一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410621447.0	申请日：	2014.11.06
公开号：	CN104404077A	公开日：	2015.03.11
当前法律状态：	实审	有效性：	审中
法律详情：	实质审查的生效IPC(主分类):C12N15/81申请日:20141106\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/81; C12N1/19; C12N15/11; C12R1/865(2006.01)N	主分类号：	C12N15/81
申请人：	中国科学院天津工业生物技术研究所
发明人：	江会锋; 阮江星; 丁文涛; 许则滩; 马永硕; 卢丽娜; 董扬; 马延和
地址：	300308天津市滨海新区空港经济区西七道32号
优先权：
专利代理机构：	天津滨海科纬知识产权代理有限公司12211	代理人：	韩敏
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内容摘要

本发明公开了一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，是将多个外源基因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入宿主微生物。每个双向基因表达载体均包括双向终止子和双向启动子；除第一个双向基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因表达载体双向终止子的3’末端和下一个双向基因表达载体双向终止子的5’末端具有相同的同源臂，第一个双向基因表达载体双向终止子的5’末端及最后一个双向基因表达载体双向终止子的3’末端均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。通过该方法，建立了一种将整个基因表达过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程有机地组合起来的新技术。

权利要求书

权利要求书
1.  一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，其特征在于：将多个外源基因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入宿主微生物，得到表达多个外源基因的重组微生物；
所述每个双向基因表达载体均包括一个双向终止子和一个双向启动子；每个双向基因表达载体导入两个外源基因；
除第一个双向基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因表达载体的3’末端和下一个双向基因表达载体的5’末端具有相同的同源臂，所述第一个双向基因表达载体的5’末端具有同源臂甲，所述最后一个双向基因表达载体的3’末端具有同源臂乙，所述同源臂甲和所述同源臂乙均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主微生物为酵母；优选为酿酒酵母,更优选为酿酒酵母W303。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述双向基因表达载体有三个，第一双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:1所示的双向终止子T1，及序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1；第二双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:2所示的双向终止子T2，及序列表中SEQ ID NO:5所示的双向启动子P2；第三双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:3所示的双向终止子T3，及序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1。

4.  如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述多个外源基因为4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，其基因序列依次如序列表SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示。

5.  一种DNA片段，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的任一项的全部或部分。

6.  携带并表达核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的任一项所述DNA片段的重组表达载体。

7.  所述权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：
所述重组表达载体是由序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所述DNA片段连接在pUC57-Kan质粒上得到的；
或者，所述重组表达载体是由序列表中SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所述DNA片段连接在PMD18-T质粒上得到的。

8.  如权利要求3中所述方法中得到的第一双向基因表达载体或第二双向基因表达载体或第三双向基因表达载体。

9.  如权利要求1-4中任一项所述方法得到的重组微生物。

说明书

说明书一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法。
背景技术
微生物DNA的改造，包括目标基因的敲除与过表达是基因工程领域的核心内容。一个或两个基因在目标微生物中的表达通过现有技术不难实现，然而，多基因(两个以上)的表达依据现有技术尚存在许多难题，如克隆周期长、工作量大、成功率低、基因表达数量上限低等。尤其是真核生物的基因表达，一般每个基因都需要单独的启动子与终止子，使得一个基因表达就需要进行3次克隆，若进行多基因表达，如6个基因表达，就需要进行18次基因克隆，这种情况对于使用传统方法来说很难实现且极为费时。
目前，一些新兴的克隆技术，如Gateway重组技术、Gibson组装技术和Golden gate技术等虽然能够在一定程度上提高克隆的效率，但其在应用上也各自存在一定的短板或限制。更为重要的是，这些新方法只是针对基因克隆这一个技术环节，在序列设计、表达设计以及转化宿主细胞等方面并未提供任何帮助。因此，需要一种新技术将整个基因表达过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程有机地组合起来，实现多基因的快速、高效表达，同时能够降低操作入门门槛，减少培训学习时间，降低操作成本。
目前许多涉及基因表达的专利技术或工具载体(质粒)能够实现一到两个基因的快速表达。但是这些专利中的载体一般是发明人构建好的带有固定启动子或其它转录元件，只能以固定的强度进行目标基因的表达。而当前基因工程改造工作中经常需要多基因的协调配合，即需要各基因表达强度依据设计者意愿产生差别，这是现有工具载体或技术难以实现的，而本技术将解决这一难题。
另外,芹菜素具有抗肿瘤、改善心脑供血、抗炎症、降血压、抗焦虑、抗菌抗病毒以及抗氧化等生理功能。酿酒酵母自身不能产生芹菜素，转化芹菜素合成基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI及FSII)后即可由苯丙氨酸合成芹菜素。因此,需要一种能够将芹菜素合成基因快速导入酿酒酵母的方法。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组，实现多基因表达及微生物基因改造的方法。
本发明提供了一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，包括如下步骤：将多个外源基因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入宿主微生物，得到表达多个外源基因的重组微生物；
所述每个双向基因表达载体均包括一个双向终止子和一个双向启动子；每个双向基因表达载体导入两个外源基因；
除第一个双向基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因表达载体的3’末端和下一个双向基因表达载体的5’末端具有相同的同源臂，所述第一个双向基因表达载体的5’末端具有同源臂甲，所述最后一个双向基因表达载体的3’末端具有同源臂乙，所述同源臂甲和所述同源臂乙均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。
进一步，所述宿主微生物为酵母；优选为酿酒酵母,更优选为酿酒酵母W303。
所述多个外源基因为4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，其基因序列依次如序列表SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示。
所述双向基因表达载体有三个，第一双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:1所示的双向终止子T1(TPI1-PGIt)，及序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)；第二双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:2所示的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，及序列表中SEQ ID NO:5所示的双向启动子P2(PGK1-TEF2)；第三双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:3所示的双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，及序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)。
其中，第一双向基因表达载体的双向终止子T1(TPI1-PGIt)，如序列表SEQ ID NO:1所示，自5’末端第1131位至1180位的核苷酸，与第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，如序列表SEQ ID NO:2所示，自5’末端第1位至150位的核苷酸均为同源臂L2。
第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，如序列表SEQ ID NO:2所示，自5’末端第627位至776位的核苷酸,与第三双向基因表达载体的双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，如序列表SEQ ID NO:4所示，自5’末端第1位至150位的核苷酸均为同源臂L3。
所述第一双向基因表达载体还包括所述4CL、CHS基因；所述第二双向基因表达载体还包括所述CHI、FSII基因；所述第三双向基因表达载体还包括所述PAL、C4H基因。
上述方法中，第一双向基因表达载体、第二双向基因表达载体、第三双向基因表达载体的制备包括以下步骤：
(1)、合成序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，分别由1180、776、963个碱基组成；合成序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)、序列表中SEQ ID NO:5所示的双向启动子P2(PGK1-TEF2)，分别由1418、1312个碱基组成。
(2)、将双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)分别连接在pUC57-Kan质粒上，得到重组表达载体p-T1(TPI1-PGIt)、p-T2(ADH1t-CYC1t)、p-T3(tFBA1-tPDC1)；将双向启动子P1(TDH3-ADH1)、双向启动子P2(PGK1-TEF2)连接到PMD18-T质粒上得到重组表达载体PMD-P1(TDH3-ADH1)、PMD-P2(PGK1-TEF2)。
(3)、合成序列表中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示的4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，上述基因都来自于菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz，其优化后具有酿酒酵母偏爱密码子的基因序列，分别由1624、1199、718、1562、2136、2136个碱基组成。
(4)、以步骤(2)所得的重组表达载体p-T1(TPI1-PGIt)、p-T3(tFBA1-tPDC1)及宿主微生物酿酒酵母基因组为模板，构建同源臂甲L1、同源臂乙L4，整合位点Site1、Site2，标记基因HIS片段及重叠片段Site1-His-L1和Site2-L4。
(5)、构建第一双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、第二双向基因表达载体p-T2(CHI-FSII)和第三双向基因表达载体p-T3(PAL-C4H)；
将双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向启动子P1(TDH3-ADH1)和4CL、CHS基因连接构成第一双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)；
将双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向启动子P2(PGK1-TEF2)和CHI、FSII基因连接构成第二双向基因表达载体p-T2(CHI-FSII)；
将双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)、双向启动子P1(TDH3-ADH1)和PAL、C4H基因连接构成第三双向基因表达载体p-T3(PAL-C4H)。
进一步，所述三个双向基因表达载体同时导入宿主微生物酿酒酵母w303，得到重组微生物命名为重组酿酒酵母W303-1。
所述重组酿酒酵母W303-1为表达核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:6-11所示的DNA片段的重组酿酒酵母。
本发明提供了一种在微生物体内将多个外源基因一步整合到基因组上的方法，通过同源重组的原理，利用双向基因表达载体，将所需要的多个基因表达载体同时导入宿主细胞中，建立了一种将整个基因表达过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程有机地组合起来的新技术，实现了多基因的快速、高效表达，避免了多次转化及载体构建所带来的麻烦。
附图说明
图1为pUC57-Kan质粒。
图2为重组表达载体p-T1(TPI1-PGIt)质粒。
图3为重组表达载体p-T2(ADH1t-CYC1t)质粒。
图4为重组表达载体p-T3(tFBA1-tPDC1)质粒。
图5为PMD18-T质粒。
图6为重组表达载体PMD-P1(TDH3-ADH1)质粒。
图7为重组表达载体PMD-P2(PGK1-TEF2)质粒。
图8为实施例4中同源臂L1、L4，整合位点Site1、Site2，标记基因HIS片段PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳纯化的结果。
图9为实施例5中重叠片段Site1-His-L1和Site2-L4PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图10为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后PAL、C4H基因PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图11为实施例6中引入酶切位点PCR扩增4CL、CHS、CHI、FSII基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
图12为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后双向终止子基因T1(TPI1-PGIt)、T2(ADH1t-CYC1t)、T3(tFBA1-tPDC1)的琼脂糖凝胶电泳结果。
图13为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后双向启动子基因P1(TDH3-ADH1)、P2(PGK1-TEF2)的琼脂糖凝胶电泳结果。
图14为实施例6中大肠杆菌PCR扩增4CL、CHS基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
图15为实施例6中大肠杆菌PCR扩增CHI、FSII基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
图16为实施例6中大肠杆菌PCR扩增PAL、C4H基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
图17为实施例6中扩大培养后p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)的琼脂糖凝胶电泳结果。
图18为实施例7中PCR扩增后T1(4CL-CHS)、T2(CHI-FSII)的琼脂糖凝胶电泳结果。
图19为实施例7中PCR扩增后T3(PAL-C4H)的琼脂糖凝胶电泳结果。
图20为实施例9中重组酿酒酵母W303-1基因组PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1双向终止子、双向启动子的合成
(1)双向终止子的合成
合成序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，分别由1180、776、963个碱基组成。其中，第一双向基因表达载体的双向终止子T1(TPI1-PGIt)，如序列表SEQ ID NO:1所示，自5’末端第1031位至1180位的核苷酸，与第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，如序列表SEQ ID NO:2所示，自5’末端第1位至150位的核苷酸均为同源臂L2。第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，如序列表SEQ ID NO:2所示，自5’末端第627位至776位的核苷酸,与第三双向基因表达载体的双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，如序列表SEQ ID NO:4所示，自5’末端第1位至150位的核苷酸为均同源臂L3。
(2)双向启动子的合成
合成序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)、序列表中SEQ ID NO:5所示的双向启动子P2(PGK1-TEF2)，分别由1418、1312个碱基组成。
实施例2构建p-T1(TPI1-PGIt)质粒、p-T2(ADH1t-CYC1t)质粒、p-T3(tFBA1-tPDC1)质粒、PMD-P1(TDH3-ADH1)质粒、PMD-P2(PGK1-TEF2)质粒
将双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)分别连接在pUC57-Kan质粒(如图1所示)上，得到重组表达载体p-T1(TPI1-PGIt)(如图2所示)、p-T2(ADH1t-CYC1t)(如图3所示)、p-T3(tFBA1-tPDC1)(如图4所示)。将双向启动子P1(TDH3-ADH1)、双向启动子P2(PGK1-TEF2)连接到PMD18-T质粒(如图5所示)上得到重组表达载体PMD-P1(TDH3-ADH1) (如图6所示)、PMD-P2(PGK1-TEF2)(如图7所示)。
实施例3目的基因的合成
合成序列表中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示的4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，上述基因都来自于菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz，其优化后具有酿酒酵母偏爱密码子的基因序列，分别由1624、1199、718、1562、2136、2136个碱基组成。
实施例4同源臂L1、L4，整合位点Site1、Site2，标记基因HIS片段的构建
(1)引物设计：
L1-Fo:5’-TCCCTCCACCAAAGGTGTTCTTATGTAGCCCCGGTCCGTTTGTTCTAT-3’
L1-Ro:5’-CTCGAGAGGCAATTTTAGAGGGGACTTC-3’
L4-Fo:5’-CCAGACGATACAGAGGCTAAGA-3’；
L4-Ro:5’-CCACTTTTGTTGGGGACGATTAGGTTCCAACTGCTCTTACTGT-3’
Site1-Fo:5’-GTCGGTCGACTGTGCACAAAGGCCATAATAT-3’
Site1-Ro:5’-TCGGAAGAGGTTTTGTCATCCGAAGGCATGAGTTATGGTTGCACA-3’
Site2-Fo:5’-TACAGTAAGAGCAGTTGGAACCTAATCGTCCCCAACAAAAGTGGGCT-3’
Site2-Ro:5’-AAAGCTGGCTCCCCTTAGACAAATACGCTA-3’
HIS-Fo:5’-AACCATAACTCATGCCTTCGGATGACAAAACCTCTTCCGATAAAAACA-3’
HIS-Ro:5’-TAGAACAAACGGACCGGGGCTACATAAGAACACCTTTGGTGGAGGGA-3’
(2)PCR反应体系：
上游引物下游引物模板延伸时间Site1-FoSite1-Ro酿酒酵母W303基因组30秒Site2-FoSite2-Ro酿酒酵母W303基因组30秒HIS-FoHIS-RoP-YES21分15秒L1-FoL1-Rop-T1(TPI1-PGIt)20秒L4-FoL4-Rop-T3(tFBA1-tPDC1)20秒
(3)PCR扩增条件：94℃变性5分钟，之后“94度变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分15秒”34个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
(4)琼脂糖凝胶电泳纯化，胶图结果如图8所示。
实施例5重叠片段Site1-His-L1和Site2-L4的构建
(1)重叠片段site1-His-L1的构建
(a)PCR体系：site1 1ul、His 1ul、L1 1ul、site1-F 2ul、L1-R 2ul、TOP Taq 0.5ul、10Xbuffer 5ul、dNTPs 4ul无菌水补到终体积50ul。(b)PCR反应程序：94℃变性5分钟，之后“94度变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分30秒”34个循环，72℃延伸10min，4℃保温。(c)琼脂糖凝胶电泳纯化，胶图结果如图9所示。
(2)重叠片段Site2-L4的构建
(a)PCR体系：site2 1ul、L4 1ul、site1-F 2ul、L1-R 2ul、TOP Taq 0.5ul、10Xbuffer 5ul、dNTPs 4ul无菌水补到终体积50ul。(b)PCR反应程序：94℃变性5分钟，之后“94度变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸50秒”34个循环，72℃延伸10min，4℃保温。(c)琼脂糖凝胶电泳纯化，胶图结果如图9所示。
实施例6双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)的构建
(1)分别在目的基因4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H上引入BsaI酶切位点：
(a)引物设计：
CHS-F：5’-ACCAGGTCTCAGAATGGCTTCTTCTATCGACATCGCTGC-3’
CHS-R：5’-ACCAGGTCTCACGATTTAAGTAGCGATAGCAGTAGTAGTTGGCAAAGAGT-3’
4CL-F：5’-ACCAGGTCTCAAGGTTTAAGATGGAACACCAGCAGCCA-3’
4CL-R：5’-ACCAGGTCTCAGATGGACTCTCAAAAGGAAATCATCTTCAGATCT-3’
CHI-F：5’-ACCAGGTCTCAAGGTTTACAAACCGTACTTAGAAACGTCAGC-3’
CHI-R：5’-ACCAGGTCTCAGATGGCTGCTACTACTACTCCATTGAC-3’
FSII-F：5’-ACCAGGTCTCAGAATGAACATGTTGCAAGTTTTCCAATC-3’
FSII-R：5’-ACCAGGTCTCACGATTTAAGTAGAACCCAAGATTTGAGAACAG-3’
PAL-F：5’-CCGGTCTCAGAATATGGAAAACGGTCACGCTAACGGTG-3’
PAL-R：5’-CCGGTCTCAAGGTTTAACAGATTGGCAATGGAGCACCGTTCCAAC-3’
C4H-F：5’-CCGGTCTCAGATGATGGACTTGTTGTTGTTGGAAAAGA-3’
C4H-R：5’-CCGGTCTCACGATTTAGAAAGATCTTGGCTTAGCAACGATA-3’
(b)PCR扩增条件：以目的基因4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H为模板，94℃变性5分钟，之后“94度变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分15秒”34个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
(c)琼脂糖凝胶电泳纯化目的产物，结果如图10、11所示。
(2)分别在双向终止子基因T1(TPI1-PGIt)、T2(ADH1t-CYC1t)、T3(tFBA1-tPDC1)和双向启动子基因P1(TDH3-ADH1)、P2(PGK1-TEF2)上引入BsaI酶切位点。
(a)引物设计：
T1-F:5’-CAATCGAACAAATCGCTCTTAA-3’；
T1-R:5’-GAATTCGGTCTCAACCTGATTAAT-3’
T2-F:5’-AGCTTGGTCTCAATCGTCATGTAATT-3’
T2-R:5’-CGAATTCGGTCTCAACCTAGTTATA-3’
T3-F:5’-GGGTCTCAATCGGAATTCGC-3’
T3-R:5’-GGGTCTCAACCTAAGCTTGTTAA-3’
P1-F:5’-ACCAGGTCTCACATCTTTGTTTGTTTATT-3’；
P1-R:5’-ACCAGGTCTCAATTCTGTATATGAGATAGT-3’
P2-F:5’-ACCAGGTCTCACATCGTTTTATATTTGTT-3’
P2-R:5’-ACCAGGTCTCAATTCGGTACTAGTGTTTAG-3’
(b)PCR扩增条件：以双向终止子基因T1(TPI1-PGIt)、T2(ADH1t-CYC1t)、T3(tFBA1-tPDC1)和双向启动子基因P1(TDH3-ADH1)、P2(PGK1-TEF2)分别1ul为模板，94℃变性5分钟，之后“94度变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸2分30秒”34个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
(c)琼脂糖凝胶电泳纯化目的产物，结果如图12、13所示。
(3)循环酶切连接体系
(a)以T1、P1、4CL、CHS为一组，T2、P2、CHI、FSII为一组，T3、P1、PAL、C4H为一组按照如下体系配比添加。
T1/T2/T3(载体骨架)(200ng)P1/P2与载体骨架等摩尔的量4CL/CHI/PAL与载体骨架等摩尔的量CHS/FSII/C4H与载体骨架等摩尔的量10XNEB T4buffer(NEB)1.5ul100XBSA*(NEB)0.15ulBsaI(NEB)1ulNEB T4Ligase(NEB)1ulddH2O补足到15ul
Total15ul
(b)循环程序：37℃3分钟16℃5分钟，这两个温度做30～50个循环酶切连接、50℃5分钟终酶切、80℃5分钟灭活。
(4)将酶切连接体系转化大肠杆菌DH5α，采用卡那霉素抗性的LB平板(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、1.5％琼脂粉、100ug/ml的卡那霉素)进行阳性克隆筛选，37℃过夜培养。
(5)单克隆PCR验证
(a)挑取单菌落在1ml卡那霉素抗性的LB液体培养基(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、100ug/ml的卡那霉素)中摇培2小时(220rpm/min)，取0.5ul菌液做模板PCR。
(b)PCR体系：
上游引物下游引物模板延伸时间CHS-FCHS-RCHS1分15秒4CL-F4CL-R4CL1分15秒CHI-FCHI-RCHI1分15秒FSII-FFSII-RFSII1分15秒PAL-FPAL-RPAL1分15秒C4H-FCH4-RC4H1分15秒
(c)PCR扩增条件：聚合酶为Easy Taq聚合酶，94℃变性5分钟，之后“94度变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分15秒”34个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
(d)PCR结束琼脂糖凝胶电泳验证，如图14、15、16所示。
(6)提取质粒酶切验证
(a)扩大培养：将正确条带对应的菌液200ul加入5ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中摇培12～16小时(220rpm/min)，扩大培养。
(b)用质粒提取试剂盒对扩大摇培获得的菌液提取质粒。
(c)酶切验证
酶切体系：质粒3ul，cutsmart(酶切buffer)2ul，BsmBI 1ul，无菌水补足到20ul，37℃酶切2小时。琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图17所示。
实施例7双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)的扩增
(1)以酶切验证正确的质粒为模板在同源臂L1-L4两端设计合适的引物
L1-F:5’-CCCCGGTCCGTTTGTTCTAT-3’；L2-R:5’-GCGAGTTGGATAGCCCGAGC-3’
L2-F:5’-TCTGGACGATTGGGCGACTT-3’；L3-R:5’-ACTTAGTCCGTTTCTCGGCTAT-3’
L3-F:5’-TAGACGCCAACTACGCTGAC-3’；L4-R:5’-AGGTTCCAACTGCTCTTACTGT-3’
(2)PCR扩增条件：以双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)分别模板，94℃变性5分钟，之后“94度变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸2分30秒”34个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
(3)琼脂糖凝胶电泳纯化目的产物，结果如图18、19所示。
实施例8双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)的转化
(1)活化W303酿酒酵母，从W303平板上挑取单菌落在YPAD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、50mg腺嘌呤)中过夜摇培12h。
(2)用分光光度计测培养菌液的OD600。
(3)以初始OD600值为0.2OD转接到50ml的新鲜YPAD培养基中。
(4)活化4-5小时让酵母增值两代，此时菌液OD600值在0.8-0.9。
(5)3000g5min收集菌体，25mlddH2O洗两次。
(6)1ml水重悬到无菌1.5ml离心管中。
(7)13000rpm离心30s收集菌体。
(8)1ml水重悬分装每管100ul用于转化，将分装的菌液在掌上离心机上离心20s弃上清加转化体系。
(9)转化体系：
PEG3350(50％(W/V过滤除菌))240ulLiAc 1.0M(过滤除菌)36ulSSDNA(2.0mg/ml)50ul共转化DNA片段和水34ulTotal360ul
共转化所需的片段，按每个片段加入400ng混合混匀即可。
(10)将转化体系置于42℃水浴热激40分钟涂CM-HIS固体培养基(8g/L His Minus Media、2％葡萄糖，1.5％琼脂粉)。
(11)置于30℃恒温培养箱中培养2～3天得到重组酿酒酵母W303-1。
实施例9双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)转化后验证
(1)挑取单菌落在5ml的CM-HIS液体培养基上30℃200rpm培养12～16小时。
(2)用酵母基因组提取试剂盒提取重组酿酒酵母W303-1基因组。
(3)以提取的重组酿酒酵母W303-1基因组为模板PCR验证。
(a)引物设计
Co-F1：5’-AGGCAAGATAAACGAAGGCAAAG-3’；Co-R1：5’-GACACTGTTAGAATGAAGTTCCCAAA-3’
Co-F2：5’-TGCTACTAAGGCTATCAAGGAATGG-3’；Co-R2：5’-TGGTGTTTGGAAGGCTCACG-3’
Co-F3：5’-AACTGTTCTCAAATCTTGGGTTCTACT-3’；Co-R3：5’-CATCTTGGACGGTTCTGACTACG-3’
Co-F4：5’-AATACAACTACGGTGACTTCATCCC-3’；Co-R4：5’-GGCTCCCCTTAGACAAATACG-3’
(b)PCR括增条件：聚合酶为Easy Taq聚合酶，以酵母基因组DNA为模板，94℃变性5分钟，之后“94度变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分15秒”34个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
(c)PCR结束琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图20所示。
以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

资源描述

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410621447.0(22)申请日 2014.11.06C12N 15/81(2006.01)C12N 1/19(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(71)申请人中国科学院天津工业生物技术研究所地址 300308 天津市滨海新区空港经济区西七道32号(72)发明人江会锋阮江星丁文涛许则滩马永硕卢丽娜董扬马延和(74)专利代理机构天津滨海科纬知识产权代理有限公司 12211代理人韩敏(54) 发明名称一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法(57) 摘要本发。

2、明公开了一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，是将多个外源基因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入宿主微生物。每个双向基因表达载体均包括双向终止子和双向启动子；除第一个双向基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因表达载体双向终止子的3末端和下一个双向基因表达载体双向终止子的5末端具有相同的同源臂，第一个双向基因表达载体双向终止子的5末端及最后一个双向基因表达载体双向终止子的3末端均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。通过该方法，建立了一种将整个基因表达过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程有机地组合起来的新技术。(51)Int.C。

3、l.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表8页附图8页(10)申请公布号 CN 104404077 A(43)申请公布日 2015.03.11CN 104404077 A1/1页21.一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，其特征在于：将多个外源基因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入宿主微生物，得到表达多个外源基因的重组微生物；所述每个双向基因表达载体均包括一个双向终止子和一个双向启动子；每个双向基因表达载体导入两个外源基因；除第一个双向基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因表达载体的3末。

4、端和下一个双向基因表达载体的5末端具有相同的同源臂，所述第一个双向基因表达载体的5末端具有同源臂甲，所述最后一个双向基因表达载体的3末端具有同源臂乙，所述同源臂甲和所述同源臂乙均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主微生物为酵母；优选为酿酒酵母,更优选为酿酒酵母W303。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述双向基因表达载体有三个，第一双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:1所示的双向终止子T1，及序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1；第二双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:2所示的双向终止子T2，及。

5、序列表中SEQ ID NO:5所示的双向启动子P2；第三双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:3所示的双向终止子T3，及序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1。4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述多个外源基因为4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，其基因序列依次如序列表SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示。5.一种DNA片段，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ。

6、 ID NO:4、SEQ ID NO:5的任一项的全部或部分。6.携带并表达核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的任一项所述DNA片段的重组表达载体。7.所述权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是由序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所述DNA片段连接在pUC57-Kan质粒上得到的；或者，所述重组表达载体是由序列表中SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所述DNA片段连接在PMD18-T质粒上得到的。8.如权利要求3中所。

7、述方法中得到的第一双向基因表达载体或第二双向基因表达载体或第三双向基因表达载体。9.如权利要求1-4中任一项所述方法得到的重组微生物。权利要求书CN 104404077 A1/9页3一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法技术领域0001 本发明属于基因工程领域，涉及一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法。背景技术0002 微生物DNA的改造，包括目标基因的敲除与过表达是基因工程领域的核心内容。一个或两个基因在目标微生物中的表达通过现有技术不难实现，然而，多基因(两个以上)的表达依据现有技术尚存在许多难题，如克隆周期长、工作量大、成功率低、基因表达数量上限低等。尤其是真核。

8、生物的基因表达，一般每个基因都需要单独的启动子与终止子，使得一个基因表达就需要进行3次克隆，若进行多基因表达，如6个基因表达，就需要进行18次基因克隆，这种情况对于使用传统方法来说很难实现且极为费时。0003 目前，一些新兴的克隆技术，如Gateway重组技术、Gibson组装技术和Golden gate技术等虽然能够在一定程度上提高克隆的效率，但其在应用上也各自存在一定的短板或限制。更为重要的是，这些新方法只是针对基因克隆这一个技术环节，在序列设计、表达设计以及转化宿主细胞等方面并未提供任何帮助。因此，需要一种新技术将整个基因表达过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程有机地组合起来。

9、，实现多基因的快速、高效表达，同时能够降低操作入门门槛，减少培训学习时间，降低操作成本。0004 目前许多涉及基因表达的专利技术或工具载体(质粒)能够实现一到两个基因的快速表达。但是这些专利中的载体一般是发明人构建好的带有固定启动子或其它转录元件，只能以固定的强度进行目标基因的表达。而当前基因工程改造工作中经常需要多基因的协调配合，即需要各基因表达强度依据设计者意愿产生差别，这是现有工具载体或技术难以实现的，而本技术将解决这一难题。0005 另外,芹菜素具有抗肿瘤、改善心脑供血、抗炎症、降血压、抗焦虑、抗菌抗病毒以及抗氧化等生理功能。酿酒酵母自身不能产生芹菜素，转化芹菜素合成基因(PAL、C4。

10、H、4CL、CHS、CHI及FSII)后即可由苯丙氨酸合成芹菜素。因此,需要一种能够将芹菜素合成基因快速导入酿酒酵母的方法。发明内容0006 本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组，实现多基因表达及微生物基因改造的方法。0007 本发明提供了一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，包括如下步骤：将多个外源基因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入宿主微生物，得到表达多个外源基因的重组微生物；0008 所述每个双向基因表达载体均包括一个双向终止子和一个双向启动子；每个双向基因表达载体导入两个外源基因；0009 除第一个双向。

11、基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因说明书CN 104404077 A2/9页4表达载体的3末端和下一个双向基因表达载体的5末端具有相同的同源臂，所述第一个双向基因表达载体的5末端具有同源臂甲，所述最后一个双向基因表达载体的3末端具有同源臂乙，所述同源臂甲和所述同源臂乙均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。0010 进一步，所述宿主微生物为酵母；优选为酿酒酵母,更优选为酿酒酵母W303。0011 所述多个外源基因为4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，其基因序列依次如序列表SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ。

12、 ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示。0012 所述双向基因表达载体有三个，第一双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:1所示的双向终止子T1(TPI1-PGIt)，及序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)；第二双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:2所示的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，及序列表中SEQ ID NO:5所示的双向启动子P2(PGK1-TEF2)；第三双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID NO:3所示的双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，及序列表中SEQ ID NO。

13、:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)。0013 其中，第一双向基因表达载体的双向终止子T1(TPI1-PGIt)，如序列表SEQ ID NO:1所示，自5末端第1131位至1180位的核苷酸，与第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，如序列表SEQ ID NO:2所示，自5末端第1位至150位的核苷酸均为同源臂L2。0014 第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，如序列表SEQ ID NO:2所示，自5末端第627位至776位的核苷酸,与第三双向基因表达载体的双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，如序列表SEQ ID NO:4所示。

14、，自5末端第1位至150位的核苷酸均为同源臂L3。0015 所述第一双向基因表达载体还包括所述4CL、CHS基因；所述第二双向基因表达载体还包括所述CHI、FSII基因；所述第三双向基因表达载体还包括所述PAL、C4H基因。0016 上述方法中，第一双向基因表达载体、第二双向基因表达载体、第三双向基因表达载体的制备包括以下步骤：0017 (1)、合成序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，分别由1180、776、963个碱基组成；。

15、合成序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)、序列表中SEQ ID NO:5所示的双向启动子P2(PGK1-TEF2)，分别由1418、1312个碱基组成。0018 (2)、将双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)分别连接在pUC57-Kan质粒上，得到重组表达载体p-T1(TPI1-PGIt)、p-T2(ADH1t-CYC1t)、p-T3(tFBA1-tPDC1)；将双向启动子P1(TDH3-ADH1)、双向启动子P2(PGK1-TEF2)连接到PMD18-T质粒上得到重组表达载。

16、体PMD-P1(TDH3-ADH1)、PMD-P2(PGK1-TEF2)。0019 (3)、合成序列表中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示的4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，上述基因都来自于菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz，其优化后具有酿酒酵母偏爱密码子的基因序列，分别由1624、1199、718、1562、2136、2136个碱基组成。0020 (4)、以步骤(2)所得的重组表达载体p-T1(TPI1-。

17、PGIt)、p-T3(tFBA1-tPDC1)及宿说明书CN 104404077 A3/9页5主微生物酿酒酵母基因组为模板，构建同源臂甲L1、同源臂乙L4，整合位点Site1、Site2，标记基因HIS片段及重叠片段Site1-His-L1和Site2-L4。0021 (5)、构建第一双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、第二双向基因表达载体p-T2(CHI-FSII)和第三双向基因表达载体p-T3(PAL-C4H)；0022 将双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向启动子P1(TDH3-ADH1)和4CL、CHS基因连接构成第一双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)；002。

18、3 将双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向启动子P2(PGK1-TEF2)和CHI、FSII基因连接构成第二双向基因表达载体p-T2(CHI-FSII)；0024 将双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)、双向启动子P1(TDH3-ADH1)和PAL、C4H基因连接构成第三双向基因表达载体p-T3(PAL-C4H)。0025 进一步，所述三个双向基因表达载体同时导入宿主微生物酿酒酵母w303，得到重组微生物命名为重组酿酒酵母W303-1。0026 所述重组酿酒酵母W303-1为表达核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:6-11所示的DNA片段的重组酿酒酵母。0027 本发明提供了。

19、一种在微生物体内将多个外源基因一步整合到基因组上的方法，通过同源重组的原理，利用双向基因表达载体，将所需要的多个基因表达载体同时导入宿主细胞中，建立了一种将整个基因表达过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程有机地组合起来的新技术，实现了多基因的快速、高效表达，避免了多次转化及载体构建所带来的麻烦。附图说明0028 图1为pUC57-Kan质粒。0029 图2为重组表达载体p-T1(TPI1-PGIt)质粒。0030 图3为重组表达载体p-T2(ADH1t-CYC1t)质粒。0031 图4为重组表达载体p-T3(tFBA1-tPDC1)质粒。0032 图5为PMD18-T质粒。0033。

20、图6为重组表达载体PMD-P1(TDH3-ADH1)质粒。0034 图7为重组表达载体PMD-P2(PGK1-TEF2)质粒。0035 图8为实施例4中同源臂L1、L4，整合位点Site1、Site2，标记基因HIS片段PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳纯化的结果。0036 图9为实施例5中重叠片段Site1-His-L1和Site2-L4PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。0037 图10为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后PAL、C4H基因PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。0038 图11为实施例6中引入酶切位点PCR扩增4CL、CHS、CHI、FSII基因的琼脂糖凝胶电泳结果。0039 图12。

21、为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后双向终止子基因T1(TPI1-PGIt)、T2(ADH1t-CYC1t)、T3(tFBA1-tPDC1)的琼脂糖凝胶电泳结果。0040 图13为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后双向启动子基因P1(TDH3-ADH1)、说明书CN 104404077 A4/9页6P2(PGK1-TEF2)的琼脂糖凝胶电泳结果。0041 图14为实施例6中大肠杆菌PCR扩增4CL、CHS基因的琼脂糖凝胶电泳结果。0042 图15为实施例6中大肠杆菌PCR扩增CHI、FSII基因的琼脂糖凝胶电泳结果。0043 图16为实施例6中大肠杆菌PCR扩增PAL、C4H基因的琼脂糖凝。

22、胶电泳结果。0044 图17为实施例6中扩大培养后p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)的琼脂糖凝胶电泳结果。0045 图18为实施例7中PCR扩增后T1(4CL-CHS)、T2(CHI-FSII)的琼脂糖凝胶电泳结果。0046 图19为实施例7中PCR扩增后T3(PAL-C4H)的琼脂糖凝胶电泳结果。0047 图20为实施例9中重组酿酒酵母W303-1基因组PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳结果。具体实施方式0048 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无。

23、特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。0049 实施例1双向终止子、双向启动子的合成0050 (1)双向终止子的合成0051 合成序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，分别由1180、776、963个碱基组成。其中，第一双向基因表达载体的双向终止子T1(TPI1-PGIt)，如序列表SEQ ID NO:1所示，自5末端第1031位至1180位的核苷酸，与第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，如序列。

24、表SEQ ID NO:2所示，自5末端第1位至150位的核苷酸均为同源臂L2。第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)，如序列表SEQ ID NO:2所示，自5末端第627位至776位的核苷酸,与第三双向基因表达载体的双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)，如序列表SEQ ID NO:4所示，自5末端第1位至150位的核苷酸为均同源臂L3。0052 (2)双向启动子的合成0053 合成序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)、序列表中SEQ ID NO:5所示的双向启动子P2(PGK1-TEF2)，分别由1418、1312个碱基组成。00。

25、54 实施例2构建p-T1(TPI1-PGIt)质粒、p-T2(ADH1t-CYC1t)质粒、p-T3(tFBA1-tPDC1)质粒、PMD-P1(TDH3-ADH1)质粒、PMD-P2(PGK1-TEF2)质粒0055 将双向终止子T1(TPI1-PGIt)、双向终止子T2(ADH1t-CYC1t)、双向终止子T3(tFBA1-tPDC1)分别连接在pUC57-Kan质粒(如图1所示)上，得到重组表达载体p-T1(TPI1-PGIt)(如图2所示)、p-T2(ADH1t-CYC1t)(如图3所示)、p-T3(tFBA1-tPDC1)(如图4所示)。将双向启动子P1(TDH3-ADH1)、双向。

26、启动子P2(PGK1-TEF2)连接到PMD18-T质粒(如图5所示)上得到重组表达载体PMD-P1(TDH3-ADH1)(如图6所示)、PMD-P2(PGK1-TEF2)(如图7所示)。0056 实施例3目的基因的合成0057 合成序列表中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID 说明书CN 104404077 A5/9页7NO:10、SEQ ID NO:11所示的4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，上述基因都来自于菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz。

27、，其优化后具有酿酒酵母偏爱密码子的基因序列，分别由1624、1199、718、1562、2136、2136个碱基组成。0058 实施例4同源臂L1、L4，整合位点Site1、Site2，标记基因HIS片段的构建0059 (1)引物设计：0060 L1-Fo:5-TCCCTCCACCAAAGGTGTTCTTATGTAGCCCCGGTCCGTTTGTTCTAT-30061 L1-Ro:5-CTCGAGAGGCAATTTTAGAGGGGACTTC-30062 L4-Fo:5-CCAGACGATACAGAGGCTAAGA-3；0063 L4-Ro:5-CCACTTTTGTTGGGGACGATTAGGT。

28、TCCAACTGCTCTTACTGT-30064 Site1-Fo:5-GTCGGTCGACTGTGCACAAAGGCCATAATAT-30065 Site1-Ro:5-TCGGAAGAGGTTTTGTCATCCGAAGGCATGAGTTATGGTTGCACA-30066 Site2-Fo:5-TACAGTAAGAGCAGTTGGAACCTAATCGTCCCCAACAAAAGTGGGCT-30067 Site2-Ro:5-AAAGCTGGCTCCCCTTAGACAAATACGCTA-30068 HIS-Fo:5-AACCATAACTCATGCCTTCGGATGACAAAACCTCTTCCGAT。

29、AAAAACA-30069 HIS-Ro:5-TAGAACAAACGGACCGGGGCTACATAAGAACACCTTTGGTGGAGGGA-30070 (2)PCR反应体系：0071 上游引物下游引物模板延伸时间Site1-Fo Site1-Ro酿酒酵母W303基因组30秒Site2-Fo Site2-Ro酿酒酵母W303基因组30秒HIS-Fo HIS-Ro P-YES2 1分15秒L1-Fo L1-Ro p-T1(TPI1-PGIt) 20秒L4-Fo L4-Ro p-T3(tFBA1-tPDC1) 20秒0072 (3)PCR扩增条件：94变性5分钟，之后“94度变性30秒、58退火3。

30、0秒、72延伸1分15秒”34个循环，72延伸10min，4保温。0073 (4)琼脂糖凝胶电泳纯化，胶图结果如图8所示。0074 实施例5重叠片段Site1-His-L1和Site2-L4的构建0075 (1)重叠片段site1-His-L1的构建0076 (a)PCR体系：site1 1ul、His 1ul、L1 1ul、site1-F 2ul、L1-R 2ul、TOP Taq 0.5ul、10Xbuffer 5ul、dNTPs 4ul无菌水补到终体积50ul。(b)PCR反应程序：94变性5分钟，之后“94度变性30秒、58退火30秒、72延伸1分30秒” 34个循环，72延伸10min。

31、，4保温。(c)琼脂糖凝胶电泳纯化，胶图结果如图9所示。0077 (2)重叠片段Site2-L4的构建0078 (a)PCR体系：site2 1ul、L4 1ul、site1-F 2ul、L1-R 2ul、TOP Taq 0.5ul、10Xbuffer 5ul、dNTPs 4ul无菌水补到终体积50ul。(b)PCR反应程序：94变性5分钟，说明书CN 104404077 A6/9页8之后“94度变性30秒、58退火30秒、72延伸50秒”34个循环，72延伸10min，4保温。(c)琼脂糖凝胶电泳纯化，胶图结果如图9所示。0079 实施例6双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-。

32、T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)的构建0080 (1)分别在目的基因4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H上引入BsaI酶切位点：0081 (a)引物设计：0082 CHS-F：5-ACCAGGTCTCAGAATGGCTTCTTCTATCGACATCGCTGC-30083 CHS-R：5-ACCAGGTCTCACGATTTAAGTAGCGATAGCAGTAGTAGTTGGCAAAGAGT-30084 4CL-F：5-ACCAGGTCTCAAGGTTTAAGATGGAACACCAGCAGCCA-30085 4CL-R：5-ACCAGGTCTCAGATGGACTCTC。

33、AAAAGGAAATCATCTTCAGATCT-30086 CHI-F：5-ACCAGGTCTCAAGGTTTACAAACCGTACTTAGAAACGTCAGC-30087 CHI-R：5-ACCAGGTCTCAGATGGCTGCTACTACTACTCCATTGAC-30088 FSII-F：5-ACCAGGTCTCAGAATGAACATGTTGCAAGTTTTCCAATC-30089 FSII-R：5-ACCAGGTCTCACGATTTAAGTAGAACCCAAGATTTGAGAACAG-30090 PAL-F：5-CCGGTCTCAGAATATGGAAAACGGTCACGCTAACGGTG。

34、-30091 PAL-R：5-CCGGTCTCAAGGTTTAACAGATTGGCAATGGAGCACCGTTCCAAC-30092 C4H-F：5-CCGGTCTCAGATGATGGACTTGTTGTTGTTGGAAAAGA-30093 C4H-R：5-CCGGTCTCACGATTTAGAAAGATCTTGGCTTAGCAACGATA-30094 (b)PCR扩增条件：以目的基因4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H为模板，94变性5分钟，之后“94度变性30秒、58退火30秒、72延伸1分15秒”34个循环，72延伸10min，4保温。0095 (c)琼脂糖凝胶电泳纯化目的产物，。

35、结果如图10、11所示。0096 (2)分别在双向终止子基因T1(TPI1-PGIt)、T2(ADH1t-CYC1t)、T3(tFBA1-tPDC1)和双向启动子基因P1(TDH3-ADH1)、P2(PGK1-TEF2)上引入BsaI酶切位点。0097 (a)引物设计：0098 T1-F:5-CAATCGAACAAATCGCTCTTAA-3；0099 T1-R:5-GAATTCGGTCTCAACCTGATTAAT-30100 T2-F:5-AGCTTGGTCTCAATCGTCATGTAATT-30101 T2-R:5-CGAATTCGGTCTCAACCTAGTTATA-30102 T3-F:5。

36、-GGGTCTCAATCGGAATTCGC-30103 T3-R:5-GGGTCTCAACCTAAGCTTGTTAA-30104 P1-F:5-ACCAGGTCTCACATCTTTGTTTGTTTATT-3；0105 P1-R:5-ACCAGGTCTCAATTCTGTATATGAGATAGT-30106 P2-F:5-ACCAGGTCTCACATCGTTTTATATTTGTT-30107 P2-R:5-ACCAGGTCTCAATTCGGTACTAGTGTTTAG-30108 (b)PCR扩增条件：以双向终止子基因T1(TPI1-PGIt)、T2(ADH1t-CYC1t)、T3(tFBA1-tP。

37、DC1)和双向启动子基因P1(TDH3-ADH1)、P2(PGK1-TEF2)分别1ul为模板，94变性5分钟，之后“94度变性30秒、58退火30秒、72延伸2分30秒” 34个循环，72延伸10min，4保温。说明书CN 104404077 A7/9页90109 (c)琼脂糖凝胶电泳纯化目的产物，结果如图12、13所示。0110 (3)循环酶切连接体系0111 (a)以T1、P1、4CL、CHS为一组，T2、P2、CHI、FSII为一组，T3、P1、PAL、C4H为一组按照如下体系配比添加。0112 T1/T2/T3(载体骨架) (200ng)P1/P2与载体骨架等摩尔的量4CL/CH。

38、I/PAL与载体骨架等摩尔的量CHS/FSII/C4H与载体骨架等摩尔的量10XNEB T4buffer(NEB) 1.5ul100XBSA*(NEB) 0.15ulBsaI(NEB) 1ulNEB T4Ligase(NEB) 1ulddH2O补足到15ul0113 Total 15ul0114 (b)循环程序：373分钟165分钟，这两个温度做3050个循环酶切连接、505分钟终酶切、805分钟灭活。0115 (4)将酶切连接体系转化大肠杆菌DH5，采用卡那霉素抗性的LB平板(1胰化蛋白胨、0.5酵母提取物、1氯化钠、1.5琼脂粉、100ug/ml的卡那霉素)进行阳性克隆筛选，37过夜培养。。

39、0116 (5)单克隆PCR验证0117 (a)挑取单菌落在1ml卡那霉素抗性的LB液体培养基(1胰化蛋白胨、0.5酵母提取物、1氯化钠、100ug/ml的卡那霉素)中摇培2小时(220rpm/min)，取0.5ul菌液做模板PCR。0118 (b)PCR体系：0119 上游引物下游引物模板延伸时间CHS-F CHS-R CHS 1分15秒4CL-F 4CL-R 4CL 1分15秒说明书CN 104404077 A8/9页10CHI-F CHI-R CHI 1分15秒FSII-F FSII-R FSII 1分15秒PAL-F PAL-R PAL 1分15秒C4H-F CH4-R C4H 1。

40、分15秒0120 (c)PCR扩增条件：聚合酶为Easy Taq聚合酶，94变性5分钟，之后“94度变性30秒、58退火30秒、72延伸1分15秒”34个循环，72延伸10min，4保温。0121 (d)PCR结束琼脂糖凝胶电泳验证，如图14、15、16所示。0122 (6)提取质粒酶切验证0123 (a)扩大培养：将正确条带对应的菌液200ul加入5ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中摇培1216小时(220rpm/min)，扩大培养。0124 (b)用质粒提取试剂盒对扩大摇培获得的菌液提取质粒。0125 (c)酶切验证0126 酶切体系：质粒3ul，cutsmart(酶切buffer)2ul。

41、，BsmBI 1ul，无菌水补足到20ul，37酶切2小时。琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图17所示。0127 实施例7双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)的扩增0128 (1)以酶切验证正确的质粒为模板在同源臂L1-L4两端设计合适的引物0129 L1-F:5-CCCCGGTCCGTTTGTTCTAT-3；L2-R:5-GCGAGTTGGATAGCCCGAGC-30130 L2-F:5-TCTGGACGATTGGGCGACTT-3；L3-R:5-ACTTAGTCCGTTTCTCGGCTAT-30131 L3-F:5-TAGACGCC。

42、AACTACGCTGAC-3；L4-R:5-AGGTTCCAACTGCTCTTACTGT-30132 (2)PCR扩增条件：以双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)分别模板，94变性5分钟，之后“94度变性30秒、58退火30秒、72延伸2分30秒”34个循环，72延伸10min，4保温。0133 (3)琼脂糖凝胶电泳纯化目的产物，结果如图18、19所示。0134 实施例8双向基因表达载体p-T1(4CL-CHS)、p-T2(CHI-FSII)、p-T3(PAL-C4H)的转化0135 (1)活化W303酿酒酵母，从W303平板上挑。

43、取单菌落在YPAD培养基(1酵母提取物、2蛋白胨、2葡萄糖、50mg腺嘌呤)中过夜摇培12h。0136 (2)用分光光度计测培养菌液的OD600。0137 (3)以初始OD600值为0.2OD转接到50ml的新鲜YPAD培养基中。0138 (4)活化4-5小时让酵母增值两代，此时菌液OD600值在0.8-0.9。0139 (5)3000g5min收集菌体，25mlddH2O洗两次。0140 (6)1ml水重悬到无菌1.5ml离心管中。0141 (7)13000rpm离心30s收集菌体。0142 (8)1ml水重悬分装每管100ul用于转化，将分装的菌液在掌上离心机上离心20s弃上清加转化体系。说明书CN 104404077 A10。

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