说明书达比加群的酯衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地说是涉及达比加群的酯衍生物及其制备 方法和含有这些衍生物的药物组合物以及所述化合物及药物组合物作为制备凝 血酶抑制剂的用途。
背景技术
达比加群酯(Dabigatran)是德国勃林格殷格翰公司开发的具有多种特点的新 型抗凝血药物。2008年4月，首先在德国和英国上市，商品名为Pradaxa，用于 防治急性静脉血栓(VTE)。这是继华法林之后50年来首个上市的抗凝血口服 新药，是抗凝血治疗领域和潜在致死性血栓预防领域的又一个里程碑。美国食 品和药品监督管理局2010年10月19日批准Pradaxa胶囊(达比加群酯)为在有心 律异常(心房颤动)患者中预防中风和凝血。
凝血酶是细胞外胰岛素样丝氨酸蛋白酶，在凝血过程中具有重要作用，一 方面，其能使纤维蛋白原裂解成为纤维蛋白，后者参与构成不溶性血栓基质； 另一方面，其能诱导血小板活化和聚集，进而引发一系列次级凝血级联反应。 达比加群酯为前药，在体内转化为有活性的达比加群，达比加群通过直接抑制 凝血酶而发挥抗凝血效应。达比加群酯是一种新型的合成的直接凝血酶抑制剂， 是用于口服的前体药物，属非肽类的凝血酶抑制剂。口服经胃肠吸收后，在体 内转化为具有直接抗凝血活性的达比加群。药物结合于凝血酶的纤维蛋白特异 结合位点，阻止纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，从而阻断了凝血瀑布网络的最后 步骤及血栓形成。
但是达比加群酯的口服生物利用度较低(<6.5％)，有待进一步提高。因此 需要寻找更适合药用的达比加群酯的化合物，以满足市场和相关疾病防治工作 的需求。
发明内容
发明目的：
本发明涉及由结构通式(I)所示的达比加群的酯衍生物及其非毒性药学上 可接受的盐，以及含有这些化合物作为活性成分的药物组合物，以及所述化合 物及药物组合物作为凝血酶抑制剂的用途。
技术方案：
本发明是通过以下技术方案来实现的。
具有通式(I)结构的达比加群的酯衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1代表H或C1-C5的烷基；R2代表天然氨基酸酯；X代表O、S或者N；Y 代表C或者N。
优选地，其中R1代表H或C1-C2的烷基，R2代表缬氨酸甲酯、亮氨酸甲 酯、异亮氨酸甲酯、色氨酸甲酯、组氨酸甲酯、甲硫氨酸甲酯、脯氨酸甲酯、 丙氨酸甲酯、苯丙氨酸甲酯、酪氨酸甲酯、甘氨酸甲酯、丝氨酸甲酯或苏氨 酸甲酯，X代表O或者N；Y代表C或者N。
更优选地，通式(I)结构的达比加群的酯衍生物选自：
其中，X、Y、R1和R2分别定义如下：
I1：X为N，Y为N，R1为H，R2为缬氨酸甲酯；
I2：X为O，Y为N，R1为H，R2为缬氨酸甲酯；
I3：X为N，Y为N，R1为-CH3，R2为缬氨酸甲酯；
I4：X为O，Y为N，R1为H，R2为甘氨酸甲酯；
I5：X为N，Y为N，R1为H，R2为甘氨酸甲酯；
I6：X为O，Y为N，R1为-CH3，R2为甘氨酸甲酯；
I7：X为N，Y为N，R1为-CH3，R2为甘氨酸甲酯；
I8：X为N，Y为N，R1为H，R2为脯氨酸甲酯；
I9：X为O，Y为N，R1为-CH3，R2为酪氨酸甲酯；
I10：X为N，Y为N，R1为-CH2CH3，R2为苯丙氨酸甲酯；
I11：X为N，Y为C，R1为-CH3，R2为甲硫氨酸甲酯；
I12：X为O，Y为C，R1为-CH2CH3，R2为亮氨酸甲酯；
I13：X为N，Y为N，R1为-CH3，R2为异亮氨酸甲酯；
I14：X为N，Y为N，R1为H，R2为组氨酸甲酯；
I15：X为O，Y为N，R1为-CH3，R2为色氨酸甲酯。
一种药物组合物，该药物组合物的活性成分包括至少一种上述的达比加群的 酯衍生物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形 剂。
所述的达比加群的酯衍生物或其药学上可接受的盐在用于制备凝血酶抑制 剂药物的应用。
优点及效果：
本发明的达比加群酯衍生物还具有但不限于以下有益效果：
(1)相对于达比加群酯，本发明所提供的部分达比加群酯衍生物具有良好 的药理活性。例如，达比加群酯衍生物I1和I13的活化部分凝血活酶时间(aPTT) (sec)值分别如下：83.1±4.2sec和88.2±2.3sec；达比加群酯的活化部分凝血活酶 时间(aPTT)(sec)值为75.3±2.1sec；而达比加群酯衍生物I5和I14的活化部分 凝血活酶时间(aPTT)(sec)值分别如下：180.1±2.9sec和147.1±3.5sec，虽然有 较长的活化部分凝血活酶时间，但对于抗凝血药物，存在出血的风险；由此可 见，所设计的达比加群酯衍生物I1和I13具有更好的抗凝血活性。
(2)本发明的达比加群酯衍生物I1和I13具有较好的生物利用度F(％)， 经试验证实，达比加群酯衍生物I1和I13的生物利用度F(％)分别为15.2％和 18.5％，而达比加群酯的生物利用度F(％)为5.8％，几乎高出3-4倍。因而本 发明的达比加群酯衍生物I1和I13具有较达比加群酯更佳的生物利用度。
附图说明：
图1是达比加群的酯衍生物或其药学上可接受的盐的通式；
图2是合成式通式(I)所示的化合物衍生物的路线图。
具体实施方式：
由于分子中脒基的存在使药物的吸收及生物利用度明显降低，为了克服达 比加群酯脒基存在所造成的生物利用度不高的缺点，本发明采用苯甲脒基环合 形成苯并异恶唑，增大化合物透膜吸收从而改善其药代，并增加其抗凝血活性。 同时，创新性的将侧链的羧酸酯修饰成天然的氨基酸酯来增加整个分子的溶解 性，提高其口服吸收。
本发明涉及由结构通式(I)所示的达比加群的酯衍生物及其非毒性药学上 可接受的盐，以及含有这些化合物作为活性成分的药物组合物，以及所述化合 物及药物组合物作为制备凝血酶抑制剂的用途。
具有通式(I)结构的达比加群的酯衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1代表H或C1-C5的烷基；R2代表天然氨基酸酯；X代表O、S或者N；Y 代表C或者N。
优选地，R1为H或C1-C2的烷基，R2为缬氨酸甲酯、亮氨酸甲酯、异亮氨 酸甲酯、色氨酸甲酯、组氨酸甲酯、甲硫氨酸甲酯、脯氨酸甲酯、丙氨酸甲酯、 苯丙氨酸甲酯、酪氨酸甲酯、甘氨酸甲酯、丝氨酸甲酯或苏氨酸甲酯，X为O 或者N；Y为C或者N。
更优选地，通式(I)所代表的达比加群的酯衍生物或其可药用盐选自如下 结构式所代表的化合物：
具体目标化合物的各取代基分别定义如下：
I1：X为N，Y为N，R1为H，R2为缬氨酸甲酯；
I2：X为O，Y为N，R1为H，R2为缬氨酸甲酯；
I3：X为N，Y为N，R1为-CH3，R2为缬氨酸甲酯；
I4：X为O，Y为N，R1为H，R2为甘氨酸甲酯；
I5：X为N，Y为N，R1为H，R2为甘氨酸甲酯；
I6：X为O，Y为N，R1为-CH3，R2为甘氨酸甲酯；
I7：X为N，Y为N，R1为-CH3，R2为甘氨酸甲酯；
I8：X为N，Y为N，R1为H，R2为脯氨酸甲酯；
I9：X为O，Y为N，R1为-CH3，R2为酪氨酸甲酯；
I10：X为N，Y为N，R1为-CH2CH3，R2为苯丙氨酸甲酯；
I11：X为N，Y为C，R1为-CH3，R2为甲硫氨酸甲酯；
I12：X为O，Y为C，R1为-CH2CH3，R2为亮氨酸甲酯；
I13：X为N，Y为N，R1为-CH3，R2为异亮氨酸甲酯；
I14：X为N，Y为N，R1为H，R2为组氨酸甲酯；
I15：X为O，Y为N，R1为-CH3，R2为色氨酸甲酯。
本发明还涉及药物组合物，该药物组合物包括至少一种通式(I)所代表的 达比加群的酯衍生物或其可药用盐，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋 形剂。
通式(I)所示的达比加群的酯衍生物及其非毒性药学上可接受的盐，以及 包含通式(I)所示的达比加群的酯衍生物及其非毒性药学上可接受的盐作为活 性成分的药物组合物作为制备抗凝血药物的用途。
通式(I)所代表的化合物可以与无机酸形成药用盐，例如硫酸盐、磷酸盐、 盐酸盐、或氢溴酸盐；也可以与有机酸形成药用盐，例如醋酸盐、草酸盐、柠 檬酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺 酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、或马来酸盐等。选择和制备适当的盐是本领域技术 人员公知技术。
所述的化合物或其可药用盐可以单独或以药物组合物的形式给药。本发明 药物组合物可根据给药途径配成各种适宜剂型。使用一种或多种生理学上可接 受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上 使用的制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知 的常识进行制备。
给药途径可以是口服、非肠道或局部给药，优选口服和注射形式给药。可 以口服的药物制剂包括胶囊剂和片剂等。本发明化合物也可以配制用于肠胃外 给药或者透皮给药或者经粘膜给药，或者采用栓剂或者埋植剂的方式给药。本 领域技术人员可以理解，本发明化合物可以采用合适的药物释放系统(DDS) 以得到更有利的效果。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，使本专业技术人员更全面的 理解本发明，但本发明的保护范围不受实施例的限制。
首先参考文献(Hauel NH,Nar H,Priepke H,et al.Structure-Based Design of Novel Potent NopePtide Thrombin Inhibitors.J.Med.Chem.2002；45:1757-1766)方 法合成达比加群酯的中间体Ⅱ，并以其为原料合成通式Ⅰ所示的达比加群的酯衍 生物：
R1代表H或C1-C5的烷基；R2代表天然氨基酸酯；X代表O、S或者N；Y 代表C或者N。
以化合物Ⅱ为起始原料，经酰胺化、缩合得到中间体Ⅲ；将中间体Ⅲ进行酯 交换反应得到中间体Ⅳ，中间体Ⅳ与乙酰氧肟酸进行环合反应得到得到达比加 群的酯衍生物I(I1-I15)。
实施例1
2-(3-(2-(((3-氨基苯并[D]异恶唑-6-基)氨基)甲基)-1-甲基-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并 咪唑-5-甲酰胺基)丙氨基)-3-甲基丁酸甲酯的(Ⅰ1)制备
1)3-(2-(((4-氰基-3-氟苯基)氨基)甲基)-1-甲基-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并咪唑-5- 甲酰胺基)丙酸乙酯(Ⅲa)的合成
将2-((4-氰基-3-氟苯基)氨基)乙酸(1.94g,0.01mol)、EDCI(1.9g，0.01mol)、 HOBt(1.35g，0.01mol)溶于THF(35ml)和DMF(5ml)混合液中。冰水浴中搅 拌35min，升至室温，缓慢滴加3-[(3-氨基-4-甲基氨基苯甲酰)吡啶-2-基氨基] 丙酸乙酯Ⅱa(3.1g，0.009mo1)的THF(15m1)溶液。加毕搅拌6h。蒸去溶剂， 加入二氯甲烷(30m1)，用饱和盐水(5ml x 3)洗涤，经无水硫酸钠干燥后过滤， 滤液浓缩至干，剩余物中加冰乙酸(45m1)，加热回流2h，减压浓缩至干， 剩余物中加入浓氨水(15m1)，室温搅拌30min蒸去溶剂，剩余物中加入二氯 甲烷(25m1)，经饱和盐水(5mL x 3)洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩 至干，剩余物经柱色谱纯化，得淡黄色固体Ⅲa 3.3g，收率72.8％，ESI-MS:m/z 501[M+H]+。
2)2-(3-(2-(((4-氰基-3-氟苯基)氨基)甲基)-1-甲基-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并咪唑 -5-甲酰胺基)丙胺基)-3-甲基丁酸甲酯(Ⅳa)的合成
将中间体Ⅲa(5.0g，9.99mmo1)、L-缬氨酸甲酯盐酸盐(2.0g，12.00mmo1)、 碳酸钠(5.3g，50.00mmo1)、无水乙醇(60ml)加入到100ml的反应瓶中，加 热回流5小时，冷却至室温，蒸干溶剂，剩余物中加入二氯甲烷(3×50m1)萃取， 有机相再用饱和盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸镁干燥后过滤，滤液浓缩至干， 剩余物经柱色谱纯化，得白色固体Ⅳa 4.2g，收率71.8％，ESI-MS:m/z 586 [M+H]+。
3)2-(3-(2-(((3-氨基苯并[D]异恶唑-6-基)氨基)甲基)-1-甲基-N-(吡啶-2-基)-1H- 苯并咪唑-5-甲酰胺基)丙氨基)-3-甲基丁酸甲酯(Ⅰ1)的合成
将中间体Ⅳa(5.85g,0.01mol)和碳酸钾(6.5g,0.045mol)溶于100ml的DMF 和30ml的水的混合溶液中，常温下搅拌。称取乙酰氧肟酸(2.04g,0.03mol)分 批加入上述反应液中。加毕，反应12小时，停止反应，滤出固体，母液浓缩至 干，剩余物经柱色谱纯化，得到白色固体(Ⅰ1)5.1g，收率85.3％，1H NMR(DMAO-d6,400MHz)δ:0.88(d,J＝8.4Hz,6H，2×CH3),2.15-2.26(m,1H,CH), 2.44-2.53(m,2H,CH2),3.21-3.33(m,2H,CH2),3.79(s,3H,OCH3),3.86(s,3H, NCH3),4.33-4.41(m,1H,CH),4.47(s,2H,CH2),6.56-6.85(m,4H,ArH),7.44-8.21(m, 6H,ArH),8.12(br s,1H,NH)，8.23-8.41(br s,2H,NH2)，ESI-MS:m/z 599[M+H]+。
实施例2-15
实验条件参照实施例1的操作，区别仅在于选用不同的Ⅱ、4-氰基取代苯乙 酸和天然氨基酸酯为原料，得到下述式Ⅰ的化合物。
实施例16
抗凝活性评价-活化部分凝血活酶时间(aPTT)的测定
将质量18-20g的昆明小鼠，随机分组，每组10只，禁食过夜。将达比加群 酯及待测目标化合物悬浮或溶解于1％的羧甲基纤维素钠的水溶液中，配成 1mg/mL的浓度，按10mg/Kg的剂量(折合成达比加群计算)灌胃给药，半小 时后通过心脏穿刺取血，加入4％枸杞酸钠溶液至0.4％终浓度抗凝，12000r/min 离心5分钟，取血浆0.1mL，加入aPPT试剂0.1mL，37℃预温3分钟后，加入 37℃预温的氯化钙溶液0.1mL，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间，即 为aPTT值。结果见表1.
表1活化部分凝血活酶时间(aPTT)的测定结果
化合物 aPTT(sec)
生理盐水 21.2±4.5
达比加群酯 75.3±2.1
Ⅰ1 83.1±4.2
Ⅰ2 55.2±1.2
Ⅰ5 180.1±2.9
Ⅰ8 31.5±2.5
Ⅰ10 25.8±4.2
Ⅰ13 88.2±2.3
Ⅰ14 147.1±3.5
。
实施例17
生物利用度的测定
给药前要求：禁食十二小时，自由饮水。
给药方式：Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ5、Ⅰ8、Ⅰ10、Ⅰ13、Ⅰ14号和达比加群酯灌胃，达 比加群静脉注射。
剂量设置：静脉注射：3mg/kg；灌胃：Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ5、Ⅰ8、Ⅰ10、Ⅰ13、Ⅰ14号和达比加群酯剂量都相当于达比加群30mg/kg。
受试物配置：静脉给药：达比加群用1％DMSO+生理盐水溶液研磨配置成相 应浓度给药。灌胃：Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ5、Ⅰ8、Ⅰ10、Ⅰ13、Ⅰ14号 和达比加群酯用1％DMSO+30％甘油生理盐水溶液。
给药容量：：0.5ml/100g，灌胃：1ml/100g。
采血时间：静脉注射：给药前和给药后2、10、30min以及1h、2h、4h、5h 眼眶后静脉丛取血约500μl。
灌胃：给药前和给药后10、30min、1、2、4、6h眼眶后静脉丛取血约500μl。
血样处理：血样直接置于含有10μl肝素(7.5U)EP管中，3500rpm离心10 min，分别取两管血浆，每管0.1ml，其中一管加0.1ml 0.1M盐酸 酸化，分别保存于-20℃冰箱待测。
数据处理：运用药代动力学相关软件计算AUC(0-t)、AUC(0-∞)、t1/2z、 Tmax、CLz和Cmax。生物利用度按下式计算：(po：灌胃给药途 径；iv：静脉注射)
F = AUC ( po ) × Dose ( iv ) AUC ( iv ) × Dose ( po ) ]]>
表2生物利用度的测定结果
化合物 生物利用度F(％)
达比加群酯 5.8
Ⅰ1 15.2
Ⅰ2 10.6
Ⅰ5 3.1
Ⅰ8 3.4
Ⅰ10 2.8
Ⅰ13 18.5
Ⅰ14 9.4
。
实施例18
达比加群酯衍生物的药物组合物的制备。
将达比加群酯衍生物Ⅰ1过80目筛，辅料过60目筛。按处方量称取达比加 群酯衍生物Ⅰ1、微晶纤维素和乳糖充分混合均匀，加入1％(重量/体积)羟丙 甲纤维素水溶液混合，制软材，过筛，制湿颗粒，于55℃干燥。将交联聚维酮 和硬脂酸镁加到上述的颗粒中，测定中间体含量，压片，包装。
实施例19
达比加群酯衍生物Ⅰ1的药物组合物的制备。
将达比加群酯衍生物Ⅰ1过80目筛，辅料过60目筛。按处方量称取达比加 群酯衍生物Ⅰ1、微晶纤维素、预胶化淀粉和乳糖充分混合均匀，加入1％(重量 /体积)羟丙甲纤维素水溶液混合，制软材，过筛，制湿颗粒，于55℃干燥。将 硬脂酸镁加到上述的颗粒中，测定中间体含量，装胶囊，包装。