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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410749427.1(22)申请日 2014.12.09CCTCC NO: M 2012432 2012.11.03C12N 15/53(2006.01)C12N 9/02(2006.01)C12N 15/11(2006.01)(71)申请人江南大学地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号(72)发明人饶志明 郭静 杨套伟 徐美娟张显 满在伟(54) 发明名称一种来源于Streptomyces kathirae SC-1的酪氨酸酶编码基因melC及其蛋白(57) 摘要本发明涉及一株链霉菌Streptomyces k。
2、athirae SC-1酪氨酸酶的编码基因melC及其蛋白。Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的一株高产黑色素菌株，目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2012432。本发明过程最终克隆获得1899bp，该序列包括553 bp开放阅读框上游序列、酪氨酸酶操纵子melC(包括两个编码基因melC1及melC2)，melC1基因产物为酪氨酸酶金属伴侣，其功能为激活酪氨酸酶原，运输铜离子至酪氨酸酶，帮助酪氨酸酶至细胞外。与国内外已报道酪氨酸酶编码基因进行对比，发现其与已报道的最高相似度仅为75，其编码的氨基酸序列与已报道的最高相。
3、似度仅为83，说明Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶编码基因是一种新型酪氨酸酶。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书5页序列表2页(10)申请公布号 CN 104404064 A(43)申请公布日 2015.03.11CN 104404064 A1/2页21.一种Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶的编码基因melC及其蛋白，Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的一株高产黑色素菌株，目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保。
4、藏编号为：CCTCC M 2012432。2.权利要求1所述的链霉菌菌株所产酪氨酸酶的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将Streptomyces kathirae SC-1接种于培养基中培养36h，8000g离心收集发酵液去菌丝体；(2)在冰浴的条件下，向发酵液中添加硫酸铵至其饱和度为65沉淀酪氨酸酶蛋白，继续搅拌发酵液20分钟后12000g离心1h后小心弃其上清，收集蛋白沉淀，使用Buffer A重悬酶蛋白；(3)步骤(2)的酶蛋白溶液经透析得到蛋白样品溶液，过Q Sephrose FF离子交换层析柱，先用Buffer A洗脱至无蛋白流出，在用洗脱液Buffer B梯度洗脱，获。
5、得高纯度酪氨酸酶蛋白；其中所述Buffer A含有pH8.00.05M Tris-HCl缓冲液；所述Buffer B含有pH8.00.05MTris-HCl、1MNaCl缓冲液。3.权利要求2所述的酪氨酸酶分离纯化方法获得纯酪氨酸酶部分基因片段扩增引物：TCCCCCTCGTTCCTGCCCTGGCACCG及GGTGCCGCCGAGGAAGTCGGGCGCCC进行PCR扩增获得部分酪氨酸酶基因片段；扩增条件为：94预变性5min；95变性45s,69退火30s,72延伸30s,反应25个循环，4保存。4.利用权利要求3所获得的酪氨酸酶基因片段，使用TAIL-PCR获得新的酪氨酸酶全基因，其特征是。
6、包括553bp开放阅读框上游序列、酪氨酸酶操纵子melC(包括两个编码基因melC1及melC2)，melC1大小为375bp，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码124个氨基酸，蛋白大小为12.9kDa，在32-33处含有信号肽切割位点Ala-Ala，melC2基因产物为酪氨酸酶，melC2大小为822bp，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码273个氨基酸，蛋白大小为30.8kDa，获得的新的酪氨酸酶基因序列与已报道的酪氨酸酶基因序列相似性最高为75。5.权利要求4所述的酪氨酸酶基因，其特征在于，将酪氨酸酶编码基因的功能验证表达质粒pIJ86-C2及pIJ86-melC1-。
7、C2通过引物设计melC1F、melC2F及melCR以Streptomyces kathirae SC-1基因组为模板，PCR扩增目的基因。6.权力要求5所述的引物序列及用途，其特征在于，引物melC1F：CTAAAGCTTATGCCGGAACTCACCCGCCG及melCR：CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC用于扩增melC1-C2串联基因片段；引物melC2F：CTAAAGCTTATGACCGTACGCAAGAACCAG及melCR：CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC用于扩增melC2基因片段。7.如权利要求5所述的酪氨酸酶基因PC。
8、R扩增条件，其特征在于，95预变性5min；97变性45s,69退火30s,72延伸1.5min，反应25个循环。8.如权利要求5所述的酪氨酸酶基因编码的蛋白，其特征在于，melC1基因产物为酪氨酸酶金属伴侣，其功能为激活酪氨酸酶原，帮助酪氨酸酶至细胞外；melC2基因产物为酪氨酸酶，获得的新的酪氨酸酶氨基酸序列与已报道的酪氨酸酶氨基酸序列相似性最高为权 利 要 求 书CN 104404064 A2/2页383。权 利 要 求 书CN 104404064 A1/5页4一 种 来 源 于 Streptomyces kathirae SC-1的 酪 氨 酸 酶 编 码基因 melC 及其蛋白技术领。
9、域0001 本发明涉及从Streptomyces kathirae SC-1中克隆该酪氨酸酶编码基因，属于基因工程技术领域。技术背景0002 随着有关人造黑色素的致癌、致病的报道不断增多，人们日益关注人造色素对人体造成的危害。人们对色素的生物安全性的关注度越来越高。天然的黑色素是非均质多酚类聚合体，以酪氨酸为底物，由酪氨酸酶催化后生成L-多巴、多巴铬等，而后经过一系列非酶催化的氧化反应最终生成黑色素。黑色素广泛存在于动植物和微生物中，与生物自我保护机制有关。有研究表明，天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合阳离子(例如有毒的重金属)、新型的药物载体、作为治疗某些与黑色素缺乏相关的神。
10、经系统疾病，例如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等，有报道指出，可溶性的黑色素在体外具有抗HIV的活性，为治疗艾滋病开辟了一个新途径。目前黑色素生产主要为动植物提取和采用化学法以酪氨酸为原料生产，这两种方法成本高、工艺繁琐，使黑色素因价格昂贵而限制其大规模的生产与应用。微生物所产的黑色素是由其体内的酪氨酸酶催化酪氨酸形成的多巴类黑色素，是氨基酸的衍生物，具有无毒、无害等特点，而且产黑色素的微生物种类繁多，生产工艺简单，易于操作，不受时间与地域的限制，因此用微生物来生产黑色素具有巨大的优势。0003 Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的。
11、一株高产黑色素菌株，目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2012432，与国内外已报道产黑色素链霉菌16Sr RNA进行对比，发现其最高相似度仅为95.37，说明Streptomyces kathirae SC-1是一株新型产黑色素链霉菌，对产黑色素关键酶酪氨酸酶进行分离纯化获得电泳纯酪氨酸酶，并且通过基因工程手段获得该酪氨酸酶编码基因，与国内外已报道酪氨酸酶编码基因进行对比，发现其最高相似度仅为75，说明Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶编码基因是一种新型酪氨酸酶，使用变铅青链霉菌验证克隆获得基因的功能，拓展了微生物生产黑色素资源。发。
12、明内容0004 本发明公开了一个新的酪氨酸酶及其基因，该酪氨酸酶基因序列与国内外已报道的最高相似度仅为75，其编码氨基酸序列与国内外已报道的最高相似度仅为83。0005 本发明的技术方案：0006 (1)将Streptomyces kathirae SC-1接种于培养基中培养36h，8000g离心收集发酵液去菌丝体。0007 (2)在冰浴的条件下，向发酵液中添加硫酸铵至其饱和度为65沉淀酪氨酸酶蛋白，继续搅拌发酵液20分钟后12000g离心1h后小心弃其上清，收集蛋白沉淀，使用Buffer 说 明 书CN 104404064 A2/5页5A重悬酶蛋白。0008 (3)步骤(2)的酶蛋白溶液经透。
13、析得到蛋白样品溶液，过Q Sephrose FF离子交换层析柱，先用Buffer A洗脱至无蛋白流出，在用洗脱液Buffer B梯度洗脱，获得高纯度酪氨酸酶。0009 (4)使用MS鉴定并测定纯化酪氨酸酶部分氨基酸序列，根据MS获得的氨基酸序列设计引物，克隆了部分酪氨酸酶编码基因，其主要特点是：0010 上游引物其基因型为：TCCCCCTCGTTCCTGCCCTGGCACCG；0011 下游引物其基因型为：GGTGCCGCCGAGGAAGTCGGGCGCCC；0012 酪氨酸酶编码基因的PCR扩增条件为：94预变性5min；95变性45s,69退火30s,72延伸30s,反应25个循环；001。
14、3 将PCR扩增之后的产物经过载体连接并送至上海生物工程有限公司测序。0014 (5)步骤(4)获得的部分基因序列，设计引物，应用TAIL-PCR扩增已知基因片段两端序列，其主要特点是：0015 使用SP1-6结合AD引物扩增已知基因片段3端基因序列，使用SP7-12结合AD引物扩增已知基因片段5端基因序列；0016 0017 0018 第一轮TAIL-PCR扩增条件为：94，1min97，5min95，30s，67，说 明 书CN 104404064 A3/5页61min，72，2min30s5cycles94，30s，30，3min，ramp to72over 3min，72，2min30。
15、s94，30s，67，1min，72，2min30s，94，30s，67，1min，72，2min30s，94，30s，44，1min，72，2min30s15cyclesstore at 12；0019 将第一轮TAIL-PCR产物稀释40倍作为第二轮TAIL-PCR模板，其扩增条件为：0020 94，1min94，30s，67，1min，72，2min30s，94，30s，67，1min，72，2min30s，94，30s，44，1min，72，2min30s12cyclesstore at 12；0021 将第二轮TAIL-PCR产物稀释40倍作为第三轮TAIL-PCR模板，其扩增条件同。
16、第二轮TAIL-PCR；0022 所有PCR产物均连接载体送至上海生物工程有限公司测序。0023 (6)全序列拼接；0024 (7)基因序列分析：克隆获得1899bp，该序列包括553bp开放阅读框上游序列、酪氨酸酶操纵子melC(包括两个编码基因melC1及melC2)，melC1大小为375bp，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码124个氨基酸，蛋白大小为12.9kDa，在32-33处含有信号肽切割位点Ala-Ala，melC2基因产物为酪氨酸酶，melC2大小为822bp，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码273个氨基酸，蛋白大小为30.8kDa。0025 (8)获得。
17、基因功能验证：设计引物melC1F、melC2F及melCR以Streptomyces kathirae SC-1基因组为模板，PCR扩增目的基因，实现pIJ86-melC2及pIJ86-melC1-C2重组质粒的构建，其中引物melC1F：CTAAAGCTTATGCCGGAACTCACCCGCCG及melCR：CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC用于扩增melC1-C2串联基因片段；引物melC2F：CTAAAGCTTATGACCGTACGCAAGAACCAG及melCR：CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC用于扩增melC2基因片段；00。
18、26 所述PCR反应条件为：95预变性5min；97变性45s,69退火30s,72延伸1.5min，反应25个循环。PCR扩增产物经过载体双酶切和阳性克隆后获得melC基因功能验证质粒pIJ86-melC2及pIJ86-melC1-C2，转化至S.lividans TK24后证明melC1基因产物为酪氨酸酶金属伴侣，其功能为激活酪氨酸酶原，帮助酪氨酸酶至细胞外，melC2基因产物为酪氨酸酶。0027 本发明的有益效果：天然的黑色素是非均质多酚类聚合体，以酪氨酸为底物，由酪氨酸酶催化后生成L-多巴、多巴铬等，而后经过一系列非酶催化的氧化反应最终生成黑色素。天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除。
19、自由基、螯合阳离子(例如有毒的重金属)、新型的药物载体、作为治疗某些与黑色素缺乏相关的神经系统疾病，例如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等，有报道指出，可溶性的黑色素在体外具有抗HIV的活性，为治疗艾滋病开辟了一个新途径。目前还没有利用S.kathirae发酵生产黑色素的相关报道，因此该菌株是一株新型的黑色素生产菌株。迄今为止，尚无S.kathirae酪氨酸酶分离纯化及基因克隆报告。0028 具体实施方法0029 实施例1：(1)将Streptomyces kathirae SC-1接种于培养基中培养(g/L:葡萄糖1，蛋白胨10,NaCl 5，CaCl20.1，pH 6.。
20、2)36h，8000g离心收集发酵液去菌丝体。0030 (2)在冰浴的条件下，向发酵液中添加硫酸铵至其饱和度为65沉淀酪氨酸酶蛋白，继续搅拌发酵液20分钟后12000g离心1h后小心弃其上清，收集蛋白沉淀，使用Buffer 说 明 书CN 104404064 A4/5页7A重悬酶蛋白。0031 (3)步骤(2)的酶蛋白溶液经透析得到蛋白样品溶液，过Q Sephrose FF离子交换层析柱，先用Buffer A洗脱至无蛋白流出，在用洗脱液Buffer B梯度洗脱，获得高纯度酪氨酸酶。0032 实施例2：使用MS鉴定并测定纯化酪氨酸酶部分氨基酸序列，根据MS获得的氨基酸序列设计引物，克隆了部分酪氨。
21、酸酶编码基因，其主要特点是：0033 上游引物其基因型为：TCCCCCTCGTTCCTGCCCTGGCACCG；0034 下游引物其基因型为：GGTGCCGCCGAGGAAGTCGGGCGCCC；0035 酪氨酸酶编码基因的PCR扩增条件为：94预变性5min；95变性45s,69退火30s,72延伸30s,反应25个循环；0036 将PCR扩增之后用0.8琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色，在在紫外灯下观测结果，胶回收后连接pMD-18T载体转化大肠杆菌E.coli JM109经过Amp平板筛选后交送上海生物工程公司进行测序。在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。0037 实施例3：实。
22、施例2获得的部分基因序列，设计引物，应用TAIL-PCR扩增已知基因片段两端序列，其主要特点是：0038 使用SP1-6结合AD引物扩增已知基因片段3端基因序列，使用SP7-12结合AD引物扩增已知基因片段5端基因序列；0039 说 明 书CN 104404064 A5/5页80040 第一轮TAIL-PCR扩增条件为：94，1min97，5min95，30s，67，1min，72，2min30s5cycles94，30s，30，3min，ramp to72over 3min，72，2min30s94，30s，67，1min，72，2min30s，94，30s，67，1min，72，2min3。
23、0s，94，30s，44，1min，72，2min30s15cyclesstore at 12；0041 将第一轮TAIL-PCR产物稀释40倍作为第二轮TAIL-PCR模板，其扩增条件为：0042 94，1min94，30s，67，1min，72，2min30s，94，30s，67，1min，72，2min30s，94，30s，44，1min，72，2min30s12cyclesstore at 12；0043 将第二轮TAIL-PCR产物稀释40倍作为第三轮TAIL-PCR模板，其扩增条件同第二轮TAIL-PCR；0044 所有PCR产物扩增之后用0.8琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色。
24、，在在紫外灯下观测结果，胶回收后连接pMD-18T载体转化大肠杆菌E.coli JM109经过Amp平板筛选后交送上海生物工程公司进行测序。在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。0045 (6)全序列拼接,在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析，采用ClustalX1.8进行多重序列匹配排列，Mega 4.0构建系统发育树；0046 (7)基因序列分析：克隆获得1899bp，该序列包括553bp开放阅读框上游序列、酪氨酸酶操纵子melC(包括两个编码基因melC1及melC2)，melC1大小为375bp，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码124个氨基酸，蛋白大小为12.9kD。
25、a，在32-33处含有信号肽切割位点Ala-Ala，melC2基因产物为酪氨酸酶，melC2大小为822bp，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码273个氨基酸，蛋白大小为30.8kDa。0047 (8)获得基因功能验证：设计引物melC1F、melC2F及melCR以Streptomyces kathirae SC-1基因组为模板，PCR扩增目的基因，实现pIJ86-melC2及pIJ86-melC1-C2重组质粒的构建，其中引物melC1F：CTAAAGCTTATGCCGGAACTCACCCGCCG及melCR：CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC用于扩增。
26、melC1-C2串联基因片段；引物melC2F：CTAAAGCTTATGACCGTACGCAAGAACCAG及melCR：CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC用于扩增melC2基因片段；0048 所述PCR反应条件为：95预变性5min；97变性45s,69退火30s,72延伸1.5min，反应25个循环。PCR扩增产物经过载体双酶切和阳性克隆后获得melC基因功能验证质粒pIJ86-melC2及pIJ86-melC1-C2，转化至S.lividans TK24后证明melC1基因产物为酪氨酸酶金属伴侣，其功能为激活酪氨酸酶原，帮助酪氨酸酶至细胞外，melC2基因产物为酪氨酸酶。说 明 书CN 104404064 A1/2页90001 0002 序 列 表CN 104404064 A2/2页10序 列 表CN 104404064 A10。