一种从葡萄籽中提取原花青素的方法.pdf

本申请旨在提供一种提取高纯度寡聚原花青素的方法，包括以下步骤：将脱脂后的葡萄籽粉碎，加入乙酸乙酯超声萃取后得粗提物 ，加入纤维素酶进行酶解，再经过两次乙酸乙酯萃取，分别得粗提物、粗提物；合并以上粗提物进行纯化，得纯度95%以上的寡聚原花青素；本发明所述方法采用多轮萃取、萃取物低温避光保存的办法，避免了寡聚原花青素长时间暴露，从而减少了寡聚原花青素的氧化和过多的原花青素被降解为无活性的单体；本发明所述方法的后续纯化处理步骤较为简单，省去了本领域常用的大孔吸附树脂纯化、HPLC精制等步骤，节约了大量溶剂，更加环保。

权利要求书
1.  一种从葡萄籽中提取原花青素的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）葡萄籽的预处理：葡萄籽脱脂，脱脂后剩余物粉碎至20-80目颗粒待用；
（2）第一轮萃取：向葡萄籽颗粒中加入其重量10-15倍的乙酸乙酯，在超声条件下萃取30-40min；
（3）酶解：过滤分离葡萄籽颗粒与乙酸乙酯，其中滤液减压浓缩，回收乙酸乙酯，得粗提物                                                ，粗提物低温避光保存；葡萄籽颗粒中加入其重量10-15倍的纯净水，并加入纤维素酶，进行酶解，酶解时间为30-40min，每隔10min进行超声处理2-5min；
（4）第二轮萃取：在含有葡萄籽颗粒的水溶液中加入葡萄籽颗粒重量10-15倍的乙酸乙酯在超声条件下进行第二次萃取，萃取时间30-40min，萃取完成后分离乙酸乙酯层，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得粗提物，粗提物低温避光保存；
（5）第三轮萃取：调节第二次萃取剩余含葡萄籽颗粒的水溶液的pH为2-4，搅拌20-80min，每隔20min使用葡萄籽颗粒重量10-15倍的乙酸乙酯萃取一次，分离萃取液，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得粗提物，将粗提物低温避光保存，将该步骤中所得的全部粗提物合并得到粗提物；
（6）纯化：合并粗提物、、，并加入其总重量30-40倍的乙酸乙酯，搅拌，滤除不溶物后，减压浓缩回收乙酸乙酯，得纯度95%以上的寡聚原花青素。

2.  如权利要求1所述的一种从葡萄籽中提取原花青素的方法，其特征在于：本发明所述方法中，使用超声处理的频率为40-100kHz，功率为250-300W。

3.  如权利要求1或2所述的一种从葡萄籽中提取原花青素的方法，其特征在于：本发明所述步骤(3)中，所述纤维素酶活力为10000-50000U/g，纤维素酶加入量以葡萄籽颗粒为底物计40-50U/g。

4.  如权利要求3所述的一种从葡萄籽中提取原花青素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，酶解温度为40-50℃。

5.  如权利要求4所述的一种从葡萄籽中提取原花青素的方法，其特征在于：本发明所述的酶解和萃取步骤均可在密闭容器中进行，且所述容器中充入氮气。

6.  如权利要求4或5所述的一种从葡萄籽中提取原花青素的方法，其特征在于：本发明所述方法优选在暗室中进行。

说明书一种从葡萄籽中提取原花青素的方法
技术领域
本申请涉及一种从葡萄籽中提取原花青素的方法。
背景技术
原花青素是黄烷-3-醇单体通过C4- C8或C4- C6位连接成一定聚合度的原花青素分子，其基本单元主要是儿茶素、表儿茶素以及表儿茶素没食子酸酯等。按聚合度的大小，通常将二至五聚体成为低聚体（简称OPC），将五聚体以上称为高聚体（简称PPC）。这一多酚类化合物广泛存在于葡萄、蓝莓、樱桃、松树皮等植物中。原花青素是一种天然的自由基清除剂和抗氧化剂，具有抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病、预防动脉粥样硬化、改善肌肤弹性等功能，现已广泛应用于食品、药品和化妆品等领域。
目前，由葡萄籽中提取原花青素的方法主要有水提取法、传统有机溶剂提取法、超临界CO2萃取法等。这些提取方法主要存在以下不足：（1）水提取法以水为提取剂，浸泡时间长、温度高，易造成原花青素的损失，同时水的极性较大，溶出杂质也多；（2）传统有机溶剂提取耗时长、成本高，对原花青素的组成影响较大；（3）超临界CO2萃取法成本高，对操作条件要求苛刻。
本领域中常见的原花青素粗产品纯化方法有大孔吸附树脂、HPLC、膜过滤、重结晶等方法，但上述纯化方法均要耗费大量的溶剂。
发明内容
本申请旨在提供一种提取高纯度寡聚原花青素的方法。
本发明所述方法包括以下步骤：
（1）葡萄籽的预处理：葡萄籽脱脂，脱脂后剩余物粉碎至20-80目颗粒待用；
（2）第一轮萃取：向葡萄籽颗粒中加入其重量10-15倍的乙酸乙酯，在超声条件下萃取30-40min；
（3）酶解：过滤分离葡萄籽颗粒与乙酸乙酯，其中滤液减压浓缩，回收乙酸乙酯，得粗提物                                                ，粗提物低温避光保存；葡萄籽颗粒中加入其重量10-15倍的纯净水，并加入纤维素酶，进行酶解，酶解时间为30-40min，每隔10min进行超声处理2-5min；
（4）第二轮萃取：在含有葡萄籽颗粒的水溶液中加入葡萄籽颗粒重量10-15倍的乙酸乙酯在超声条件下进行第二次萃取，萃取时间30-40min，萃取完成后分离乙酸乙酯层，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得粗提物，粗提物低温避光保存；
（5）第三轮萃取：调节第二次萃取剩余含葡萄籽颗粒的水溶液的pH为2-4，搅拌20-80min，每隔20min使用葡萄籽颗粒重量10-15倍的乙酸乙酯萃取一次，分离萃取液，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得粗提物，将粗提物低温避光保存，将该步骤中所得的全部粗提物合并得到粗提物；
（6）纯化：合并粗提物、、，并加入其总重量30-40倍的乙酸乙酯，搅拌，滤除不溶物后，减压浓缩回收乙酸乙酯，得纯度95%以上的寡聚原花青素。
进一步地，本发明所述方法中，使用超声处理的条件为频率40-100kHz，功率250-300W。
进一步地，本发明所述步骤(3)中，所述纤维素酶活力为10000-50000U/g，纤维素酶加入量以葡萄籽颗粒为底物计40-50U/g。
进一步地，本发明所述步骤(3)中，酶解温度为40-50℃。
更进一步地，本发明所述的提取高纯度寡聚原花青素的方法，其中萃取、酶解步骤均可在密闭容器中进行，且所述容器中充入氮气。
更进一步地，本发明所述的提取高纯度寡聚原花青素的方法，优选在暗室中进行操作。
依本发明所述方法提取得到的寡聚原花青素，纯度和收率均较高，其抗氧化活性也高，这是因为首先乙酸乙酯选择性提取高活性的寡聚原花青素，相对于无法选择性提取的水、乙醇、甲醇、丙酮等其他提取溶剂所获得的提取物中寡聚原花青素含量明显提高。其次，本发明所述方法采用多轮萃取、萃取物低温避光保存的办法，避免了寡聚原花青素长时间暴露，从而减少了寡聚原花青素的氧化和过多的原花青素被降解为无活性的单体。在第一轮萃取中，葡萄籽颗粒中易被提取的寡聚原花青素首先被提取出来；在第二轮萃取中，通过酶解而释放出的寡聚原花青素被提取出来；在第三轮萃取中，高聚原花青素降解生成的寡聚原花青素被提取出来。本发明所述方法的后续纯化处理步骤较为简单，省去了本领域常用的大孔吸附树脂纯化、HPLC精制等步骤，节约了大量溶剂，更加环保。
附图说明
图1为实施例1中原花青素产品的浓度对羟自由基清除率的影响。
图2为实施例2中原花青素产品的浓度对羟自由基清除率的影响。
图3为实施例3中原花青素产品的浓度对羟自由基清除率的影响。
具体实施方式
实施例1
将脱脂处理的葡萄籽粉碎至60目，称取100g并加入1200g乙酸乙酯，以80kHz的频率和250W的功率超声处理30min。过滤出葡萄籽颗粒，将滤液减压浓缩并回收乙酸乙酯，得粗提物，将粗提物低温避光保存；向葡萄籽颗粒中加入1000g纯净水，加入纤维素酶8g，45℃下酶解40min，并每隔10min进行超声处理5min，超声频率80kHz，功率250W；向上述酶解后的溶液中加入1000g乙酸乙酯，以前述同样的超声条件萃取30min。之后分离出乙酸乙酯层，减压浓缩，回收乙酸乙酯，将得到的粗提物低温避光保存；调节剩余含有葡萄籽颗粒的水溶液的pH为2-4，加入1000g乙酸乙酯，持续搅拌进行20min后分离出乙酸乙酯层，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到粗提物，重复上述步骤2次，将得到的全部粗提物合并，得到粗提物；合并粗提物、、，并加入其总重量30倍的乙酸乙酯，搅拌，滤除不溶物后，减压浓缩回收乙酸乙酯，得纯度95.3%的寡聚原花青素7.64g，平均聚合度3.52。
实施例2
将脱脂处理的葡萄籽粉碎至80目，称取200g并加入2000g乙酸乙酯，以80kHz的频率和250W的功率超声处理40min。过滤出葡萄籽颗粒，将滤液减压浓缩并回收乙酸乙酯，得粗提物，将粗提物低温避光保存；向葡萄籽颗粒中加入2000g纯净水，加入纤维素酶12g，40℃下酶解40min，并每隔10min进行超声处理5min，超声频率80kHz，功率250W；向上述酶解后的溶液中加入2000g乙酸乙酯，以前述同样的超声条件萃取40min。之后分离出乙酸乙酯层，减压浓缩，回收乙酸乙酯，将得到的粗提物低温避光保存；调节剩余含有葡萄籽颗粒的水溶液的pH为2-4，加入2000g乙酸乙酯，持续搅拌进行20min后分离出乙酸乙酯层，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到粗提物，重复上述步骤2次，将得到的全部粗提物合并，得到粗提物；合并粗提物、、，并加入其总重量30倍的乙酸乙酯，搅拌，滤除不溶物后，减压浓缩回收乙酸乙酯，得纯度96.5%的寡聚原花青素15.65g，平均聚合度2.57。
实施例3
将脱脂处理的葡萄籽粉碎至50目，称取100g加入密闭容器中并加入1200g乙酸乙酯，充入氮气，以80kHz的频率和250W的功率超声处理40min。过滤出葡萄籽颗粒，将滤液减压浓缩并回收乙酸乙酯，得粗提物，将粗提物低温避光保存；将过滤得到的葡萄籽颗粒中加入1000g纯净水，加入纤维素酶10g，置于密闭容器中且充入氮气，45℃下酶解40min，并每隔10min进行超声处理5min，超声频率80kHz，功率250W；向上述酶解后的溶液中加入1000g乙酸乙酯，以同样的超声条件萃取40min。之后分离出乙酸乙酯层，减压浓缩，回收乙酸乙酯，将得到的粗提物低温避光保存；调节剩余含有葡萄籽颗粒的水溶液的pH为2-4，置于密闭容器中且充入氮气，加入1000g乙酸乙酯，持续搅拌进行20min后分离出乙酸乙酯层，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到粗提物，重复上述步骤2次，将得到的全部粗提物合并，得到粗提物；合并粗提物、、，并加入其总重量30倍的乙酸乙酯，搅拌，滤除不溶物后，减压浓缩回收乙酸乙酯，得纯度95.7%的寡聚原花青素7.93g，平均聚合度3.24。
实施例4
取实施例1-3中得到的寡聚原花青素产物，分别配置为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的乙醇溶液，参考文献“原花青素抗氧化活性测定方法比较”，现代化工，赵平，任鹏等，2012年5月，第32卷第5期中的水杨酸法，对本申请实施例1-3中得到的寡聚原花青素产物的抗氧化活性进行测定；由附图1-3可见，随着原花青素浓度的升高，其清除羟自由基的能力也随之提高。经计算，附图1-3中原花青素对羟自由基的半抑制浓度分别约为13.63μg/mL、14.08μg/mL和13.15μg/mL。半抑制浓度越小，其清除羟自由基的能力越强，可见，由本申请所述方法得到的葡萄籽原花青素具有突出的抗氧化活性。