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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201310401718.7(22)申请日 2013.09.05C12N 15/113(2010.01)C12N 15/63(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 5/10(2006.01)(71)申请人中国科学院上海生命科学研究院地址 200031 上海市徐汇区岳阳路319号(72)发明人时振英 戴争妍(74)专利代理机构上海一平知识产权代理有限公司 31266代理人崔佳佳 祝莲君(54) 发明名称水稻胚中的特异性启动子及其应用(57) 摘要本发明涉及一种水稻胚中的特异性启动子及其应用。该启动子特别适合驱动外源。
2、基因在水稻胚中特异性表达，而在水稻的其它组织中不表达。所述启动子的表达特异性和专一性很高。本发明还提供了具有所述启动子的构建物、表达盒和载体等。含本发明启动子的转基因水稻可以特异性地改善水稻的农艺性状，有效避免外源基因导入对水稻其它组织的影响，还能在胚中特异性表达外源基因，从而获得各种相关产物。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页序列表3页 附图1页(10)申请公布号 CN 104419707 A(43)申请公布日 2015.03.18CN 104419707 A1/1页21.一种启动子元件，所述启动子元件选自下组：(a)核苷。
3、酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性95%(较佳地98%)，且具有水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；(c)如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5端和/或3端截短1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。2.一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的权利要求1所述的启动子元件。3.一种表达盒，所述表达盒从5至3依次具有下述元件：权利要求1所述的启动子元件、基因ORF序列和终止子。4.一种载体，所述载体含有权利要求1所述的启动子元件、或权利要求。
4、3所述的表达盒。5.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体、或其染色体上整合有外源的权利要求1所述的启动子元件、或其染色体整合有权利要求3所述的表达盒。6.权利要求1所述的启动子元件，权利要求2所述的构建物，权利要求3所述的表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在水稻胚中的表达。7.一种在水稻胚中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作连接的权利要求1所述的启动子元件；(b)将步骤(a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞；(c)将步骤(b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而使所述外源基因在水稻胚中特异。
5、性表达。8.一种制备转基因水稻的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供下述水稻细胞，所述水稻细胞含有权利要求4所述载体、或其染色体整合有权利要求1所述启动子、或其染色体整合有权利要求3所述表达盒；(b)将(a)的水稻细胞再生为水稻植株，从而获得转基因水稻。9.一种水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎，所述水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎包下述水稻细胞或由下述水稻细胞构成：所述水稻细胞含有权利要求4所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的启动子元件、或其染色体整合有权利要求3所述的表达盒。权 利 要 求 书CN 104419707 A1/7页3水稻胚中的特异性启动子及其应用技术领域0001 本发明属于生。
6、物技术领域。具体地说，本发明涉及一种水稻胚中的特异性启动子及其应用。背景技术0002 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有一半人口以大米为主食，我国稻谷年消耗量和产量占世界总量的三分之一。我国是人口大国，提高粮食产量一直是重大的社会问题。可耕地面积的减少和人口的增加，加剧了对水稻产量和品质的要求，高产、优质日益成为水稻研究的重点问题。水稻的基因组相对较小，是禾本科作物功能基因组研究的模式植物。0003 胚是被子植物有性生殖过程中形成的，在植物发育中具有重要生物学意义。胚的发育始于合子，经过原胚和胚的分化发育阶段，最后达到成熟。融合形成的二倍体合子，既保持了物种遗传的相对稳定性，又为后代中。
7、可能出现新的遗传性状、新变异提供了基础，为研究植物遗传和育种学的提供重要理论依据。0004 基因通过表达来体现其功能，维持生物体的有序生长发育和各项活动。基因的表达调控一直是分子生物学研究的热点和中心课题之一，分为转录水平的调控，转录后水平的调控(mRNA的加工、成熟等)，翻译水平的调控等不同层面。启动子是精确启动基因表达的“开关”，在转录水平的调控过程中扮演着重要的角色，是基因在转录水平的调控过程中，影响基因表达水平的最直接和最有力的顺式调控原件。借助基因工程的方法，利用组织特异性的启动子，对特定基因进行的表达研究进行调控，或者对作物进行针对性的育种改造，都具有十分重要的应用价值。因此，研究。
8、组织特异性启动子的功能序列，对于基因的表达调控机制的研究，具有重要意义。但是，有些基因，例如非结构基因会发生基因的移转，从而很难找到在特定组织中特异性表达的相应启动子，再例如，有一些miRNA在组织中特异性存在，但与结构基因相比，由于miRNA太短、匹配区域太多，真正据此找到的具备组织特异性的miRNA启动子寥寥无几。0005 综上所述，本领域急需对水稻中的组织特异性启动子进行研究，以便阐明水稻的形态发育、代谢以及抗病抗逆等途径，进而准确有效地改变水稻的各种性状，改良水稻的品系，更好地调控其生长发育以及产量。发明内容0006 本发明的目的在于提供一种水稻的胚特异性启动子及其应用。0007 在第。
9、一方面，本发明提供一种启动子元件，所述启动子元件选自下组：0008 (a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；0009 (b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性95%(较佳地98%)，且具有水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；0010 (c)如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5端和/或3端截短1-60个(较佳地1-30，说 明 书CN 104419707 A2/7页4更佳地1-6个)核苷酸，且具有水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。0011 在优选的实施方式中，所述的水稻胚中特异启动功能表示所述启动子在水稻的胚以外的组织中不具有启动功能。001。
10、2 在另一优选的实施方式中，所述启动子元件的序列如SEQ ID NO:1所示。0013 在第二方面，本发明提供一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件。0014 在优选的实施方式中，所述的外源基因在天然状态下并不存在。0015 在另一优选的实施方式中，所述外源基因包括：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。0016 在另一优选的实施方式中，所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。0017 在另一优选的实施方式中，。
11、所述的筛选标记基因选自下组：gus(-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。0018 在另一优选的实施方式中，所述的抗原蛋白基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(如阿米巴病原LecA)、或自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTBpins抗原蛋白)。0019 在另一优选的实施方式中，所述的生物制剂基因选自下组：2b干扰素基因、或胰岛素样生长因子基因。0020 在另一优选的实施方式中，所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因、或雄。
12、性不育相关基因。0021 在第三方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒从5至3依次具有下述元件：本发明第一方面所述的启动子元件、基因ORF序列和终止子。0022 在优选的实施方式中，所述的表达盒还包括选自下组的一种或多种元件：poly(A)元件、增强子、转运元件、或基因靶向元件。0023 在第四方面，本发明提供一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的启动子元件、或本发明第三方面所述的表达盒。0024 在优选的实施方式中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或植物细胞病毒载体、穿梭载体。0025 在第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体上整。
13、合有外源的本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒。0026 在优选的实施方式中，所述宿主细胞的染色体具有一个或多个(如1-50个，较佳地2-6个)拷贝的本发明第一方面所述的启动子元件、或本发明第三方面所述的表达盒。0027 在另一优选的实施方式中，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、或农杆菌)、低等真核细胞(如酵母细胞)、或高等真核细胞(如植物细胞)。0028 在另一优选的实施方式中，所述的宿主细胞为植物细胞，更佳地为农作物、蔬菜、或花卉的植物细胞。0029 在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的启动子元件，本发明第二方面所述的构建物。
14、，本发明第三方面所述的表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在水稻胚中说 明 书CN 104419707 A3/7页5的表达。0030 在第六方面，本发明提供一种在水稻胚中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括以下步骤：0031 (a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件；0032 (b)将步骤(a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞；0033 (c)将步骤(b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而使所述外源基因在水稻胚中特异性表达。0034 在优选的实施方式中，所述外源基因在水稻除胚以外的其它组织中不表达或基本不表达。0035。
15、 在第八方面，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，所述方法包括以下步骤：0036 (a)提供下述水稻细胞，所述水稻细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的启动子、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒；0037 (b)将(a)的水稻细胞再生为水稻植株，从而获得转基因水稻。0038 在第九方面，本发明提供一种水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎，所述水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎包下述水稻细胞或由下述水稻细胞构成：所述水稻细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒。0039 应理解，在本发明。
16、范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明0040 图1显示了GUS表达载体(pBI101.1-P1-GUS、pBI101.1-P2-GUS和pBI101.1-P3-GUS)转化的转基因植株的GUS染色结果。具体实施方式0041 发明人经过广泛而深入的研究，从大量的水稻基因中出乎意料地发现了一个在水稻胚中特异性表达的启动子，从而在植物基因工程中使外源目的基因能在特定组织中高效表达，以便实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控，对水稻的分子生物学研究也具有启示意义。在此基。
17、础上完成了本发明。0042 发明人在水稻基因组中克隆了3个启动子序列，将它们构建到启动GUS基因的表达载体中，并转化野生型水稻中花11(ZH11，参见CN101928726B或CN101880671B)。通过GUS染色，成功获得水稻中胚特异性启动子-P1(SEQ ID NO:1)：0043 gcggctcttggcattcctccgacgtgggtggtggtgaagaagagcttggcgccgccgccgccgccgccgccgtagaagccgtcattgtcgaggacgccgacgcctggaagctttcgcgtgggggaggacatggggccgagggctggagaggagg。
18、gcaacgtcgaaggagtcttcctcggcagtccgctcctcccacgcccgcgtcgaggaaggcggcgagccgcagcagagcggcgggcagccatgccgggattggtttttcttttcttttttttttctgtgcgacggtggattgacgag说 明 书CN 104419707 A4/7页6cagtctcgttcgtttttgtccctccgcagttgctcgtaaatgggctgaatgggccatccttgccacgctcgtgcgatgcagaacgaaagaagcagcagcgccgtgaaatgccaatcggacgatggatcga。
19、cgcccgacgtcctatgacgttagctgcccaacgtcagacgatctgcttccctaggtttttagctagggaacttttttttttcatctgatatgctttaagaactttaaacaaaaatcaaactctaccgatgaaagcgaccgcaaagtgcgaaggaggaagaagggcaagaaggggaggaacccaataaggtgcgatatcaccatctctgccatctatgaagagctcgaggagatagaggtacagagggtgaggtggagaaagcaggacccactgaccactatttttatcttcttgtttgat。
20、tgacatgcggggcccacatatttttttttatatttttagttttcaattttgatgcttttatatattttttttgggggattgtactgtcacgtaggcatcatgtcaatgccatgtgggacgaatacctagtcataaggagtcacgtagacgcccatgagataaaaccggagataatacttccgagggaccttgtttacactattttttaagctaggaagggttgtatcatcatgtttttggttcaaggattaaaatcagactaggtgacaaaggggacctaaagtgaacttactgcgtata。
21、tttttccccttcattgaatctgctacttttgggggcccattgaccagcctggcatttcgctcacttgggtcgtgtgtttcttctctgccggacaacttggtcacaaacattcatcaaaatattgtggctattatatttctcctcttttgagatacaaccataaaaagaaactaaacaattaaaattatttatgactatcattaaactatcataaaaagaactccgaaattaacttaaaataggtttcaaattttatttttttttcctacagccgataaaccactaagcagacggtaaaaa。
22、aactagtacttctacttaaggagagaataataagtaggactaacaaccacaaactggtaaaccggtagctacttcagactctctgccttttttagcattttaagatcccatccagactgcatcgaatttacaatattctcttaaaatagctcaaaattccgtagaaattcgtctcgatgagatgtacgacatgtcctgttgctgccgtacgtactactagtactaatctaagcggctgagcagcgccggtcgaagaaggaagagtgtttcagctcggcgagcatttgctgctgggtgtgt。
23、gcagtacgcatgttggagagggagttgtactaccaaaccttgggacaggtcagcatcgtgtactccagctttgctctccccttgtactgatggatgggcaaattggcaggctatgagatgtggtactagctagtactactgtactagcagtggaatggttcaaggcaaagacattgcgttgcgtgtgtatatatacatctcccatgtttcttgaatcttgacgatgatggcgttggcctaaccggatttgcagtgcatcaggtaagggaaaaaggatggttagatagagagaaggggagt。
24、tctgtgattggagaggagaggagacagggatgaggcagagcatgggatggggcta。0044 本文所用的术语“本发明启动子”、“水稻胚中特异表达的启动子”、“启动子P1”或“P1”可互换使用，均表示源于水稻的启动子元件，其序列如SEQ ID NO.:1所示。0045 本发明的启动子能够高效、专一地在水稻胚中特异性表达，而在其它组织中不表达。因此，本发明的启动子可以用于特异性改善水稻的性状，避免外源基因对水稻的其它组织产生影响。0046 本文所用的术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于。
25、目的基因编码序列的上游(5端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。0047 在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。0048 鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员应理解，尽管本发明的实施例中提供的启动子P1的序列如SEQ ID NO:1所示，但本发明还应包括与本发明的启动子序列(SEQ ID NO:1)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，只要所述核酸也具有在。
26、水稻胚中特异性表达的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。说 明 书CN 104419707 A5/7页70049 本文所用的术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达。具体地说，本文所述的“水稻胚中特异性的表达”是指在本发明的启动子调控下，目的基因高度特异性和专一性地在水稻胚中表达。0050 本文所用的“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说也是。
27、“外源的”。0051 本文所用的“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。0052 本发明的启动子可以可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子可以是外源(异源)的。本文所述的外源基因(或目的基因)没有特别限制，可以是RNAi基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或植物或水稻改良上有重要特性或功能的蛋白。0053 所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。0054 所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选。
28、标记基因选自下组：gus(-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。所述的抗原蛋白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTBpins)、或生物制剂(如2b干扰素，胰岛素样生长因子等)。所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或雄性不育相关基因。0055 本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5-3依次具有下列元件：本发明的启动子、基因ORF序列和终止子。。
29、优选地，所述启动子序列如SEQ ID NO.:1所示或与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性95%，较佳地98%，更佳地99%。0056 本发明还提供了一种重组载体，其包含本发明的启动子和/或基因表达盒。在优选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5到3方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：3多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素。
30、抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。0057 用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。0058 本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。0059 本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵说 。
31、明 书CN 104419707 A6/7页8母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。0060 在优选的实施方式中，制备转基因植物的方法。
32、是：将携带可操作连接的启动子和目的基因的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。在本发明的实例中，所述的重组载体是带有GUS报告基因的pBI101.1双元载体，将本发明的启动子构建到该载体中GUS基因的上游，转化植株，启动子将激活GUS基囚的表达，所述启动受到启动子区顺式作用元件的调控，可以有效模拟基因在体内被激活转录的状况。0061 -葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，。
33、特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。0062 在本发明的具体实施例中，在本发明启动子的启动下，GUS基因可以特异地在水稻胚中表达，而在其它组织中不表达。因此该启动子可以用于在胚中特异性改善水稻的性状，而不使得外源基因对其它组织造成影响。0063 本发明的启动子、构建物、或表达盒等可用于在水稻胚中特异表达外源基因，从而改善水稻的农艺性状(如水稻的产量、品质)，或增强水稻对不利环境(如冷冻、高温、干旱、病毒、病菌、虫害或人工除草剂)的抵抗能力。本发明也可用于在水稻胚中特异性地生产蛋白产物(如抗原蛋白及生物制剂)，或用于研究外源基因在胚中的特定功能。0064 下面结合具体实施例，进。
34、一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。0065 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。0066 实施例0067 实施例1.水稻中胚特。
35、异性启动子的克隆0068 以常规方法抽提的水稻基因组DNA为模板，利用以下引物对(SEQ ID NO.:2和3)，通过常规PCR方法扩增出启动子P1：0069 正向引物:GGCTGCAGCGGCTGCTGTTCTTATGGC(SEQ ID NO:2)0070 反向引物:GGGATCCTGCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID NO:3)。0071 发明人还通过相同的方法，利用以下不同的反向引物扩增出另外两个启动子：P2说 明 书CN 104419707 A7/7页9和P3：0072 反向引物:GGGATCCGCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID NO:4)0073 反。
36、向引物:GGGATCCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID NO:5)。0074 实施例2.构建GUS表达载体0075 将实施例1获得的启动子序列分别与市售载体pMD19-T载体(Takara公司)连接，并进行测序验证。然后用HindIII和BamHI双酶切pMD19-T载体，回收约2kb的启动子片段，将该片段和含有GUS报告基因的二元载体pBI101.1(Clontech公司，美国)分别用限制性内切酶HindIII和BamHI进行双酶切，酶切产物通过凝胶回收后用T4-DNA连接酶进行连接，并转化到大肠杆菌DH5菌株中加以保存。0076 获得的最终载体命名为pBI101.1-P1-。
37、GUS、pBI101.1-P2-GUS和pBI101.1-P3-GUS。用热激转化法将重组载体pBI101.1-P1-GUS、pBI101.1-P2-GUS和pBI101.1-P3-GUS分别转化到农杆菌GV3101菌株中，并用PCR扩增验证。0077 实施例3.转基因植株的获得0078 将构建好的载体pBI101.1-P1-GUS、pBI101.1-P2-GUS和pBI101.1-P3-GUS分别转化至市售的农杆菌GV3101菌株，然后通过花浸法对野生型水稻中花11进行转化。0079 实施例4.GUS组织化学染色0080 对构建的转基因植株进行GUS染色，结果如图1所示，其中，A显示了转基因。
38、植株的根；B显示了转基因植株的茎和生长点(SAM)；C显示了转基因植株的叶；D显示了转基因植株的小花结构；E、F显示了转基因植株未成熟种子的幼胚；G显示了转基因植株未成熟种子的横切面；H显示了转基因植株未成熟种子的胚乳；I显示了转基因植株未成熟种子幼胚的横切面。0081 从本实施例的结果可以明显发现，通过GUS染色，pBI101.1-P2-GUS和pBI101.1-P3-GUS没有明显的GUS显色反应，而pBI101.1-P1-GUS1能够观察到显色部位，且显色部位集中在幼胚中，尤其是胚的盾片面。说明P1序列是胚特异性地正确启动GUS基因表达的启动子。0082 由此，本发明得到了在胚以及盾片中特异性表达的启动子。0083 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。说 明 书CN 104419707 A1/3页100001 0002 序 列 表CN 104419707 A10。