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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410230026.5(22)申请日 2014.05.28C12N 15/11(2006.01)C12N 15/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人南通大学地址 226500 江苏省南通市崇川区啬园路9号(72)发明人汪保华 李平 荣平 张咪王长彪 蔡茜茜 付蓉(74)专利代理机构北京一格知识产权代理事务所(普通合伙) 11316代理人滑春生(54) 发明名称一种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记及其制备方法(57) 摘要本发明公开了一种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记，其创新点在于：棉花抗黄萎。
2、病EST-SSR分子标记包括抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU191、抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU197和抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU235三个分子标记。利用本发明的这套EST-SSR引物对一套黄褐棉导入系进行基因型鉴定，同时调查抗黄萎病性状，结果检测到三个分子标记NTU191、NTU197、NTU235与棉花抗黄萎病性相关；本发明还可以对棉花材料进行黄萎病抗性检测，从而区分抗黄萎病和感黄萎病的两类不同棉花。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页 附图1页(10)申请公布号 CN 104404035 A(43)。
3、申请公布日 2015.03.11CN 104404035 A1/1页21.一种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记，其特征在于：所述的棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记包括抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU191、抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU197和抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU235三个分子标记。2.根据权利要求1所述的棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记引物，其特征在于：所述抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU191的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-CAGGTATTTGATGGCAGATG-3，反向引物：5-CCCTGCTTCTCAATTTCTTG-3。3.根据权利要求1所述。
4、的棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记引物，其特征在于：所述抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU197的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-TCACCATTGTCGTATTCAGC-3，反向引物：5-CGTACCCATTAATTTCCCTG-3。4.根据权利要求1所述的棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记引物，其特征在于：所述抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU235的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-TGGTTATGCAGAGTTCAACG-3，反向引物：5-CCTCCACCTATGGTTCTTTG-3。5.一种权利要求1所述的棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记引物的制备方法，其特征在于：具体包括。
5、以下步骤：（1）在拟南芥基因组中发掘抗病基因序列，调取相应拟南芥基因序列；（2）将获取的拟南芥基因序列与棉花EST库进行比对，找到对应的棉花转录组拼接序列；（3）使用MISA和primer3开发目标引物，搜索标准为SSR长度不小于18bp，引物长度为1825bp，产物大小为100500bp，TM值为5559；（4）将目标引物与已开发的棉花SSR引物序列进行比对，然后提取相关信息去除冗余，开发抗黄萎病EST-SSR引物。6.根据权利要求5所述的棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的引物长度为20bp。7.根据权利要求5所述的棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记。
6、的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的TM值为57。权 利 要 求 书CN 104404035 A1/5页3一种棉花抗黄萎病 EST-SSR 分子标记及其制备方法技术领域0001 本发明涉及一种棉花抗黄萎病分子标记，尤其涉及一种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记，本发明还涉及这种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记的制备方法，属于分子标记领域。背景技术0002 棉属(Gossypium L.)包含四个栽培种，即草棉(G.herbaceum), 亚洲棉(G.arboreum),陆地棉(G.hirsutum)和海岛棉(G. barbadense),是世界上最重要的纺织纤维的来源，而其中绝大多数棉。
7、花产量来自陆地棉栽培种。经过长期的人类选育改良，现代陆地棉栽培种具备高产优质等诸多适合人类需要的优良特性；然而，人类选择这些优良性状的同时也导致了棉花遗传多样性的丧失。有研究表明，现代陆地棉基因库已经十分有限，陆地棉品种的开发面临着严重的遗传多样性的瓶颈。遗传多样性狭窄提高了棉花基因库对生物和非生物胁迫的遗传脆弱性(genetic vulnerability)，即降低了其耐害能力。0003 棉花黄萎病(Verticillium dahliae kleb.)是棉花生长过程中最具破坏力的病害之一。随着我国80年代棉花枯萎病得到有效控制，棉花黄萎病危害显得尤为突出。自1993年以来，黄萎病危害逐年加。
8、重，发病面积占全国植棉面积的一半，每年损失皮棉7.5-10万t, 现已成为棉花高产稳产的主要障碍。防治棉花黄萎病最为经济、安全、有效的方法就是选育和种植抗病品种。目前我国高抗黄萎病的抗源材料缺乏，抗性遗传方式迄今尚有争议。棉属有45个二倍体种，5个异源四倍体种，形成一个单系群，这些野生棉提供了改良陆地棉的巨大资源。棉花育种家做了大量的尝试并取得了许多进展，例如庞朝友等收集了155份棉属种间杂交渐渗系，对主要农艺性状的鉴定结果表明，不同野生种在陆地棉优质纤维、抗病、抗逆和抗虫种质改良上发挥了不同的作用，比如，斯特提棉、蓬蓬棉具有耐黄萎病的基因资源；他们还利用分子标记高效筛选了18份优质纤维特异种。
9、质和4份耐枯黄萎病特异种质。前人研究表明，野生棉、半野生棉、海岛棉及棉属近缘植物，含有较丰富的抗黄萎病基因。利用远缘杂交将野生棉、半野生棉种系中的抗黄萎病种质转育到陆地棉中，可以创造出丰产、优质、多抗的棉花种质供育种利用。如何将这些基因转育到陆地棉，创造高抗黄萎病的抗源是抗黄萎病育种的重要内容。0004 然而，棉花抗黄萎病常规育种进展缓慢，不能满足生产的需求。棉花的许多重要性状是由多基因控制的数量性状，这些微效多基因在染色体上的位置称为数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）。数量性状表现为连续变异，其遗传研究如数量性状的基因数目、染色体位置及效应，很难从性状。
10、本身的表型分布来确定。传统的数量遗传学只能借助数理统计方法，将复杂的多基因系统作为一个整体，用平均值和方差来表示数量性状的遗传特征，但无法区别单个QTL的效应、位置及相互作用，从而限制了数量性状的遗传操作和应用。0005 随着分子生物学技术的深入发展，利用DNA分子标记构建遗传图谱并开展QTL定位有了飞跃的发展。QTL定位即通过分析整个染色体组的DNA标记和数量性状表型值的关说 明 书CN 104404035 A2/5页4系，从而将QTL逐一定位到染色体的相应位置，并估计其遗传效应。随着分子标记的不断开发，棉花的遗传图谱日益饱和，棉花的QTL定位也在不断深入发展，在QTL定位的基础上标记辅助选。
11、择（Marker-assisted Selection,MAS）随之开展，这是DNA标记最重要的运用之一，可以为育种实践提供许多便利。0006 近十余年来基因组研究迅速发展，现有的棉花SSR标记是基于基因组序列或随机的EST序列开发而来，即来自基因组中随机选择的多态性位点，在QTL定位中具有较大的随机性。近年来，越来越多的不同棉种大规模的EST测序和公开释放，包括陆地棉(G.hirsutum)，雷蒙德氏棉(G.raimondii)，亚洲棉(G.arboreum)，海岛棉(G. arbadense)，草棉(G. herbaceum)。与此同时，也开展了大量的基于EST的SSR引物开发；然而未见专。
12、门针对抗病EST的引物开发。虽然棉花的EST释放越来越多，但功能基因鉴定相对滞后。0007 因此迫切需要开发棉花抗病EST-SSR分子标记，提高分子标记辅助选择的效率，以发现更多的育种有利等位基因，并将这些有利的等位基因聚合在一起，从而实现更高效的育种。发明内容0008 本发明的目的是提供一种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记，以解决目前迫切需要开发棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记，提高分子标记辅助选择的效率，以发现更多的育种有利等位基因，并将这些有利的等位基因聚合在一起，从而实现更高效的育种。0009 本发明的另一个目的是提供这种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记的制备方法。0010 本发。
13、明采用的技术方案为：一种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记，其创新点在于：所述的棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记包括抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU191、抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU197和抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU235三个分子标记。0011 进一步的，所述抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU191的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-CAGGTATTTGATGGCAGATG-3，反向引物：5-CCCTGCTTCTCAATTTCTTG-3。0012 进一步的，所述抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU197的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-TCACCATTGTCGTA。
14、TTCAGC-3，反向引物：5-CGTACCCATTAATTTCCCTG-3。0013 进一步的，所述抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU235的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-TGGTTATGCAGAGTTCAACG-3，反向引物：5-CCTCCACCTATGGTTCTTTG-3。0014 本发明提供的这种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记制备方法，具体包括以下步骤：（1）在拟南芥基因组中发掘抗病基因序列，调取相应拟南芥基因序列；（2）将获取的拟南芥基因序列与棉花EST库进行比对，找到对应的棉花转录组拼接序列；（3）使用MISA和primer3开发目标引物，搜索标准为SSR长度不小于18b。
15、p，引物长度为1825bp，产物大小为100500bp，TM值为5559；说 明 书CN 104404035 A3/5页5（4）将目标引物与已开发的棉花SSR引物序列进行比对，然后提取相关信息，开发抗黄萎病EST-SSR引物。0015 优选的，所述步骤（3）中的引物长度为20bp。0016 优选的，所述步骤（3）中的TM值为57。0017 本发明的有益效果：利用本发明的这套EST-SSR引物对一套黄褐棉导入系进行基因型鉴定，同时调查抗黄萎病性状，结果检测到三个分子标记NTU191、NTU197、NTU235与棉花抗黄萎病性相关；本发明还可以对棉花材料进行黄萎病抗性检测，从而区分抗黄萎病和感黄萎。
16、病的两类不同棉花。附图说明0018 下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。0019 图1为分子标记NTU191、NTU197、NTU235对6份已知抗黄萎病水平材料的鉴定。具体实施方式0020 下面的实施列可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。0021 实施例1一种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记，包括抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU191、抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU197和抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU235三个分子标记；抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU191的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-CAGGTA。
17、TTTGATGGCAGATG-3，反向引物：5-CCCTGCTTCTCAATTTCTTG-3。0022 抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU197的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-TCACCATTGTCGTATTCAGC-3，反向引物：5-CGTACCCATTAATTTCCCTG-3。0023 抗黄萎病EST-SSR分子标记NTU235的引物核苷酸序列如下：正向引物：5-TGGTTATGCAGAGTTCAACG-3，反向引物：5-CCTCCACCTATGGTTCTTTG-3。0024 本实施例抗黄萎病EST-SSR分子标记的制备方法：(1)在拟南芥信息资源网站(The Arabidopsis。
18、 Information Resource, TAIR,网址为 http:/www.arabidopsis.org/)发掘抗病基因序列，调取相应序列。0025 (2)将获取的拟南芥基因序列与棉花EST库(网址为http:/www.agcol.arizona.edu/cgi-bin/pave/Cotton/index.cgi)进行比对，找到对应的棉花转录组拼接序列（contigs）。0026 (3)使用MISA (网址为http:/pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)和primer3(网址为http:/frodo.wi.mit.edu/) 开发引物，搜索标准为SSR长度不。
19、小于18bp，引物长度为1825bp，产物大小为100500bp，TM值为5559。0027 (4)利用BLAST与棉花分子标记数据库(Cotton marker database, CMD，网址为http:/www.cottonmarker.org/)的已开发的棉花SSR引物序列比对，然后提取相关信息说 明 书CN 104404035 A4/5页6以去冗余，进而开发了抗病EST-SSR引物。0028 利用这套EST-SSR引物对一套黄褐棉导入系进行基因型鉴定，同时调查抗黄萎病性状，结果检测到三个分子标记NTU191、NTU197、NTU235与棉花抗黄萎病性相关，因此可以用于区分抗黄萎病及感。
20、黄萎病棉花材料。0029 如图1所示：选取6份已知抗黄萎病水平的棉花材料（每个标记扩增的6份材料从左到右分别指感黄萎病棉花材料“苏22”，“TM-1”,“PD94042”，以及抗黄萎病棉花材料“山东小光絮”，“完紫中棉”，“雷蒙德氏棉”，通过基于本实施例的最左侧分子标记NTU191、中间部分NTU197、最右侧NTU235进行检测，可以将这6份材料抗黄萎病和感黄萎病两类棉花进行区分。0030 序列表110南通大学120一种棉花抗黄萎病EST-SSR分子标记1606210121120212DNA213棉花400caggtatttg atggcagatg210221120212DNA213棉花400ccctgcttct caatttcttg210321120212DNA213棉花400tcaccattgt cgtattcagc210421120212DNA213棉花400cgtacccatt aatttccctg210521120212DNA213棉花400tggttatgca gagttcaacg2106说 明 书CN 104404035 A5/5页721120212DNA213棉花400cctccaccta tggttctttg。说 明 书CN 104404035 A1/1页8图1说 明 书 附 图CN 104404035 A。