0054样品配制取莪术F6样品190MG溶于10ML水中，浓度约为20MG/ML；F79样品400MG溶于20ML水中，浓度约为20MG/ML。制备条件色谱柱C18HC20250MM，10M，编号12041901A；流速20ML/MIN，检测器275NM，240NM；进样量5ML。峰P1制备洗脱条件见表1。0055表1峰P1制备洗脱条件00560057峰P2制备F11样品0058样品配制取莪术F11、F12样品350MG溶于10ML水中，浓度约为35MG/ML，然后经水膜滤过。色谱柱C18HC20250MM，10M，编号12041901A；流速20。
16、ML/MIN；检测器275NM，240NM；进样量1ML。具体条件见表2。0059表2峰P2制备洗脱条件00600061峰P3制备F16样品0062样品配制取莪术F16样品350MG溶于20ML水中，浓度约为17MG/ML，然后经水膜滤过。色谱柱C18HC20250MM，10M，编号12041901A；流速20ML/MIN；检测器275NM，240NM；进样量1ML。具体条件见表3。0063表3峰P3制备洗脱条件0064说明书CN104188957A5/9页800654P1、P2和P3的纯度分析与结构表征0066色谱纯度分析0067仪器ALLIANCE6；色谱柱C18TDE46150MM，5M。
17、，编号1105175，流速1ML/MIN；检测器275NM、240NM；进样量50L；洗脱条件梯度洗脱。洗脱条件见表4。0068表4色谱纯度分析的制备洗脱条件0069时间MIN乙腈质量百分比01甲酸水质量百分比059520407525309550070P1、P2和P3的结构表征洗脱后得到P120MG,P227MG,P3255MG。相对峰面积纯度分析结果表明，P1的纯度为9906，P2的纯度为9626，P3的纯度为9844。0071与文献核磁数据对比可知，这三个化合物为愈创木烷型倍半萜，其中P1为ZEDOALACTONEB，P2为P1的立体异构体，P3为ZEDOARONDIOL，其结构式如下00。
18、72说明书CN104188957A6/9页90073试验实施例10074动物实验00751、动物与分组采用普通级中国小型猪36头，由中国农业大学提供，雌雄各半，体重2530KG，随机分为莪术提取物涂层支架组ZES、雷帕霉素涂层支架组SES和金属裸支架三组BMS，每组12头。00762、莪术提取物涂层支架制备以316L不锈钢金属纳米微孔裸支架为基体，表面涂覆实施例1中提供的药物，药物中P1、P2、P3的用量依次为32MG、5MG、50MG，将混合的药物加入相应的超纯水溶剂，配制成25浓度的溶液，喷涂在支架上，名义载药量为083G/MM2。将支架预装在快速交换型球囊导管上。所有支架长度为15MM，。
19、直径2530MM，采用钴60辐照灭菌。316L不锈钢金属纳米微孔裸支架和雷帕霉素NANO支架名义载药量220G/MM2，支架基体也为316L不锈钢金属纳米微孔支架均由乐普北京医疗器械有限公司制备和提供。支架的结构示意图请参考图4，支架由支架基体1和上述药物涂层2莪术提取物涂层组成。支架的整体结构可参考图5，当然也可以根据实际使用需要对该结构形状做出适应性调整。00773、实验过程术前3天开始予阿司匹林300MG每天，氯吡格雷50MG每天。建立静说明书CN104188957A7/9页10脉通路，称重后，采用肌注戊巴比妥05MG/KG及氯胺酮10MG/KG静脉注射复合麻醉。冠脉造影以SELDING。
20、ER法穿刺猪股动脉并置入6F动脉鞘，经鞘管给予肝素200U/KG，行选择性冠状动脉造影。置入支架直径与靶血管直径比为121，分别在前降支、回旋支及右冠脉植入同一种支架各一枚。如左回旋支直径较小，则将两枚支架植入右冠脉内，术中连续心电监护。术后单笼普通谷物饲料喂养观察，阿司匹林100MG每日一次，氯吡格雷50MG每日一次，直至实验结束。00784、标本制备麻醉处死实验动物后立即开胸取出心脏后，放入含25000单位肝素、60MG罂粟碱的1000ML生理盐水中，从升主动脉伸入7F扩张管分别至左右冠脉开口，用该液冲洗冠脉34次。将游离的心脏经升主动脉伸入7F扩张管至左心室，用止血钳封扎心脏各出口，压力。
21、监测下用加压装置以100MMHG的压力连续灌注15分钟。分离前降支、回旋支、右冠状动脉支架置入处血管段，取材标本包括支架以及支架两侧5MM内区域。近段标本经25戊二醛固定24小时后，用1/15M磷酸缓冲液冲洗3次，用1锇酸后固定2小时，分别用30、50、70、90酒精和90酒精丙酮、90丙酮各脱水10分钟，脱水后行电镜观察；远段标本经10中性缓冲福尔马林加压灌注固定24小时后，行塑料包埋后，制成5UM厚的连续切片，常规HE染色后行光镜观察。00795、病理分析0080切片用HE染色后，用LEIKADFC300FX光学显微镜观察支架段血管炎症、血栓、内膜增殖。0081血管壁炎症反应采用炎症积分0。
22、0820分无炎症细胞；00831分散在炎症细胞；00842分2550血管周径内的支架点被炎症细胞包绕50；00853分2550血管周径内的支架点被炎症细胞完全包绕。0086血管壁损伤程度应用损伤积分00870分内弹力膜完整；00881分内弹力膜损伤；00892分内弹力膜和中膜损伤；00903分外弹力膜损伤。0091内皮化积分00921分25管腔表面有内皮覆盖；00932分2575管腔表面有内皮覆盖；00943分75管腔表面有内皮覆盖。00955采用LIGHTLAB光学相干断层成像OPTICALCOHERENCETOMOGRAPHY,OCT系统进行血管内扫描成像，测量血管腔和血管外膜直径，计算直。
23、径狭窄率和面积狭窄率，定性评价支架内皮修复和支架内血栓。00966、统计学分析所有计量数据采用均数士标准差表示，计量资料组间比较使用ANOVA检验。计数资料采用中位数/百分位数表示，计数资料采用卡方检验。经检验符合正态分布，用SPSS130统计软件进行数据处理，P005为差异有统计学意义。0097实验结果说明书CN104188957A108/9页1100981、OCT形态学分析30和90天时ZES和SES支架组平均管腔直径、平均管腔面积，均明显大于BMS支架组P005。直径狭窄率、面积狭窄率均明显低于BMS组P005。ZES支架组与SES相比，各项形态学参数未见明显差异P005，具体数据见表5。
24、。0099表5莪术提取物支架置入30和90天组织形态学分析结果010001010102术语解释ZES，SES，BMS分别为莪术支架、雷帕霉素支架和金属裸支架，VD为参考血管直径、LD为平均血管直径、EELD为平均外膜直径、DIAMETERSTENOSIS为直径狭窄率、LA为平均管腔面积、EELA为平均外膜面积、AREASTENNOSIS为面积狭窄率,和BMS相比P00101032、组织病理学变化分析0104请参考图1A1C、2A2C、3A3C，植入30和90天时BMS支架血管内膜增生明显，发生了明显的再狭窄现象，但未见内膜下出血及附壁血栓形成，无动脉瘤形成及血管正性重构。SES支架虽未见再狭窄。
25、，但可见部分支架横梁裸露在血管腔，无内皮覆盖，并有白细胞、嗜酸粒细胞和少量淋巴细胞聚集。ZES不仅没有发生再狭窄现象，而且支架内皮覆盖完整，未见血栓形成及白细胞和嗜酸细胞聚集。0105上述对比结果也可以通过表6中的炎症积分、损伤积分和内皮化积分数据得到与SES组比较，ZES组和BMS组炎症积分明显降低；内皮化积分明显升高P005。3组损伤积分差异无统计学意义P005。0106表6支架置入30和90天组织病理学分析结果0107分组DAYS炎症积分损伤积分内皮化积分ZES30DAY09304123606330000090DAY088039217045300000说明书CN104188957A119。
26、/9页12SES30DAY12308223305226904290DAY136077226044283039BMS30DAY10104121907530000090DAY0880432000533000000108注和ZES与BMS相比，P0050109实验结论0110本研究表明，以莪术提取物为有效成分制成的中药支架ZES，在30天和90天观察时明显抑制平滑肌细胞增生，再狭窄率低；内皮愈合完整，未见明显的支架内血栓事件。而无论雷帕霉素还是紫杉醇药物洗脱支架，临床试验皆观察到植入后支架节段内皮化延迟，甚至出现晚期支架内血栓的发生，有可能导致死亡、心肌梗死等严重后果。此外，本发明中的药物有效成分通。
27、过天然莪术提取，成本较低，且载药量为083G/MM2左右，尚未发现明显的毒副作用。0111本发明提供的上述药物涂层支架在实际使用时，还可将上述涂有本发明药物涂层的支架预装在快速交换型球囊导管上，并进行钴60辐照灭菌处理后使用。0112以上对本发明所提供的一种防治再狭窄的药物及其制备和使用方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。说明书CN104188957A121/2页13说明书附图CN104188957A132/2页14图4图5说明书附图CN104188957A14。