一种基于LAMP方法快速检测肉类掺假的试剂盒.pdf

本发明公开了一种基于LAMP方法快速检测肉类掺假的试剂盒。试剂盒中含有精心设计的多种肉类引物，可以特异性的扩增出相应的产物，进而便于快速检测。与传统的PCR相比，本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高：能检测出最低限度分别是：猪肉10-4ng、狐狸肉10-4ng、老鼠肉10->ng、鸡肉10-3ng、鸭肉10-5ng；在1h内就可以完成检测，快速省时；操作简单，且对操作人员的要求较低；易于检测：最终反应结果只需用肉眼进行观测即可鉴定，阳性结果为绿色，阴性结果为橙色，而不需要使用凝胶电泳，避免了使用溴化乙锭等有毒药品，避免了安全隐患；本发明的试剂盒，可以一次性检测多种肉类，大大提高了检测效率。

权利要求书
1.  一种用于肉类检测的LAMP试剂盒，包括反应缓冲液、DNA聚合酶和特异性引物，其特征在于：特异性引物序列如下：
猪肉检测特异性序列：
P-F3：5’-CCTCACCCTAGTAGAACGAA-3’
P-B3：5’-GCTTGACATGGCTAGCAT-3’
P-FIP：5’-GGTGAATAGTTTTAGGGCATCGGCTTTTACTACGAAAAGGACCCAACG-3’
P-BIP：5’-TTGCACCAATCCTAGCCTTATCCCTTTTGGGTAGGGTATTGGTAGTGGA-3’
狐狸肉检测特异性序列：
F-F3：5’-TCTGAGGGGCAACCGTAAT-3’
F-B3：5’-GTCGGATGTGATTCCTGAAGG-3’
F-FIP：5’-CTTTGTCTACTGAGAAGCCCCCTCA-CTGCTATCCCCTATATCGGAACC-3’
F-BIP：5’-CCATTCATCATCGCAGCATTAGCG-GTTGTTGGATCCTGTTTCGTGG-3’
老鼠肉检测特异性序列：
M-F3: 5’-CTCTATTTCTACCATCCTCCG-3’
M-B3: 5’-GATTAGACCCGTTACCATCG-3’
M-FIP: 5’-TTCAGTATAGTCACCCCCAGGACTTTTTGAAATCAACAACCCGCC-3’
M-BIP: 5’-ACCAGGCATCTGGTTCTTACTTTTTAAGGGGAACGTATGGACG-3’
鸡肉检测特异性序列：
C-F3: 5’-CTCACGAGAGATCAGCAACC-3’
C-B3: 5’-GAAGAGAGAAGATGCCGCG-3’
C-FIP: 5’-GTACGGTGGAAGGCAAGTAGGGTTTTGTACTTCATGACCAGTCTCAGG-3’
C-BIP: 5’-GGCACATCCCATGCATAACTCCTTTTTATCACGGACTAAAGAGGGGA-3’
鸭肉检测特异性序列：
D-F3: 5’-GATTCTACTTCACCGCCCTA-3’
D-B3: 5’-AATCCGAAGTGGTGGTCTG-3’
D-FIP: 5’-CCGGTGGCAACAAAGAAAGTGGTTTTTAGAGTACCATGAAGCCCCA-3’
D-BIP: 5’-CCACGGACTCCACGTGATCATCTTTTTTGATTAGTCGGAGGAGGCA-3’。

2.  根据权利要求1所述的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有DNA提取液。

3.  根据权利要求1或2所述的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于肉类检测的反应体系为：1×ThermoPol 反应缓冲液，MgSO4，dNTPs，Betaine，Calcein, MnCl2， Bst DNA聚合酶，外引物，内引物，模板DNA和灭菌ddH2O。

4.  根据权利要求3所述的用于肉类检测的反应体系为，其特征在于：反应体系中各组分的浓度为MgSO41-10 mM， dNTPs0.1-5 mM， Betain0.1-1 M， Calcein 10-50 μM, MnCl20.1-5 mM，1-40U Bst DNA聚合酶，0.1-2 μl外引物，1-10 μl内引物、0.1-5μl模板DNA，补足灭菌ddH2O至25μl；引物的浓度为1-20 μmol/L，模板DNA的浓度为10-100ng/μl。

说明书一种基于LAMP方法快速检测肉类掺假的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种分子检测方法，特别涉及一种基于LAMP方法快速检测肉类掺假的试剂盒。
背景技术
肉类及其制品是人类日常生活消费的主要食品之一。由于价格，宗教，健康等原因，许多国家要求肉类及其制品类的食品标签必须真实明确地标出肉类来源，禁止掺假行为，以保护消费者的利益。
近年来，我国的肉制品消费量也一直呈攀升状况，但食品安全却一直困扰着消费者，令国人震惊的三聚氰胺、瘦肉精、假牛肉事件等问题层出不穷。更加严重的是，2013年市面上出现了利用来源不明的狐狸肉、老鼠肉、水貂肉冒充羊肉的恶性事件，引起了社会各界的广泛关注。而部分不法商贩也在羊肉、羊肉卷、羊肉串中掺入猪肉、鸡肉、鸭肉等价格较低廉，侵犯消费者合法权益。因为掺假肉制产品已经严重损害了消费者权益，甚至危及消费者的生命健康，因此急需一种操作简便，成本低廉，快速灵敏的检测方法。
传统的依靠感官和经验的肉类形态学鉴别手段已经不能满足市场对肉制品掺假现象进行控制与监管的需要。目前对肉类产品的鉴定方法主要在蛋白质和核酸水平进行。在蛋白质水平，常用ELISA、液相色谱、高效液相色谱等技术进行检测，共同的局限性在于对仪器、试剂和样品处理要求高，且检测加工样品时特异性和准确性较差，费时费力。相对来说，用检验核酸的方式更方便准确。在核酸水平，常用的核算水平检测技术有PCR与实时PCR。PCR技术是目前最常用的检测肉源性成分的方法，因为其反应时间短，具有较高的灵敏度、特异性和可操作性，但因为其后期检测需要使用凝胶电泳，而凝胶电泳中的EB具有强致癌性，具有一定的安全隐患；而相比与传统PCR，实时PCR具有更高的特异性和灵敏度，但其需要昂贵的实时机器，且对操作人员有较高要求，难以在基层得以推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肉类检测的试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于肉类检测的LAMP试剂盒，包括反应缓冲液、DNA聚合酶和特异性引物，其特征在于：特异性引物序列如下：
猪肉检测特异性序列：
P-F3：5’-CCTCACCCTAGTAGAACGAA-3’（SEQ ID NO：1）
P-B3：5’-GCTTGACATGGCTAGCAT-3’（SEQ ID NO：2）
P-FIP：5’-GGTGAATAGTTTTAGGGCATCGGCTTTTACTACGAAAAGGACCCAACG-3’（SEQ ID NO：3）
P-BIP：5’-TTGCACCAATCCTAGCCTTATCCCTTTTGGGTAGGGTATTGGTAGTGGA-3’（SEQ ID NO：4）
狐狸肉检测特异性序列：
F-F3：5’-TCTGAGGGGCAACCGTAAT-3’（SEQ ID NO：5）
F-B3：5’-GTCGGATGTGATTCCTGAAGG-3’（SEQ ID NO：6）
F-FIP：5’-CTTTGTCTACTGAGAAGCCCCCTCA-CTGCTATCCCCTATATCGGAACC-3’（SEQ ID NO：7）
F-BIP：5’-CCATTCATCATCGCAGCATTAGCG-GTTGTTGGATCCTGTTTCGTGG-3’（SEQ ID NO：8）
老鼠肉检测特异性序列：
M-F3: 5’-CTCTATTTCTACCATCCTCCG-3’（SEQ ID NO：9）
M-B3: 5’-GATTAGACCCGTTACCATCG-3’（SEQ ID NO：10）
M-FIP: 5’-TTCAGTATAGTCACCCCCAGGACTTTTTGAAATCAACAACCCGCC-3’（SEQ ID NO：11）
M-BIP: 5’-ACCAGGCATCTGGTTCTTACTTTTTAAGGGGAACGTATGGACG-3’（SEQ ID NO：12）
鸡肉检测特异性序列：
C-F3: 5’-CTCACGAGAGATCAGCAACC-3’（SEQ ID NO：13）
C-B3: 5’-GAAGAGAGAAGATGCCGCG-3’（SEQ ID NO：14）
C-FIP: 5’-GTACGGTGGAAGGCAAGTAGGGTTTTGTACTTCATGACCAGTCTCAGG-3’（SEQ ID NO：15）
C-BIP: 5’-GGCACATCCCATGCATAACTCCTTTTTATCACGGACTAAAGAGGGGA-3’（SEQ ID NO：16）
鸭肉检测特异性序列：
D-F3: 5’-GATTCTACTTCACCGCCCTA-3’（SEQ ID NO：17）
D-B3: 5’-AATCCGAAGTGGTGGTCTG-3’（SEQ ID NO：18）
D-FIP: 5’-CCGGTGGCAACAAAGAAAGTGGTTTTTAGAGTACCATGAAGCCCCA-3’（SEQ ID NO：19）
D-BIP: 5’-CCACGGACTCCACGTGATCATCTTTTTTGATTAGTCGGAGGAGGCA-3’（SEQ ID NO：20）。
作为本发明的进一步改进，上述试剂盒还含有DNA提取液。
    作为本发明的进一步改进，上述试剂盒用于肉类检测的反应体系为：1×ThermoPol 反应缓冲液，MgSO4，dNTPs，Betaine，Calcein, MnCl2， Bst DNA聚合酶，外引物，内引物，模板DNA和灭菌ddH2O。
    作为本发明的进一步改进，上述试剂盒用于肉类检测的反应体系中各组分的浓度为MgSO41-10 mM， dNTPs0.1-5 mM， Betain0.1-1 M， Calcein 10-50 μM, MnCl20.1-5 mM，1-40U Bst DNA聚合酶，0.1-2 μl外引物，1-10 μl内引物、0.1-5μl模板DNA，补足灭菌ddH2O至25μl；引物的浓度为1-20 μmol/L，模板DNA的浓度为10-100ng/μl。
特别的，上述试剂盒的特异性引物在同一个反应体系中进行反应，该反应体系为：1×ThermoPol 反应缓冲液， MgSO4 7 mM， dNTPs 2.0 mM， Betaine 0.4 M， Calcein 25 μM, MnCl2 0.5 mM，8U Bst DNA聚合酶，10 μmol/L的外引物F3、B3各 0.5 μl，10 μmol/L的内引物FIP、BIP各4 μl和模板DNA 1 μl，补足灭菌ddH2O至25μl；引物的浓度为10 μmol/L，模板DNA的浓度为50 ng/μl。
本发明的有益效果是：
本发明的试剂盒所使用的LAMP特异性引物能够快速、特异、灵敏地检测出猪肉、狐狸肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉成分，与传统的PCR相比，本发明试剂盒具有以下优点：
1)      特异性强：本发明所使用的引物，是根据对应物种线粒体特异性序列所设计的4条引物，能够特异性识别6个位点，特异性超过了传统PCR，具有很强特异性；
2)      灵敏度高：本发明试剂盒，能检测出最低限度分别是：猪肉10-4ng、狐狸肉10-4ng、老鼠肉10-5ng、鸡肉10-3ng、鸭肉 10-5ng；
3)      快速省时：在1 h内就可以完成检测，相比于传统PCR至少需要2 h以上，节约了检测时间；
4)      操作简单：只需要利用水浴锅进行恒温反应，而不需要昂贵的PCR仪，且对操作人员的要求较低；
5)      易于检测：最终反应结果只需用肉眼进行观测即可鉴定，阳性结果为绿色，阴性结果为橙色，而不需要使用凝胶电泳，避免了使用溴化乙锭等有毒药品，避免了安全隐患
6)      本发明的试剂盒，可以一次性检测多种肉类，大大提高了检测效率。
附图说明
图1为肉眼检测猪肉LAMP特异性反应扩增结果
图中1-10号模板分别为：1.猪肉；2.牛肉；3.羊肉；4.狐狸肉；5.兔肉；6.老鼠肉；7.鸡肉；8.鸭肉；9.鲤鱼肉；10.水
图2为肉眼检测狐狸肉LAMP特异性反应扩增结果
图中1-10号模板分别为：1.猪肉；2.牛肉；3.羊肉；4.狐狸肉；5.兔肉；6.老鼠肉；7.鸡肉；8.鸭肉；9.鲤鱼肉；10.水
图3为肉眼检测老鼠肉LAMP特异性反应扩增结果
图中1-10号模板分别为：1.猪肉；2.牛肉；3.羊肉；4.狐狸肉；5.兔肉；6.老鼠肉；7.鸡肉；8.鸭肉；9.鲤鱼肉；10.水
图4为肉眼检测鸡肉LAMP特异性反应扩增结果
图中1-10号模板分别为：1.猪肉；2.牛肉；3.羊肉；4.狐狸肉；5.兔肉；6.老鼠肉；7.鸡肉；8.鸭肉；9.鲤鱼肉；10.水
图5为肉眼检测鸭肉LAMP特异性反应扩增结果
图中1-10号模板分别为：1.猪肉；2.牛肉；3.羊肉；4.狐狸肉；5.兔肉；6.老鼠肉；7.鸡肉；8.鸭肉；9.鲤鱼肉；10.水
图6为肉眼同时检测多种肉类LAMP特异性反应扩增结果
图中1-10号模板分别为：.猪肉；2.牛肉；3.羊肉；4.狐狸肉；5.兔肉；6.老鼠肉；7.鸡肉；8.鸭肉；9.鲤鱼肉；10.水
图7为肉眼检测猪肉LAMP灵敏度反应扩增结果
图中1-10号模板浓度分别为：1. 50 ng；2. 5 ng；3. 500 pg；4. 50 pg；5. 5 pg；6. 500 fg；7. 50 fg；8. 5 fg；9. 500 ag；10.水
图8为肉眼检测狐狸肉LAMP灵敏度反应扩增结果
图中1-10号模板浓度分别为：1. 50 ng；2. 5 ng；3. 500 pg；4. 50 pg；5. 5 pg；6. 500 fg；7. 50 fg；8. 5 fg；9. 500 ag；10.水
图9为肉眼检测老鼠肉LAMP灵敏度反应扩增结果
图中1-10号模板浓度分别为：1. 50 ng；2. 5 ng；3. 500 pg；4. 50 pg；5. 5 pg；6. 500 fg；7. 50 fg；8. 5 fg；9. 500 ag；10.水
图10为肉眼检测鸡肉LAMP灵敏度反应扩增结果
图中1-10号模板浓度分别为：1. 50 ng；2. 5 ng；3. 500 pg；4. 50 pg；5. 5 pg；6. 500 fg；7. 50 fg；8. 5 fg；9. 500 ag；10.水
图11为肉眼检测鸭肉LAMP灵敏度反应扩增结果
图中1-10号模板浓度分别为：1. 50 ng；2. 5 ng；3. 500 pg；4. 50 pg；5. 5 pg；6. 500 fg；7. 50 fg；8. 5 fg；9. 500 ag；10.水。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
如无特别说明，文件中的所有专业术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
（1）LAMP反应试剂及耗材：
甜菜碱(Betaine)购自Sigma公司；
Bst DNA大片段聚合酶（Bst DNA polymerase large fragment）、10×ThermoPol 反应缓冲液购自New England Biolabs公司；
三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）购自碧云天生物技术研究所；
钙黄绿素（Calcein）购自Dojindo公司；
硫酸镁（MgSO4）、氯化锰（MnCl2）购自北京化工厂；
loopamp反应试管购自日本荣研公司。
（2）LAMP引物（正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP），南京金斯瑞生物科技有限公司。
（3）所有肉类产品样本均由吉林大学动物科学学院提供。
合成的得到的LAMP引物用灭菌二次蒸馏水分别稀释至10 μmol/L，置于-20℃冻存备用。
全基因组提取：利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，TIANGEN）提取各动物物种肌肉组织基因组，测定基因组浓度，随后稀释至50 ng/μl，置于-20℃冻存备用。
 
LAMP可视化方法检验引物特异性
（1）可视化检验猪肉引物特异性：
按猪肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 7 mM； dNTPs 2.0 mM； Betaine 0.2 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物P-F3、P-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物P-FIP、P-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，分别使用实施例2中所述方法提取的猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉基因组DNA以及灭菌二次蒸馏水作为模板。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图1中1-10号分别表示模板为猪肉、牛肉、羊肉、狐狸肉、兔肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、鲤鱼肉和水。结果表示，仅有猪肉作为模板的离心管反应液由橙色变为绿色，结果为阳性；而牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉及水为模板的反应管反应液任为橙色，结果为阴性。因此，确定使用LAMP可视化方法可以特异性检出猪肉成分。
 
（2）可视化检验狐狸肉引物特异性：
按狐狸肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 6 mM； dNTPs 1.6 mM； Betaine 0.4 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物F-F3、F-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物F-FIP、F-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，分别使用实施例2中所述方法提取的猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉基因组DNA以及灭菌二次蒸馏水作为模板。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图2中1-10号分别表示模板为猪肉、牛肉、羊肉、狐狸肉、兔肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、鲤鱼肉和水。结果表示，仅有狐狸肉作为模板的离心管反应液由橙色变为绿色，结果为阳性；而猪肉，牛肉，羊肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉及水为模板的反应管反应液任为橙色，结果为阴性。因此，确定使用LAMP可视化方法可以特异性检出狐狸肉成分。
 
（3）可视化检验老鼠肉引物特异性：
按老鼠肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 7 mM； dNTPs 1.2 mM； Betaine 0.4 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物M-F3、M-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物M-FIP、M-BIP各4 μl和模板DNA 1μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，分别使用实施例2中所述方法提取的猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉基因组DNA以及灭菌二次蒸馏水作为模板。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图3中1-10号分别表示模板为猪肉、牛肉、羊肉、狐狸肉、兔肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、鲤鱼肉和水。结果表示，仅有老鼠肉作为模板的离心管反应液由橙色变为绿色，结果为阳性；而猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉及水为模板的反应管反应液任为橙色，结果为阴性。因此，确定使用LAMP可视化方法可以特异性检出老鼠肉成分。
 
（4）可视化检验鸡肉引物特异性：
按鸡肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 8 mM； dNTPs 2.0 mM； Betaine 0.2 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物C-F3、C-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物C-FIP、C-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，分别使用实施例2中所述方法提取的猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉基因组DNA以及灭菌二次蒸馏水作为模板。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应90 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图4中1-10号分别表示模板为猪肉、牛肉、羊肉、狐狸肉、兔肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、鲤鱼肉和水。结果表示，仅有鸡肉作为模板的离心管反应液由橙色变为绿色，结果为阳性；而猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸭肉，鲤鱼肉及水为模板的反应管反应液任为橙色，结果为阴性。因此，确定使用LAMP可视化方法可以特异性检出鸡肉成分。
 
（5）可视化检验鸭肉引物特异性：
按鸭肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 7 mM； dNTPs 2.0 mM； Betaine 0.4 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物D-F3、D-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物D-FIP、D-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，分别使用实施例2中所述方法提取的猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉基因组DNA以及灭菌二次蒸馏水作为模板。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图5中1-10号分别表示模板为猪肉、牛肉、羊肉、狐狸肉、兔肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、鲤鱼肉和水。结果表示，仅有鸭肉作为模板的离心管反应液由橙色变为绿色，结果为阳性；而猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鲤鱼肉及水为模板的反应管反应液任为橙色，结果为阴性。因此，确定使用LAMP可视化方法可以特异性检出鸭肉成分。
 
（6）可视化同时检验猪、狐狸、老鼠、鸡、鸭肉引物特异性：
按多种肉类同时检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液， MgSO4 7 mM， dNTPs 2.0 mM， Betaine 0.4 M， Calcein 25 μM, MnCl2 0.5 mM，8U Bst DNA聚合酶，引物预混液 9 μl(其中包含P-F3, P-B3, F-F3, F-B3, M-F3, M-B3, C-F3, C-B3, D-F3, D-B3 各 5 pmol; P-FIP, P-BIP, F-FIP, F-BIP, M-FIP, M-BIP, C-FIP, C-BIP, D-FIP, D-BIP 各 40 pmol)（引物的配法为将5种引物按五分之一的比例加进去，但因为移液器最小量程不满足，所以可以上述5种引物F3，B3各取0.5 μl，FIP、BIP各4 μl，充分混匀后取9 μl使用，此处稀释引物的浓度为50 μmol/L），和模板DNA 2.5μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，分别使用实施例2中所述方法提取的猪肉，牛肉，羊肉，狐狸肉，兔肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉，鲤鱼肉基因组DNA以及灭菌二次蒸馏水作为模板。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图6中1-10号分别表示模板为猪肉、牛肉、羊肉、狐狸肉、兔肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、鲤鱼肉和水。结果表示，猪肉，狐狸肉，老鼠肉，鸡肉，鸭肉作为模板的离心管反应液由橙色变为绿色，结果为阳性；而牛肉，羊肉，兔肉，鲤鱼肉及水为模板的反应管反应液任为橙色，结果为阴性。因此，确定使用LAMP可视化方法同时检测多种肉源性成分。
 
LAMP可视化方法检验引物灵敏度
（1）可视化检验猪肉引物灵敏度：
按猪肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 7 mM； dNTPs 2.0 mM； Betaine 0.2 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物P-F3、P-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物P-FIP、P-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，使用实施例2中所述方法提取的猪肉基因组做10倍梯度稀释至10-8ng作为模板，以灭菌二馏水作为阴性对照。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果。
图7中1-9号分别表示猪肉模板浓度为50 ng、5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg、5 fg、500 ag，10号模板为二馏水。结果表示，猪肉引物所能检测出的极限为500 fg。
 
（2）可视化检验狐狸肉引物灵敏度：
按狐狸肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 6 mM； dNTPs 1.6 mM； Betaine 0.4 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物F-F3、F-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物F-FIP、F-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，使用实施例2中所述方法提取的狐狸肉基因组做10倍梯度稀释至10-8ng作为模板，以灭菌二馏水作为阴性对照。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图8中1-9号分别表示狐狸肉模板浓度为50 ng、5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg、5 fg、500 ag，10号模板为二馏水。结果表示，狐狸肉引物所能检测出的极限为500 fg。
 
（3）可视化检验老鼠肉引物灵敏度：
按老鼠肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 7 mM； dNTPs 1.2 mM； Betaine 0.4 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物M-F3、M-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物M-FIP、M-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，使用实施例2中所述方法提取的老鼠肉基因组做10倍梯度稀释至10-8ng作为模板，以灭菌二馏水作为阴性对照。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图9中1-9号分别表示老鼠肉模板浓度为50 ng、5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg、5 fg、500 ag，10号模板为二馏水。结果表示，老鼠肉引物所能检测出的极限为50 fg。
 
（4）可视化检验鸡肉引物灵敏度：
按鸡肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 8 mM； dNTPs 2.0 mM； Betaine 0.2 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物C-F3、C-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物C-FIP、C-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，使用实施例2中所述方法提取的鸡肉基因组做10倍梯度稀释至10-8ng作为模板，以灭菌二馏水作为阴性对照。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应90 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图10中1-9号分别表示鸡肉模板浓度为50 ng、5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg、5 fg、500 ag，10号模板为二馏水。结果表示，鸡肉引物所能检测出的极限为5 pg。
 
（5）可视化检验鸭肉引物灵敏度：
按鸭肉检测反应体系为25μl，包括：1×ThermoPol 反应缓冲液； MgSO4 7 mM； dNTPs 2.0 mM； Betaine 0.4 M；Calcein 25 μM； MnCl2 0.5 mM； 8U Bst DNA聚合酶；10 μmol/L的外引物D-F3、D-B3各 0.5 μl；10 μmol/L的内引物D-FIP、D-BIP各4 μl和模板DNA 1 μl；补足灭菌ddH2O至25μl加入200 μl离心管中，使用实施例2中所述方法提取的鸭肉基因组做10倍梯度稀释至10-8ng作为模板，以灭菌二馏水作为阴性对照。将混合离心后的离心管置于恒温水浴锅中反应60 min，然后再置于80℃水浴锅灭活5 min，通过肉眼观测颜色变化判断实验结果
图11中1-9号分别表示鸭肉模板浓度为50 ng、5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg、5 fg、500 ag，10号模板为二馏水。结果表示，鸭肉引物所能检测出的极限为50 fg。
<110>  广州绿洲生化科技股份有限公司
 
<120>  一种基于LAMP方法快速检测肉类掺假的试剂盒
 
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<170>  PatentIn version 3.5
 
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